专利名称：一种微生物混合发酵生产纤维素酶的方法
技术领域：
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种微生物混合发酵生产纤维素酶的方法。
背景技术：
纤维素酶是协同作用将纤维素催化水解最终产生葡萄糖的一组酶的总称，它们在工农业 许多领域有广泛的应用。如纤维素酶可将秸秆、蔗渣等工农业废弃物生物转化生成葡萄糖， 再经其它微生物进一步转化生产酒精、乳酸、申邻胞蛋白等生物化工产品；利用纤维素酶做 饲料添加剂可提高饲料的利用率；纤维素酶还可用于废纸脱墨、织物抛光等诸多方面。在植 物生物技术的研究工作中，也经常应用纤维素酶来水解细胞壁以便进行基因工程和细胞工程 等操作。所以纤维素酶被誉为打开植物宝库的金钥匙。
目前，用于生产纤维素酶的微生物菌种较多的是丝状真菌，其中酶活力较强的菌种为木 霉属、曲霉属和青霉属，特别是绿色木霉及其近缘菌株等较为典型，是目前公认的较好的纤 维素酶生产菌。 一些厌氧微生物，如瘤胃细菌和热纤梭菌等能分泌高活性的纤维素酶，但厌 氧微生物生长缓慢，酶产量很低。
一般认为纤维素酶主要包括三类酶组分内切纤维素酶(EG, EC 3.2丄4)、外切纤维素酶 (CBH， EC 3.2丄91)、 P-萄萄糖苷酶(BGL， EC 3.2丄21)。这三种组分的协同作用对彻底水解纤 维素非常重要。牛产高活性纤维素酶的关键是选育高产菌株。目前工业用纤维素酶的来源主 要是好氧丝状真菌木霉，如里氏木霉(7Wctotto"mfln^'")、绿色木霉(7V/c/20^nwflW/7'cte)、 康宁木霉(7Wc/zo6ferw" itow'"g/0等产生的，其生产应用中常见的问题主要有两个 一是现 有的生产技术产酶活力还有待提高；二是木霉生产的纤维素酶系组成不完全，往往P-萄萄糖 苷酶比较缺乏，这些都会严重影响到酶解效率。
提高纤维素酶活力以及改善酶系组成的研究现在非常活跃，提出的方法很多，其中混合 发酵就是一种较为简单有效的方法。将纤维素酶产生菌与某些其它微生物进行混菌配伍培养 可以形成某种偏利的微生态关系，促进酶的分泌；还可以发挥不同微生物互补的产酶特性， 从而使纤维素酶系组成较完全。据已有的研究和文献报道，主要是木霉与黑曲霉、海枣曲霉 的混合培养能提高P-葡萄糖苷酶活力，但对其它两种酶活力的影响不大；另外，木霉与某些 酵母菌混合培养也能少量提高纤维素酶活力。针对以上不足，本发明提出了一种新的混合发 酵方法。
发明内容
本发明要解决的主要技术问题是克服已有技术的不足，提供一种微生物混合发酵生产高 活性纤维素酶的方法。即以康宁木霉(7Wc/zocferwa tom'wg"')与米根霉(及/ /zop^ wjzae)为纤 维素酶生产菌，接种孢子液或二级种子液于固态或液态培养基中，通过控制培养基的组成、
混菌培养过程中康宁木霉与米根霉的生物量以及其它培养条件，生产高活性的纤维素酶。 为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案
本发明提供的微生物混合发酵生产纤维素酶的方法有固态发酵工艺和液态发酵工艺，其 步骤分别如下
1、 微生物混合液态发酵生产纤维素酶的工艺步骤
(1) 液体制种选择康宁木霉和米根霉为生产菌株，分别经斜面试管培养、摇瓶扩大培 养(或发酵罐再扩大培养)制备所需二级液体菌种；
(2) 先将康宁木霉的二级液体菌种，按液态发酵培养基体积的3~9%接种于液态发酵培养 基，20 35'C下通气培养24 72小时后，再接种3~9%体积的米根霉二级液体菌种，20~35°C 下继续通气培养48^96小时，将发酵培养液过滤，过滤液即为原酶液；
(3) 将上述过滤液浓縮至原来体积的2/10~3/10可制成高活性液态纤维素酶制剂，浓縮液 经喷雾干燥可制成粉状高活性纤维素酶制剂。
