专利名称：利用静息细胞制备蛹虫草生产种的方法
技术领域：
本发明涉及生物菌种制备领域，具体涉及一种利用静息细胞制备蛹虫 草生产种的方法， 技术背景蛹虫草(Cordyc印s militaris)又名北冬虫夏草、北虫草、虫草，隶 属真菌门、子囊菌亚门、麦角菌目、麦角菌科、虫草属，是虫草属的模式 种，为自然界特有的一类具有神奇药用与滋补功能的珍贵药用真菌。目前 全世界巳知的虫草类有350余种，我国已正式发表的有拉丁学名的虫草共 68种。我国人民很早就对虫草有深刻的认识和研究，认为虫草具有保肺益 精、补精填髓、止血化痰、可治百虚百损，《本草从新》中就有"冬虫夏 草甘平保肺，益肾，补精髓，止血化痰，已劳咳，治膈症皆良"的记载。 中医认为，虫草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，是唯一的一种能 同时平衡、调节阴阳的中药。现代医学研究进一步表明虫草对人体有以下 功能能平喘止咳，对肺气肿、气管炎有较好疗效；具有壮阳补肾、增强 体力、精力、提高大脑记忆力的功效；能明显降低血糖、尿糖，对糖尿病 患者有明显疗效；降低血压、颅压，缓解高血压、脑血栓、冠心病、手足 麻木等病症；抗菌、抗炎、抗癌、抑癌、能明显增强机体免疫功能；润肤 美容，尤其可快速消除"蝴蝶"斑。其独特的抗菌、抗病毒、抗癌以及提
高机体免疫力等能力方面是其他食品所不能比拟的。由于野生冬虫夏草生长地理的特殊要求以及严格的寄生性，造成冬虫 夏草资源极其稀少，加之采收的不易更使得野生冬虫夏草资源十分缺乏， 因而导致野生冬虫夏草价格昂贵，难于普及，且由于野生冬虫夏草的大量 采挖，已严重破坏了自然植被资源，为了保护生态环境和野生动植物资源， 世界许多国家都在努力研究和开发虫草的人工培育，我国更是如此，国家 已把野生冬虫夏草列为国家二级保护植物，明令限制采挖，大力提倡和发 展虫草的人工培育。目前已知的虫草类中，在现有的相关科研工作未获突破性进展的情况 下，蛹虫草是虫草属中唯一可驯培的。通过分析测试表明，人工栽培的蛹 虫草子实体和野生冬虫夏草的各种化学成份和含量基本相同，有些有效成份含量高于野生冬虫夏草。人工蛹虫草子实体蛋白质含量高达40.7%,比 野生冬虫夏草高15倍；含有虫草酸、虫草素、虫草多糖、超氧化物歧化 酶(S0D)以及亚油酸和软脂酸，其中虫草素的含量比野生冬虫夏草高3-5 倍，亚油酸和软脂酸则高40%以上；氨基酸种类齐全，含量丰富，比例适 当；含有21种微量元素，锰、铜、磷、钙、铁、锌、硒等的含量非常丰 虽。在现有公开的蛹虫草培育技术中，对蛹虫草生产种的制备都是采用试 管斜面种转接，区别只是在试管斜面种的母代或是组织分离得来，或是孢子分离得来。在实践中，我们发现这种生产种制备方式存在以下缺陷1、 同一母代得到的不同试管斜面种之间性状表现有差异，有好有坏，参差不 齐，难以把握；2、同一试管斜面种的不同部位制备的生产种之间的性状
表现也存在差异。这将导致子实体的产量和质量不稳定。 发明内容本发明的目的是提供一种利用静息细胞制备蛹虫草生产种的方法，以 解决斜面试管种转接制备生产种的缺陷，确保子实体的产量和质量。 本发明所提出的利用静息细胞制备蛹虫草生产种的方法，包括A、 分离得到菌株；B、 配制I^培养基，将分离得到的菌株于Mi培养基中培养，控制温 度，适度振荡，掌握培养时间；C、 配制M2培养基，无菌条件下抽滤收集菌丝，菌丝经无菌蒸馏水清 洗，置M2培养基中悬浮备用；D、 将M2培养基及菌丝接入灭菌后的MJ咅养基中培养适当时间，控 制温度，适度振荡，即得到生产种。所述分离得到菌株的方法可以采用孢子分离，或母代分离，或组织分离。所述Mt培养基的配方为蒸馏水0.8 1.2升，马铃薯190 210克，葡 萄糖13 17克，磷酸二氢钾0.8 1. 2克，硫酸镁0.4 0.6克，蛋白胨2.1 2.3克，PH值6.1 6.3，并且至少在12rC湿热条件下灭菌至少30分钟。所述M2培养基之配方为蒸馏水0.8 1. 2升，磷酸二氢钾0.8 1. 2克， 硫酸镁0.4 0.6克，放线菌酮18 22毫克，PHf直6.1 6.3，并且至少在 12rC湿热条件下灭菌至少30分钟。本发明利用静息细胞制备蛹虫草生产种的方法之B中，菌株于Mi培 养基中培养的温度控制在18 22'C为宜。本发明利用静息细胞制备蛹虫草生产种的方法之B中，菌株于M,培 养基中培养时，置于振荡频率为100 120转An巾的摇床上。本发明利用静息细胞制备蛹虫草生产种的方法之B中，菌株于Mj咅 养基中培养的时间控制在140 150小时。所述C中，无菌条件下抽滤收集的菌丝经无菌蒸馏水清洗不得少于三 次，确保清洗干净。所述D中，按容积1% 2%的比例将M2培养基及菌丝接入灭菌后的 M,培养基中培养，即该M2培养基及菌丝是该M,培养基容积的1% 2%。所述D中，将M2培养基及菌丝接入灭菌后的M,培养基中培养的时间 为140 150小时，摇床的振荡频率为100 120转/分钟，培养的温度控制在 18 22。C为宜。本发明利用静息细胞制备蛹虫草生产种的方法制得的蛹虫草生产种， 其性状表现基本无差异，得到的子实体的产量和质量非常稳定。
