专利名称：神经生长因子基因定位改造动物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过转基因方法获得的动物及其制备方法和应用。具体地，本发明涉及利用胚胎千细胞(ES)培养技术和同源重组技术将目的基因定位整合到小鼠基因组中，从而获得稳定表达目的基因的转基因动物。该方法得到的动物可以应用于基础研究和获得目的蛋白。更具体地本发明涉及使用神经生长因子基因定位改造小鼠及其制备人源性神经生长因子及其突变体蛋白质的方法和应用。
背景技术：
神经生长因子(Nerve Growth Factor, NGF)是最早被发现和被证实的细 胞生长调节因子，也是研究得最清楚的神经营养因子[HoJL,HeS，HuA等 人，JExpMed, 1995 ，181 (4) :1493 - 1505.]。 NGF在神经系统的神经干细胞 的增殖、分裂转化和神经元的发育、轴突的生长、递质的合成及细胞的凋亡 等阶段均起着重要作用[Sayada C ， Denamur E, Elion J等人，Gene ， 1992 ， 120 (1) :129- 130.]。其促进胚胎和发育中交感、感觉神经元的分化和成熟，还参 与维持成年交感神经元的正常功能和营养支持成年感觉神经元[Zhang D ， Yang X， Berry J，等人，J In2fect Dis ，1997 ， 176 (4) :1035 - 1040.]。中枢神经 系统的基底前脑胆碱能神经元和紋状体的胆碱能中间神经元的发育、分化也 受到NGF的调节[Pal S , Barnhart KM， Wei Q，等人Vaccine， 1999， 17 (5) :459 -465.]。由于NGF生物功能的重要性，表明它具有重要的临床应用价值。人NGF 是由a、 p和Y3种肽链以ci2P2Y2的形式，通过非共价键结合而成的。进一步发 现其中P亚单位具有神经生长因子完全的生物学功能，它是由2个118氨基酸 通过非共价键结合而成的二聚体，每个单体内有3组二硫键，3个二硫键的正 确形成对蛋白的折叠起重要作用，进而影响到0 -NGF的生物学活性 (Cys58-Cysl聰，Cys68-Cys110, Cysl5-Cys80 )。由于人NGF在体内含量甚微， 而且受人体材料来源的限制，使人P-NGF不可能大规模生产。许多人曾尝试 用基因工程的方法生产人P-NGF，但由于p-NGF在细菌、酵母的表达系统中不能正确进展和修饰以及二聚体化，以至于得到的表逸产物缺少活性(De Bemardez Clark E， Schwarz E， Rudolph, R等人，1999;309:217-36. Ikemura H, Takagi H， Inouye M，等人，J Biol Chem. 1987 Jun 5;262(16):7859-64. Nishizawa M， Ozawa F， Higashizaki T，等人，Appl Microbiol Biotechnol. 1993 Feb;38(5):624-30.)。利用哺乳动物细胞表达人P -NGF在理论上存在较大的优 势，但表达量较低，难以规模化(C ANTHONY ALTAR, Louis E. BURTONt， GREGORY L。 Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 88, pp. 281-285， January 1991)。 而且可能其生物学活性并不等同于从人体中提取得到的NGF。例如，美国的 Genentech公司开发的重组人NGF三期临床结果并不理想。所以虽然重组人 NGF已经在多种生物中(细菌、酵母、CHO细胞昆虫和细胞)被表达，并且 被作为用于治疗的药物已经研究了很长时间，但都还没有作为药品被批准使 用。