2、 微生物混合固态发酵生产纤维素酶的工艺步骤
(1) 液体制种选择康宁木霉和米根霉为生产菌株，分别经斜面试管培养、摇瓶扩大培 养(或发酵罐再扩大培养)制备所需二级液体菌种；
(2) 将康宁木霉和米根霉的斜面菌种制成孢子悬浮液，每毫升孢子数为107~108个，以 2~10:1的体积比例混合，按固态发酵培养基重量的6~14%接种；或将康宁木霉和米根霉的二 级液体菌种，以2 10:1的体积比例混合，按固态发酵培养基重量的6~14%接种，在25 35'C、 空气相对湿度70~90%下发酵培养72~144小时，3048小时翻曲一次，即成固体酶曲；
(3) 将发酵培养的固体酶曲按1:8~10的重量比加水浸泡1 2小时后过滤，过滤液即为纤 维素酶的提取液；
(4) 将上述过滤液浓縮至原来体积的2/10~4/10可制成高活性液态纤维素酶制剂，浓縮液 经喷雾干燥可制成粉状高活性纤维素酶制剂。
对本发明中有关斜面菌种、二级液体菌种、液(固)态发酵培养基及营养液的制备，可 在已有技术发明的基础上提供如下具体操作步骤
(1) 斜面菌种的制备
马铃薯琼脂培养基(PDA):将马铃薯洗净去皮，称取200克，切成小块，放入1000毫升 水中煮沸三十分钟，用4层纱布过滤，在滤液中加入称好的琼脂20克，然后加入20克葡萄 糖，不断搅拌至琼脂完全溶化，停止加热，补足水分至1000毫升，分装适量至试管中，塞上 棉塞，放入杀菌锅中，12rC高压蒸汽灭菌15-20分钟。分别划线接种康宁木霉菌株和米根霉 菌株，在25 35'C下培养5 8天形成大量孢子，可作为二级种了液和固态发酵时的接种。
(2) 二级液体菌种的制备培养基配方同斜面菌种，但不加琼脂，装瓶灭菌，按3 5% 体积百分比接斜面菌种的孢子液，25 35'C下120 160转/分钟摇瓶培养2~4天。
(3) 液态发酵培养基的制备稻草粉、蔗渣粉、麸皮粉、小麦秸秆粉等天然纤维素原料 或经过一定的物理、化学方法预处理的纤维素原料或纯纤维素粉中的一种或一种以上，共1~5 份，加入100份Mandels营养液，调节pH4.5~5.0，装入自动发酵罐，110 12rC高压蒸汽灭
菌15~30分钟。
(4) 固态发酵培养基的制备稻草粉、蔗渣粉、麸皮粉、小麦秸粉其中的一种或一种以
上，共2 6份，加入8 16份Mandels营养液，调节pH4.5 5.0，装入自动发酵罐，110 121°C 高压蒸汽灭菌15~30分钟。
(5) Mandels营养液的配制0.75克蛋白胨，0.25克酵母膏，0.3克尿素，1.4克(NH4) 2S04， 2.0克KH2PO4， 0.4克CaCl2'H20， 0.5毫克FeSO4*7H20， 4.0毫克ZnS04'7H20 ， 2.0 毫克CoCl2*6H20，溶于1000毫升水中。放大培养时按此比例配制。
另外，固态发酵选用孢子液接种比采用二级种子液接种效果要好，因为孢子比菌丝体在 固态培养基中分散得均匀一些。如果孢子接种量很大，可用克氏烧瓶培养。
康宁木霉与米根霉都是好氧真菌，生长发酵所需要的温度(25~35°C)和pH值(4.5~6.0) 相近，混合培养无明显拮抗作用。我们在分别培养两种微生物产酶的研究中发现康宁木霉 滤纸酶活力较高(滤纸酶活力反映纤维素酶系各组分作用纤维素产生葡萄糖的综合能力，是 目前最广泛采用的检测纤维素酶活力的指标)，卩-葡萄糖苷酶活力很低；而米根霉在一定条 件下能产生高活力的(3-葡萄糖苷酶和很少量的滤纸酶活力。在混合培养中，控制适当培养条 件，培养基中P-葡萄糖苷酶活力提高4 5倍，滤纸酶活力也有较大程度的提高，而且产酶高 峰时间也有不同程度的提前，从而可以縮短发酵时间。这种混菌发酵协同效应的详细机理尚 在研究之中。
本发明的优点在于将蔗渣、稻草等工农业废弃物作为原料，利用康宁木霉与米根霉形