具体实施方式
下面结合实施例介绍本发明具体实施方式
。按上述配方配制MJ吝养基；从上述分离方法中选择孢子分离得到蛹虫草菌株； '将得到的蛹虫草菌株接入灭菌后的装有200毫升培养基的500毫升三 角瓶中；于20°C、振荡频率为110转/赠的摇床上培养144小时；按上述配方配制M2培养基；无菌条件下抽滤收集菌丝，菌丝经无菌蒸馏水清洗3次； 将清洗后的菌丝置于灭菌后的装有400毫升M2培养基的500毫升三角瓶 中悬浮；将3毫升M2培养基及菌丝接入灭菌后的装有200毫升M,培养基的500 毫升三角瓶中；于20°C、振荡频率为110转/分钟的摇床上培养144小时后即得到生产种。
权利要求
1、利用静息细胞制备蛹虫草生产种的方法，其特征在于，包括A、分离得到菌株；B、配制M1培养基，将分离得到的菌株于M1培养基中培养，控制温度，适度振荡，掌握培养时间；C、配制M2培养基，无菌条件下抽滤收集菌丝，菌丝经无菌蒸馏水清洗，置M2培养基中悬浮备用；D、将M2培养基及菌丝接入灭菌后的M1培养基中培养适当时间，控制温度，适度振荡，即得到生产种。
2、根据权力要求l所述的利用静息细胞制备蛹虫草生产种的方法，其 特征在于所述分离得到菌株的方法可以采用孢子分离，或母代分离，或组织分离。
3、 根据权力要求1所述的利用静息细胞制备蛹虫草生产种的方法， 其特征在于所述Mi培养基的配方为蒸馏水0.8 1.2升，马铃薯l90 210克，葡萄糖13 17克，磷酸二氢钾0.8 1.2克，硫酸镁0.4 0.6克， 蛋白胨2.1 2.3克，PH值6.1 6.3，并且至少在12rC湿热条件下灭菌至 少30分钟。
4、 根据权力要求1所述的利用静息细胞制备蛹虫草生产种的方法， 其特征在于所述M2培养基之配方为蒸馏水0.8 1. 2升，磷酸二氢钾0.8 1.2克，硫酸镁0.4 0.6克，放线菌酮18 22毫克，PH值6.1 6.3，并 且至少在12rC湿热条件下灭菌至少30分钟。
5、 根据权力要求1所述的利用静息细胞制备蛹虫草生产种的方法， 其特征在于本方法之B中，菌株于Mi培养基中培养的温度控制在18 22"C为宜。
6、 根据权力要求1所述的利用静息细胞制备蛹虫草生产种的方法， 其特征在于本方法之B中，菌株于M^咅养基中培养时，置于振荡频率 为100 120转/分钟的摇床上。
7、 根据权力要求1所述的利用静息细胞制备蛹虫草生产种的方法， 其特征在于本方法之B中，菌株于MJ咅养基中培养的时间控制在140 150小时。
8、 根据权力要求1所述的利用静息细胞制备蛹虫草生产种的方法， 其特征在于所述C中，无菌条件下抽滤收集的菌丝经无菌蒸馏水清洗不 得少于三次，确保清洗干净。
9、 根据权力要求1所述的利用静息细胞制备蛹虫草生产种的方法， 其特征在于所述D中，按容积1% 2%的比例将]^12培养基及菌丝接入 灭菌后的Mr培养基中培养，即该M2培养基及菌丝是该Mi培养基容积的 1% 2%。
10、根据权力要求1所述的利用静息细胞制备蛹虫草生产种的方法，其特征在于所述D中，将M2培养基及菌丝接入灭菌后的Mi培养基中培养的时间为140 150小时，摇床的振荡频率为100 120转/，，温度控制 在18 22。C为宜。
全文摘要
利用静息细胞制备蛹虫草生产种的方法，涉及生物菌种制备领域。公开报道的对蛹虫草生产种的制备都是采用试管斜面种转接，区别只是在试管斜面种的母代或是组织分离得来，或是孢子分离得来。本发明的方法包括A.分离得到菌株；B.配制M<sub>1</sub>培养基，将分离得到的菌株于M<sub>1</sub>培养基中培养，控制温度，适度振荡，掌握培养时间；C.配制M<sub>2</sub>培养基，无菌条件下抽滤收集菌丝，菌丝经无菌蒸馏水清洗，置M<sub>2</sub>培养基中悬浮备用；D.将M<sub>2</sub>培养基及菌丝接入灭菌后的M<sub>1</sub>培养基中培养适当时间，即得到生产种。本发明利用静息细胞制备蛹虫草生产种的方法制得的蛹虫草生产种，其性状表现基本无差异，得到的子实体的产量和质量非常稳定。
文档编号C12N1/14GK101126072SQ200710075869
公开日2008年2月20日 申请日期2007年7月11日 优先权日2007年7月11日
发明者喻孟君, 郑贵朝 申请人:东莞市生物技术研究所