由于众多人类基因在小鼠中有同源性并且小鼠繁殖期短、个体较小易于 养殖，因此，小鼠是研究哺乳动物和人类基因功能的模式生物。过去的许多 年已经通过对小鼠进行基因突变处理获得了许多种表达外源蛋白质的小鼠。 NGF的生物学作用以及NGF与其受体的相互作用的研究一直是神经和发育生 物学研究的热点。Crowley利用基因敲除技术将小鼠的NGF基因破坏，观察对 神经发育的影响(Crowley C, Spencer SD， Nishimura MC，等人Cell. 1994 Mar 25;76(6):1001-11.)。实验证实感觉和交感神经元对NGF有严格的依赖性，其 它神经营养因子不能弥补NGF对这些神经元的作用。另外Smeyne等敲除了 NGF的细胞高亲合力受体TrkA ，以考察TrkA在神经发育中的作用(Smeyne RJ, Klein R， Schnapp A， et al .Nature. 1994 Mar 17;368(6468): 193-4.)。但NGF和 TrkA整体基因敲除后的小鼠在胚胎发育中死亡或出生后生命力低下，这可能 是由于NGF或其受体在发育过程中存在重要的作用，所以这种基因敲除小鼠 对研究NGF与其受体的特异作用方面存在局限性。因此，如何对小鼠的NGF 基因进行改造以稳定表达小鼠NGF蛋白质的突变体蛋白是本领域仍未解决的 问题。成年雄性小鼠颌下腺内NGF的含量很高，而且由于小鼠繁殖快，便于飼 养，所以小鼠可以成为提取和纯化NGF的良好来源。目前上市的P-NGF就是从小鼠颌下腺中提取得到的。但与鼠源性的NGF相比，人NGF在啮齿类动物 和变态反应性脑脊髓炎及帕金森氏病的实验模型中都有更好的治疗效果；而 且人源神经生长因子相比鼠源NGF具有更小的免疫原性，在人体内更具有稳 定性和安全性。80年代末以来，在基因打靶技术的基础上发展起来的基因敲 入(knock-in)技术，为我们生产人NGF提供了新的途径。通过同源重组技 术以及小鼠ES细胞培养技术将人的NGF基因替换了小鼠的NGF基因，从这种 转基因小鼠的颌下腺中可以提取到大量的成熟人3 -NGF蛋白，可用于研究和 规模化生产。但这一转基因方法的用途并不局限于此。例如，NGF的生物学作用以及 NGF与其受体的相互作用的研究一直是神经和发育生物学研究的热点。 Crowley利用基因敲除技术将小鼠的NGF基因破坏，观察对神经发育的影响 (Crowley C， Spencer SD， Nishimura MC， et al . Cell. 1994 Mar 25;76(6):1001-11.)。实验证实感觉和交感神经元对NGF有严格的依赖性，其 它神经营养因子不能弥补NGF对这些神经元的作用。另外Smeyne等敲除了 NGF的细胞高亲合力受体TrkA ，以考察TrkA在神经发育中的作用(Smeyne RJ， Klein R， Schnapp A, et al .Nature. 1994 Mar 17;368(6468): 193-4.)。但NGF 和TrkA整体基因敲除后的小鼠在胚胎发育中死亡或出生后生命力低下，这可 能是由于NGF或其受体在发育过程中存在重要的作用，所以这种基因敲除小 鼠对研究NGF与其受体的特异作用方面存在局限性。体外突变得到的NGF突 变体为研究NGF与其受体的作用提供了良好的基础。例如利用只与TrkA结合 而不与其低亲合力受体P75结合的突变体NGF可以考察P75的作用，使研究更 有目的性、针对性和特异性(Horton A， Laramee Q Wyatt S，等人，Mol Cell Neurosci. 