成偏利的微生态关系，混合发酵生产纤维素酶，发酵工艺可以采用固态或液态发酵工艺。本 发明提供的方法对提高纤维素酶的活力、完善酶系组成以及縮短产酶时间，都具有良好的效 果。本发明操作简单易行，成本低，具有良好的应用前景。
本发明采用康宁木霉与米根霉混合固态发酵工艺，所制得的酶曲滤纸酶活力和p-萄萄糖
苷酶活力，分别比康宁木霉单菌发酵提高60~70%， 420-490%;产酶高峰吋间比康宁木霉单 菌固态发酵提前12小时左右。
本发明采用康宁木霉与米根霉混合液态发酵工艺，所制得的原酶液滤纸酶活力和p-萄萄 糖苷酶活力，分别比康宁木霉单菌发酵提高80~100%， 390-430%;产酶高峰时间比康宁木霉 单菌液态发酵提前8小时左右。
本发明在开发利用蔗渣、秸秆等天然纤维素资源的同时，无环境污染，是一条工农业废 弃物资源化、高值化、生态化利用的有效途径。
本发明提供的微生物混合发酵的方法，既可采用液态发酵工艺，也可采用固态发酵工艺， 具有就地取材、因地制宜的特点，有利于推广应用。
具体实施方法
技术领域：
本发明试验过多株产生纤维素酶的木霉与多株米根霉的混菌配伍发酵，其协同效应因不
同菌种而异，以筛选的一株康宁木霉QF-2与米根霉NRRL395HS99配伍发酵效果最佳。在 此基础上，研究了影响产酶的多种因素，获得了优化的培养条件。实验结果表明除配伍关
系外，两种微生物在培养基中生物量的比例也是影响混合发酵产酶的关键因素。由于米根霉 比康宁木霉生长速度快，很容易导致混合培养过程中米根霉优势生长，这种情况反而使培养 基中滤纸酶活力下降。因此，保持混菌体系中康宁木霉的优势生长，二者才能形成某种理想 的微生态关系。
保持康宁木霉的优势生长的方法包括控制康宁木霉与米根霉接种量在2 10:1;或者控
制康宁木霉与米根霉的接种时机，以康宁木霉先于米根霉接种培养24~72小时为宜。
至于培养基配方及培养过程的其它条件控制可以参考以下具体实施例 实施例l:斜面菌种、二级液体菌种的制备，具体操作步骤如下。
(1) 生产菌株
康宁木霉(7Wc/zoAw^tom'"g//) QF國2和米根霉(i / /zop^ W7zae) NRRL395HS99 (均由
本校微生物实验室保存)。
(2) 斜面菌种的制备
先制备马铃薯琼脂培养基(PDA)斜面，然后分别划线接种康宁木霉菌株和米根霉菌株， 在28'C下分别培养5天和7天后形成大量孢子，可作为二级种子液和固态发酵时的接种。
(3) 二级液体菌种的制备
培养基配方同斜面菌种，但不加琼脂，装瓶灭菌，按3 5%重量百分比接斜面菌种的孢 子液(每毫升孢子数为107~108个)，28t:下150转/分钟摇瓶培养3天。
实施例2:固态发酵培养基、液态发酵培养基制备
(1) 固态发酵培养基蔗渣粉3份，麸皮2份，10份Mandels营养液，调节pH4.5 5.0， 12rC灭菌25分钟。
(2) 液态发酵培养基稻草粉3份，100份Mandels营养液，调节pH4.5~5.0，装入自动 发酵罐，12rC灭菌20分钟。
实施例3:微生物混合液态发酵生产纤维素酶的工艺步骤
(1) 液体制种按照实施例1的方法制种；
(2) 先将康宁木霉的二级液体菌种，按液态发酵培养基体积的5%接种量接种于按照实施 例2方法制得的液态发酵培养基，3(TC下通气培养48小时后，再接种4%体积的米根霉二级 液体菌种，30'C下继续通气培养72小时，将培养液过滤，过滤液即为原酶液；
(3) 将上述过滤液浓縮至原来体积的3/10，浓縮液经喷雾干燥制成粉状高活性纤维素酶 制剂。
原酶液中滤纸酶活力为2.2 111/毫升，卩-葡萄糖苷酶活力为1.6IU/毫升，分别比康宁木霉 单菌发酵提高90%、 420%。产酶高峰时间比康宁木霉单菌发酵提前8小时左右。(以每分钟 产生1微摩尔葡萄糖所需要的酶量为1个酶活力国际单位IU.)
