专利名称：一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法
技术领域：
本发明涉及一种培养细胞克隆球的方法，尤其是指一种盖玻片上生长细 胞克隆球的方法。背暈技术细胞培养是许多生物学、医学和药学研究中的基本步骤，在肿瘤细胞和 干细胞研究中，有时希望在盖玻片上生长克隆球，以方便后续研究(后续研 究例如用抗体标记细胞膜、细胞质，或者细胞核之蛋白质等)。目前细胞克隆 球培养主要在培养瓶和培养皿中进行，尚无在盖玻片上直接生长贴附的细胞 克隆球的方法。发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种盖玻片上生长细胞克隆球的方 法，其能直接在盖玻片上生长贴附的细胞克隆球。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案 一种盖玻片上生长细 胞克隆球的方法，包括如下步骤a. 将细胞在有血清培养基中常规培养；b. 采用胰酶消化步骤a培养的细胞液，制作单细胞悬液；C.将步骤b制得的单细胞悬液移入放置有盖玻片的多孔培养板，用含 血清的培养基培养；d. 培养24 48小时后，当细胞贴底后，即弃去原培养基，根据需要而 添加相应的新培养基，并每隔3 5天更换一次此种新培养基；e. 培养10 20天，在盖玻片上即生长出可明显观察到的细胞克隆球， 继续培养，直到细胞克隆球的大小达到实验需要，然后吸除培养基，清洗后 进行存贮处理或直接使用。本发明的有益效果是本发明方法简单实用，由于可直接在盖玻片上生 长贴附细胞克隆球，从而可满足相应的使用需求，例如在干细胞理论研究
领域，在盖玻片上生长细胞克隆球可直接细胞表面抗原鉴定实验；在新药开 发方面，在盖玻片上生长细胞克隆球可进行药物筛选实验。
具体实施方式
本发明提供一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法，包括如下步骤a. 将细胞在有血清培养基中常规培养；b. 采用胰酶消化步骤a培养的细胞，制作单细胞悬液；c. 将步骤b制得的单细胞悬液移入放置有盖玻片的多孔培养板，用含血 清的培养基培养；d. 培养一定时间后， 一般在培养24~48小时后，当细胞贴底后，即弃去 原培养基，添加含有生长因子及/或细胞因子的无血清培养基进行培养，并每 隔3~5天更换一次此种无血清培养基；e. 培养10~20天，在盖玻片上即生长出可明显观察到的细胞克隆球，继 续培养，直到细胞克隆球的大小达到实验需要，然后吸除培养基，清洗后即 供存贮或直接使用。上述各步骤的操作均在无菌条件下进行。 若要获得干细胞克隆球，需要用相应的干细胞培养基。 下面以一个实例来进一步对本发明方法作详细描述-实例具体培养步骤如下a. 将细胞在有血清培养基中常规培养；b. 用常规酶消化培养的细胞液，制作单细胞悬液；c. 将单细胞悬液移入事先放置有圆形盖玻片的24孔培养板，用含血清的 培养基培养，细胞初始密度为1000-10000个/ml，每孔0.3 0.5ml;d. 培养24 48小时后，当细胞贴底，细胞覆盖率达到60%以上时，即弃 去原培养基，并添加含有生长因子无血清培养基，3~5天更换一次此种无血清 培养基，在培养脑胶质瘤细胞系U251和IN1612时，添加的无血清培养基含 有的生长因子为bFGF、 EGF两种，添加量为20~25ug/ml;e. 培养约10~20天，即在盖玻片上生长出可明显观察到的细胞克隆球， 此时，可继续培养，直到细胞克隆球的大小达到实验需要，吸掉培养基， HBSS液清洗3次，即可供存贮或直接使用。当要进行存贮时，先空气干燥 10-15小时，然后即可将盖玻片(仍可放在原24孔培养板上)放入-8(TC冰箱 冻存，以供后续实验用。若直接用于实验，则在空气干燥后即可直接使用， 对于需使用活的细胞克隆球进行实验时，则不需进行干燥而直接进行后续实 验。
权利要求
1、一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法，其特征在于，包括如下步骤a.将细胞在有血清培养基中常规培养；b.采用胰酶消化步骤a培养的细胞液，制作单细胞悬液；c.将步骤b制得的单细胞悬液移入放置有盖玻片的多孔培养板，用含血清的培养基培养；d.培养24～48小时后，当细胞贴底后，即弃去原培养基，根据需要而添加相应的新培养基，并每隔3～5天更换一次此种新培养基；e.培养10～20天，在盖玻片上即生长出可明显观察到的细胞克隆球，继续培养，直到细胞克隆球的大小达到实验需要，然后吸除培养基，清洗后进行存贮处理或直接使用。
2、 如权利要求1所述的一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法，其特征在 于步骤d中所添加的新培养基为含有生长因子的无血清培养基。
3、 如权利要求2所述的一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法，其特征在 于步骤d中所添加的含有生长因子的无血清培养基中还添加有细胞因子。
4、 如权利要求1所述的一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法，其特征在 于步骤d中，当培养干细胞克隆球时，添加的新培养基为干细胞培养基。
5、 如权利要求1所述的一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法，其特征在于步骤d中，当培养肿瘤细胞时，添加的新培养基为无血清培养基。
6、 如权利要求1所述的一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法，其特征在 于步骤e中，吸除培养基后是采用HBSS液清洗3次。
7、 如权利要求2所述的一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法，其特征在 于培养脑胶质瘤细胞系U251和IN1612时，步骤d中添加的无血清培养基 含有的生长因子为bFGF、 EGF，生长因子添加量为20~25ug/ml。
8、 如权利要求1所述的一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法，其特征在 于步骤e中，清洗后，还进行空气干燥处理，干燥时间为10 15小时，干 燥后即进行存贮或直接使用。
9、 如权利要求1所述的一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法，其特征在 于各步骤的操作均在无菌条件下进行。
全文摘要
本发明涉及一种盖玻片上生长细胞克隆球的方法，包括如下步骤a.将细胞在有血清培养基中常规培养；b.采用胰酶消化步骤a培养的细胞液，制作单细胞悬液；c.将步骤b制得的单细胞悬液移入放置有盖玻片的多孔培养板，用含血清的培养基培养；d.培养24～48小时后，当细胞贴底后，即弃去原培养基，根据需要而添加相应的新培养基，并每隔3～5天更换一次此种新培养基；e.培养10～20天，在盖玻片上即生长出可明显观察到的细胞克隆球，继续培养，直到细胞克隆球的大小达到实验需要，然后吸除培养基，清洗后进行存贮处理或直接使用。本发明方法简单实用，由于可直接在盖玻片上生长贴附细胞克隆球，从而可满足相应的使用需求。
文档编号C12N5/06GK101148655SQ20071007653
公开日2008年3月26日 申请日期2007年8月22日 优先权日2007年8月22日
发明者代建国, 李世敏, 刚 金 申请人:深圳职业技术学院