1997; 10(3-4): 162-72. Ryden M， Hempstead B， Ibanez CF，等人，J Biol Chem. 1997 Jun 27;272(26): 16322-8 )。我们利用基因敲入技术将突变的 NGF构建入了小鼠中，得到了NGF突变体小鼠。为在整体动物水平上研究NGF 突变体及其受体功能研究开辟了新的道路。同时也为在体内筛选和纯化高活 性和安全性的NGF突变体开辟了 一条新的途径。 发明内容根据本发明的一个目标是提供一种转基因动物，其中该动物基因组中的6NGF-P碁因被改造，进而该动物表达该种动物NGF-P的突变体蛋白质。在本发明中所使用的术语"动物"是指其基因组包含NGF-P基因的动物， 例如但不限于啮齿类、猪、猫、人、鸡、蛇、蛙、鱼等，其中优选嗜齿类动 物例如小鼠、大鼠等，最优选小鼠。在本发明中所使用的术语"该种动物NGF-P的突变体蛋白质"是指具有 NGF-p蛋白质活性的突变体蛋白质，具有至少70%的同源性，优选至少80% 的同源性，更优选至少90%的同源性蛋白质，例如可以是具有人NGF-p蛋白 质的氨基酸序列的蛋白质。在本发明中，M酸序列的同源性，通常可通过已知的软件或电脑程序 如BestFit或Gap配对比较程序进行确定。在本发明中，转基因动物的基因组中至少一条染色体上的NGF-I3基因被 目的基因或其突变体基因所替换。优选的是，转基因动物的基因组中全部的 NGF-p基因被外源目的基因或其突变体基因所替换。本发明进一步的目标是提供一种制备转基因啮齿类动物的方法，其特征 在于通过同源重组技术使所述动物基因组中的NGF-(3基因被改变，从而表达 该种动物NGF-P基因的突变体蛋白质。根据本发明的一个方面，提供了一种制备转基因啮齿类动物的方法，其 包括以下步骤1) 构建打靶栽体，其中所述栽体含有目的NGF-P基因或突变的NGF-卩基因；2) 使用步骤l)中所构建的打靶载体转染胚胎千细胞； 3 )制备供体囊胚；4) 将步骤2)中获得的经过转染的胚胎干细胞显微注射入步骤3)中所 获得的供体嚢胚中；5) 将步骤4)中所获得的供体囊胚转移到受体动物的子宫中；以及6) 获得转基因动物。在构建打靶栽体中，同源臂的长度对打靶效率影响很大，原则上同源臂 越长，发生同源重組的几率就越大，所以大多数载体同源臂的长度在5 8Kb 之间。同源臂和正负选择标记的相对位置决定了只有通过同源重组打靶成功7的克隆才能通过药物培养基被筛选出来。但为了进一步确定是否打把成功，通常采用PCR的方法进行验证，设计引物时采用的原则是 一个引物同正选 择标记基因序列退火，另 一个引物同打靶栽体外侧相临的基因组序列退火。 由于PCR扩增的效率取决于两个引物之间的距离，所以通常情况下，两侧的 同源臂长度是不对称的。有长短臂之分，以便于PCR进行检测。同时长臂要 足够长，保证有足够的同源序列形成染色体交换复合体。为了增加同源重组 的几率，并避免过长而造成实验操作上的困难以及后续检测中的复杂性，优 选短臂的长度为l 10Kb，其中优选2Kb。优选长臂的长度为l 10Kb，其中优 选3 8Kb,最优选5Kb。对于载体的选择，正如本领域中所熟知的，载体是能够或者辅助将实体 从一种环境转入其它环境的工具。某些在重组DNA技术中所使用的载体能够 使例如DNA片断(例如异源DNA片断例如异源cDNA片断)被转入寄主内和/ 或靶细胞内，以达到复制该含有本发明中所使用的和/或表达本发明所使用蛋 白质的核苦酸序列的载体的目的。在重组DNA4支术中所^使用的载体的例子包 括但不限于质粒、染色体、人工染色体或病毒。在本发明中所使用的栽体包 括但不限于pLoxPneo、 pPNT等质粒载体。本发明还涉及使用根据本发明所制备的转基因啮齿类动物生产该动物 NGF-P突变体蛋白质的方法，其包括以下步骤1) 培养根据本发明所获得的转基因动物；2) 从经过培养的动物组织中提取具有神经生长因子活性的目标蛋白。 