实施例4:微生物混合固态发酵生产纤维素酶的工艺步骤
(1) 液体制种按照实施例1的方法制种；
(2) 将按照实施例1方法制得的康宁木霉和米根霉的斜面菌种的孢子悬浮液，以5:1的体 积比例混合，按固态发酵培养基重量的10%接种于按照实施例2方法制得的固态发酵培养基 中，在3(TC、空气相对湿度85%下发酵培养96小时，36小时翻曲一次，即成固体酶曲；酶 曲滤纸酶活力可达35 40IU/克干曲，P-葡萄糖苷酶活力33 37IU/克干曲，分别比康宁木霉单 菌发酵提高60~70%， 420~490%;产酶高峰时间比康宁木霉单菌发酵提前12小时左右。
(3) 将发酵培养的固体酶曲按1:10的重量比加水浸泡1 2小时，过滤，过滤液为纤维素 酶的提取液；
(4) 将上述过滤液浓缩至原来体积的2/10，浓縮液经喷雾干燥制成粉状高活性纤维素酶。
权利要求
1.一种微生物混合发酵生产纤维素酶的方法，其特征在于将康宁木霉与米根霉两种微生物接种于固态或液态发酵培养基中，采用固态发酵工艺或液态发酵工艺，混合培养生产纤维素酶。通过控制两种微生物的生物量等培养条件来提高纤维素酶的活力，并改善酶系的组成。
2. 如权利要求1所述的一种微生物混合发酵生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述的固态发酵工艺的步骤是(1) 液体制种选择菌种康宁木霉和米根霉为生产菌株，分别经斜面试管培 养、摇瓶扩大培养(或发酵罐再扩大培养)制备所需二级液体菌种；(2) 将康宁木霉和米根霉的斜面菌种制成孢子悬浮液，每毫升孢子数为 107~108个，以2 10:1的体积比例混合，按固态发酵培养基重量的6~14%接种； 或将康宁木霉和米根霉的二级液体菌种，以2~10:1的体积比例混合，按固态发 酵培养基重量的6~14%接种。接种后在25 35'C、空气相对湿度70~90%下培养 72-144小时，30 48小时翻曲一次，即成固体酶曲；(3) 将固体酶曲按1:8 10的重量比加水浸泡1~4小时后过滤，过滤液即为纤 维素酶的提取液；(4) 将上述提取液浓縮至原来体积的2/10~4/10可制成高活性液态纤维素酶制 剂，浓縮液经喷雾干燥可制成粉状高活性纤维素酶制剂。
3. 如权利要求1所述的一种微生物混合发酵生产纤维素酶的方法，其特征 在于，所述的液态发酵工艺的步骤是-(1) 液体制种选择菌种康宁木霉和米根霉为生产菌株，分别经斜面试管培 养、摇瓶扩大培养(或发酵罐再扩大培养)制备所需二级液体菌种；(2) 先将康宁木霉的二级液体菌种，按液态发酵培养基体积的1~9%接种量接 种于液态发酵培养基，20 35。C下通气培养24~72小时后，再接种1~9%体积的 米根霉二级液体菌种，20 35'C下继续通气培养24 96小时，将培养液过滤，过 滤液即为原酶液；(3) 将上述原酶液浓縮至原来体积的2/10 3/10即为高活性液态纤维素酶制 剂，浓縮液经喷雾干燥可制成粉状高活性纤维素酶制剂。
4. 如权利要求2所述的一种微生物混合发酵生产纤维素酶的方法，其特征 在于，所述的固态发酵工艺中的固态发酵培养基的制备方法是稻草粉、蔗渣粉、 麸皮粉、小麦秸秆粉等天然纤维素原料或经过物理、化学方法预处理的纤维素原 料或纯纤维素粉中的一种或一种以上，与l 3倍重量Mandds营养液混合，调节 pH4.5~5.0， 110 12rC高压蒸汽灭菌20~30分钟。
5. 如权利要求3所述的一种微生物混合发酵生产纤维素酶的方法，其特征 在于，所述的液态发酵工艺中的液态发酵培养基的制备方法是稻草粉、蔗渣粉、 麸皮粉、小麦秸杆粉等天然纤维素原料或经过物理、化学方法预处理的纤维素原 料或纯纤维素粉中的一种或一种以上，共1~5份，加入100份Mandels营养液， 调节pH4.5 5.0，装入自动发酵罐，110 12rC高压蒸汽灭菌15~30分钟。
全文摘要
本发明涉及一种微生物混合发酵生产纤维素酶的方法。本发明以康宁木霉(Trichoderma koningii)与米根霉(Rhizopus oryzae)为纤维素酶生产菌，接种孢子液或二级种子液于固态或液态培养基中，通过控制培养基的组成、混菌培养过程中康宁木霉与米根霉的生物量以及其它培养条件，可使滤纸酶活力、β-葡萄糖苷酶活力比康宁木霉单菌发酵分别提高60％～100％、400％～500％，并明显缩短发酵时间。本发明并通过控制两种微生物的接种量或接种时机，使之形成偏利的微生态关系，从而有利于纤维素酶的分泌并改善酶系的组成。本发明操作简单易行，成本低，具有良好的应用前景。
文档编号C12N1/14GK101100660SQ20071007496
公开日2008年1月9日 申请日期2007年6月14日 优先权日2007年6月14日
发明者吴清林, 王尚武, 韵 邓, 邹水洋 申请人:东莞理工学院