对于所述的提取目标蛋白的动物组织没有特别的限定，例如包括但不限于颌下腺。在本发明中所生产的该种动物NGF-P的突变体蛋白质'，是指具有NGF-p 蛋白质活性的突变体蛋白质，与该种动物NGF-P蛋白质的氨基酸序列具有至 少70%的同源性，优选至少80%的同源性，更优选至少90%的同源性蛋白质， 例如可以是具有人NGF-P蛋白质的氨基酸序列的蛋白质。进一步，本发明还提供了通过本发明所提供的制备NGF- 0蛋白质突变体 的方法所制备的小鼠NGF- P蛋白质的突变体。其中在本发明中小鼠NGF- 0 蛋白质的蛋白质的氨基酸序列具有至少70%的同源性，优选至少80%的同源性，更优 选至少90%的同源性蛋白质，例如可以是具有人NGF-P蛋白质的g酸序列 的蛋白质。所制备的NGF-p蛋白质可以被制成药学上可以接受的药物组合物。在本 发明中，药物组合物是一种含有药学有效量的药学活性药物或由药学有效量 的药学活性药物组成的组合物。其优选含有药学上可以接受的栽体、稀释剂 或赋形剂(包括其组合)。用于治疗应用的可以接受的栽体或稀释剂是药物领 域中熟知的。对药物栽体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据所期望的给药路 线和标准的药物实践而选择。所述药物组合物可以包括(或另外)赋形剂或 稀释剂、任何适当的粘结剂、润滑剂、悬浮剂、包被剂、溶剂。药学上可以 接受的栽体的例子包括例如水、盐溶液、乙醇、硅树脂、蜡、凡士林油、植 物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、凝胶、乳糖、淀粉糖、硬脂酸镁、 云母、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、香精油、脂肪酸单甘油酯和二甘油脂、 石油烃脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
图lA是pLoxPneo载体质粒的结构示意图，图1B是打靶栽体pm-hNGF 的结构示意图，图1C是的打靶栽体pm-hNGF的构建过程示意图；图2A是打靶栽体pm-mNGF的结构示意图，图2B是打靶栽体pm-mNGF 的构建过程示意图；图3是人NGF成熟肽基因定位整合小鼠胚胎干细胞的鉴定的Southern 印迹结果示意图；图4是人NGF成熟肽基因定位整合小鼠胚胎干细胞的鉴定的PCR结果 示意图；图5是P-NGF突变体基因定位整合小鼠胚胎千细胞的鉴定的Southern 印迹结果示意图；图6是人& -NGF基因定位整合小鼠的PCR鉴定基因型结果示意图； 图7是人P-NGF成熟肽基因定位整合小鼠的鉴定的Southern杂交鉴定 结果示意图；图8是P-NGF突变体基因定位整合小鼠的鉴定的Southern印迹鉴定结果示意图；图9是利用SDS-PAGE鉴定所提取蛋白质分子量大小结果示意图； 图10是利用等电聚焦电泳测定所提取蛋白的等电点结果示意图； 图ll是所提取人神经生长因子的比活测定的结果示意图； 图12是所提取突变NGF的受体结合实验结果示意图。 实施例实施例l人NGF成熟肽基因打靶栽体的构建。1) 合成下列引物片段PI ￡bo RI CGGAATTCgtccctagctcacttcattcaaggaP2 ggaagatgggatgggaggatgagcgcttgctccggtgagtP3 actcaccggagcaagcgctcatcctcccatcccatcttccacaggggcgaP4 gggctgcaggcaagtcaggctcttctcacagccttP5 aaggctgtgagaagagcctgacttgcctgcagcccccttccccacctP6 5g/11 ACCAGATCTgccatgacaggcctcaggagaP7 M CGGAATTCGTCGACggtttcatgttaagattgcctttgctcP8扁CGGAATTCGCGGCCGCtcctggaaccaggagtcagagggaatggat2) 上游长臂构建以小鼠基因组DNA(ling)为摸板，用引物P1+P2各100ng, Pfb高保真酶 2.5单位，dNTP 250拜ol/L， 2.5mmol/L MgC12， 25mmol/L TrisHCl(pH8.3)进 行PCR反应(94。C30秒，55。C30秒，72。C4分，使用Perkin Elmer 9700型 PCR仪，共30循环),PCR产物经P/。琼脂糖电泳后用Qiagen Gel Extraction Kit (购自QIAGEN)纯化，获得4.4kb DNA片断；以引物P3+P4各lOOng为 引物，以人基因组DNA(lpg)为模板进行PCR扩增(条件同上，但72。C延 伸时间45秒)，获得扩增0.37kbDNA片断，并同样电泳分离纯化；以小鼠 基因组DNA为模板，P5+P6各100ng为引物同上条件进行PCR扩增，获得 0.65kbDNA片断，并同样进行分离纯化工；将上述3片段各取100ng，混合后 为模板，以引物Pl+P6各100ng进行PCR扩增(条件同上，72°C延伸时间 5分)，获得5.4kbDNA片段，并通过同上方法电泳分离純化。3) 下游短臂构建以小鼠基因組DNA为模板(lng)， 51物P7+P8各100呢进行PCR扩增(条 件同上，72。C延伸2分)，获得2kbDNA片段，并同上通过琼脂糖电泳分 离并纯化。4)打靶载体的构建pLoxPneo栽体质粒(图1A)用5coRI+i^"I(Biolabs,下同)酶切，通过1% 琼脂糖电泳后，用QiagenGdExtractionKit纯化；上游长臂DNA片段用五co RI+^p"I消化，琼脂糖电泳后回收2.06kbDNA片段并同上纯化(中间片段)， 将该片段与上述载体连接后转化大肠杆菌DH5a，挑取正确的克隆。将经序列 分析正确的质粒用ATp"I+j5awHI酶切，回收后用做克隆载体，上游长臂片段 用尺pwI+^g/II酶切，回收3.4kbDNA片段，插入上述构建栽体，转化大肠杆菌 DH5a,挑选正确的克隆。将正确的质粒用屈oI+M rt酶切，经电泳后回收作为 克隆栽体，将下游短臂用Sa/I+MwI消化，电泳回收后克隆至上迷栽体，获得 打靶栽体pm-hNGF (图1B)，构建过程如图1C所示。构建的质粒通过核^ 列分析证实正确后用于基因打靶。 实施例2: p-NGF基因突变体打靶载体的构建本实施例是在小鼠0 -NGF成熟肽基因基础上改变了三个氨基酸位点。1) 合成引物p2，、 P3'、 P4，和P5，P2， 5'ggaagactgggtgggtggatgagcgcttgctccggtgagt 3， P3' 5，actcacc路agcaagcgctcatecacccacccagtcttccacatggggg 3' P4， 5，gggctgcaggcaagtcagcctcttettgtagcctt 3' P5， 5，aaggctacaagaagaggctgacttgcctgcagcccccttccccacct 3，2) NGF突变体的获得合成以引物P3，+P4，各100ng为引物，以鼠基因组DNA(lpg)为摸板PfU 高保真酶2.5单位，dNTP 250pmol/L， 2.5mmol/L MgC12， 25mmol/L TrisHCl(pH8.3)进行PCR^应(94。C 30秒，55。C30秒，72。C45秒，使用Perkin Elmer 9700型PCR仪，共30循环)，PCR产物经l。/o琼脂糖电泳后用Qiagen Gel Extraction Kit(购自QIAGEN )純化，获得0.37kb DNA片段。以获得0.37kb DNA 片段为模板，利用stratogen公司的点突变试剂盒将NGF成熟肽的第32位Lys、 34位Lys、 35位Glu突变成Aia，获得突变体基因片段。具体方法参考stratagen公司的点突变试剂盒说明书。3)上游长臂构建 以小鼠基因组DNA(1吗)为模板，用引物P1+P2，各100ng， Pfti高保真酶2.5 单位，dNTP 250拜ol/L, 2.5mmol/L MgC12， 25mmol/L TrisHCl(pH8.3)进行 PCR^应(94。C30秒，55。C30秒，72。C4分，使用Perkin Elmer 9700型PCR仪， 共30循环)，PCR产物经l。/。琼脂糖电泳后用Qiagen Gel Extraction Kit (购自 QIAGEN)纯化，获得4.4kbDNA片断；以小鼠基因组DNA为模板，P5，+P6 各100ng为引物同上条件进行PCR扩增，获得0.65kbDNA片断，并同样进行 分离純化；将上述两片段与2)中的NGF突变体片段共三片段各取100ng,混合 后为模板，以引物Pl+P6各100ng进行PCR扩增(条件同上，72。C延伸时间5 分)，获得5.4kbDNA片段，并通过同上方法电泳分离純化。4) 下游短臂构建同实施例l5) 打靶载体的构建pLoxPneo栽体质粒用五co RI+K戸I(Biolabs，下同)酶切后纯化；上游长臂 DNA片段用五coRI+ii:/wI消化，回收2.06kbDNA片段，将该片段与上述栽体 连接后转化大肠杆菌DH5a，挑取正确的克隆。将经序列分析正确的质粒用 /QwRSawHI酶切，回收后用做克隆载体，上游长臂片段用/^wI+丑g/II酶切， 回收3.4kbDNA片段，插入上述构建栽体，转化大肠杆菌DH5a，挑选正确的克 隆。将正确的质粒用屈oI+iVort酶切，经电泳后回收作为克隆载体，将下游短 臂用Sa/I+iVort消化，电泳回收后克隆至上述栽体，获得打靶栽体pm-mNGF (图2A)，构建过程如图2B所示。构建的质粒通过核酸序列分析证实正确后 用于基因打靶。实施例3人NGF成熟肽基因定位整合小鼠胚胎干细胞的获得. 1)滋养层细胞的培养和处理解冻小鼠原代成纤维细胞至2个100mm平皿中，于滋养层细胞培养液 (DMEM, 15°/oFBS， 0.1mM(3-巯基乙醇，0.1mmol/L青-链霉素，O.lmmol/LL-谷氨酰胺，O.lmM非必需氨基酸)、37°C、 5%C02培养3天后，用胰蛋白酶 消化处理并转移到6个150mm組织培养孤培养，3天后，再转移到々0个150mm 组织培朱脏中培养3~4天，直到细胞铺满孤底。用终浓度为l(Hig/ml的丝裂審素C处理成纤维细胞，37X:培养2 3h。将含丝裂霉素C处理过的，已失去有 丝分裂活性的成纤维细胞冻存，制备为成滋养层细胞。2) 电穿孔法转染ES细胞滋养层细胞形成后，接种129/ter小鼠胚胎干细胞，培养基为在滋养层细 胞培养液中添加1000U/mlLIF。转染前用lml0.25。/。的胰酶处理，然后加入 3.5mlES细胞培养基洗涤后悬浮于PBS之中。质粒pm-hNGF 50吗，用NotI酶 切使重组载体线性化，与lml上述ES上述细胞悬液混合，用基因脉沖仪 (Biomd),600V，25pF电击转染，室温l分后加入7mlES细胞培养基，加入4个已 长满滋养层细胞的培养皿，生长24h后加G418至280ng/ml， gancyclovir 2pmol/L，继续培养7天(每天换培养基)，然后挑取克隆。3) 人NGF成熟肽基因定位整合小鼠胚胎干细胞的鉴定(1) Southern印迹:提取ES细胞和G418/FIAU双抗性克隆的基因组DNA,然 后用EcoRI消化，用打靶栽体5，端的探针a进行Southern印迹。野生型应该在 10kb处有一阳性条带。而因为在人NGF成熟肽基因中有一EcoRI位点，所以 在同源重组后的ES细胞中在5kb处还会有 一条阳性带，如图3(2) PCR鉴定引物l (5'gctcatcctcccatcccatcttccaca3，)位于于成熟肽基 因5，端，引物2 ( 5'gaacgagatcagcagcctctgttcca 3，)位于Neo基因上。利用引物l 和引物2扩增，在野生型胚胎干细胞中不会扩增出条带，而在同源重组后的干 细胞中扩增出1200bP的扩增条带(图4) ， PCR产物通过五coRI进行酶切鉴定。 并通过DNA序列分析证实'J 、鼠NGF基因组DNA上的成熟肽基因已被人基因 所替换。实施例4P-NGF突变体基因定位整合小鼠胚胎干细胞的获得。1) P-NGF突变体基因定位整合小鼠胚胎干细胞的获得方法同实施例32) P -NGF突变体基因定位整合小鼠胚胎干细胞的鉴定(1) Southem印迹提取ES细胞和G418/FIAU双抗性克隆的基因组DNA， 然后用&wHI消化，用下游同源臂5，端的探针b进行Southe加印迹。野生型应该 在800bp处有一阳性条带。而在同源重组后的ES细胞中由于两个BamHI位点 之间插入了neo基因，所以阳性条带增至了2.7kb左右(图5)。(2) PCR鉴定设计NGF成熟肽5，端引物1 (5，gctcatccacccacc cagtcttccaca 3，)和Neo基因上的引物2 ( 5'gaacgagatcagcagcctctgttcca 3，)。在野生型胚胎 千细胞中不会扩增出条带，将在同源重组后的干细胞中扩增出1200bP的扩增 条带，PCR产物通过DNA序列分析证实小鼠NGF基因组DNA上的成熟肽基因 已被突变的基因所替换。实施例5人NGF成熟肽基因定位整合小鼠的获得1 ) 供体嚢胚的制备取4-6周C57BL/6J不动情雌鼠，腹腔注射5单位孕马血清促性腺激素 (Pregnant mare serum gonadotropin)，48h^腹腔注射5单位人绒毛膜促性腺激 素，并将雌鼠转移至有种雄鼠的笼中与雄鼠交配。48h后检查小鼠，有阴栓者 分笼饲养。交配第四天后，引颈处死供体雌鼠，解剖找到子宫，用剪刀将左 右两侧子宫在输卵管与子宫角的衔接处剪下，然后小心剪下子宫的联体部分， 置于无菌的60mm培养皿中。再用剪刀在子宫头与子宫尾分别剪去输卵管和 子宫角部分，使得两根单独的子宫是畅通的。用一次性注射器吸足量的 Brinster，s BMOC-3(GIBCO BRL)培养液套上5号针头，在视体解剖镜下插入子 宫腔，推动注射针栓沖洗子宫腔，小鼠胚胎将迅速沉降至培养孤底部。取一 个35mm的培养亚，滴上数滴培养液，再盖上矿物油。在浮见体镜下用冲卵管 收集胚胎并转移至培养液滴中，放于37'C、 5。/。C02培养箱中培养2小时。2) 囊胚显微注射注射用ES细胞应在数天前解冻，注射当天早晨换上新鲜的ES细胞培养 液，1 2小时后胰酶处理，作成单细胞悬液保存在Brinster，sBMOC-3培养液 中。从35mm培养亚中挑选约10个形态饱满、边界清晰、囊胚腔较大的囊胚 转移到安装好持卵管和注射针的注射槽内。在10倍镜下用注射针吸取10~15 枚小而圆的ES细胞，在40倍镜下用吸卵管吸附嚢胚的一侧，将注射针调整至 对准囊胚的中心并使它们处于同一水平面。转动注射针的操纵杆，使注射针 快速刺破嚢胚的壁，进入嚢胚腔，推动注射泵使ES细胞顺序进入嚢胚腔，小 心拔出注射针。按照囊胚情况和受体鼠数量决定囊胚注射的个数。注射后的 囊胚置Brinster，s BMOC-3培养液液滴里培养。3) 胚胎的子宫移植受体鼠为昆明白假孕鼠，是经过与结扎输精管的雄鼠交配后的雌鼠。用酒精消毒受体鼠背部，在右側靠近第一腰锥的部位做一个lcm左右橫向切口 。 向两侧拉展直至可透过腹膜看见右侧卵巢及其脂肪垫。在腹膜上用尖镊撕开 一个3mm的小口。左手夹住脂肪垫向外拉出，子宫随之可见。用小号止血钳 夹住少许脂肪垫稍作固定。将移卵管接上一个口控管，在体视解剖镜下依次 小心吸入培养液、气泡、培养液、气泡、注射后的嚢胚、气泡、少量培养液。 左手持尖镊夹住在子宫和输卵管接口处附近2mm远的子宫壁，右手持一个4 号注射器针头和移卵管。在解剖镜下，针头在紧挨尖镊处避开血管扎一个小 孔，将移卵管的前端小心插入小孔中。将胚胎緩慢吹入子宫中。子宫和肠系 膜送回腹腔，封闭切口。(见基因打靶技术，pl33.杨晓等，科学出版社)。 4) 转基因小鼠的获得如果移植手术成功，17天后可有幼鼠出生，数天后可从毛色上判断是否 获得高嵌合度的嵌合体小鼠。选择嵌合度高的嵌合体小鼠与C57BL/6J交配， 在子代中可获得纯棕色的转基因杂合子小鼠。将这些杂合子小鼠交配可筛选 出纯合子转基因小鼠。实施例6 P-NGF突变体基因定位整合小鼠的获得。具体方法同实施例5。 实施例7人NGF成熟肽基因定位整合小鼠的鉴定1) 鼠基因组DNA的制备剪15天小鼠尾巴尖约0.5cm放入Eppendorf管中。每管加入鼠尾裂解緩沖 (0.5%SDS，0.1MNaCl， 0.05MEDTA, 0.01M Tris-Cl pH8.0，蛋白酶K， 200ug/ml) 400ul。然后50。C保温过夜。每管加入200ul饱和的NaCl (6M), 剧烈震荡混匀，然后置于冰上10min。室温14000rpm离心10min，将上清转移 到干净的Eppendorf管中，每管加入0.8ml乙醇，混匀。14000rpm离心5min, 弃上清，室温干燥后将DNA重悬于50 100ulTE中。2) PCR鉴定小鼠的基因型引物l (5， acaggactcaccggagcaagcgctcat 3，)位于于成熟肽基因5，端，引物 2 (5，gaacgagatcagcagcctctgttcca3，)位于Neo基因上。引物3 (5 ，gaactcccagtgtggataagtaga3 ，)位于成熟肽基因下游非编码区，引物4(5'aatagtagagaagcagccatcagagca 3，)位于下游同源臂5，端。以提取的小鼠基 因组DNA(lng)为摸板，用引物l+引物2各100ng，Pfo高保真酶2.5单位，dNTP 250nmol/L， 2,5mmol/L MgC12， 25mmol/L TrisHCl(pH8.3)进行PCR^应(94。C 30秒，55。C30秒，72。Cl分钟，使用Perkin Elmer 9700型PCR仪，共30循环)， PCR产物经l。/o琼脂糖电泳，在野生型C57BL/6J小鼠中没有特异性扩增条带出 现；在杂合子和纯合子转基因小鼠中将有1200bP的扩增条带。扩增条带经分 离纯化后用于测序，以确定为人NGF成熟肽基因。以引物3+引物4各100ng 为引物，进行PCR扩增(条件同上，但72。C延伸时间2分钟)，PCR产物经 1%琼脂糖电泳，野生型C57BL/6J将出现190bp的条带；杂合子转基因小鼠也 会出现一条l卯bp条带，但在2000bp处还会出现一条扩增带；纯合子转基因小 鼠只在2000bp出现一条扩增带(图6)。3)纯合子小鼠的NGF成熟肽基因序列测定剪纯合子小鼠尾巴尖约0.5cm放入Eppendorf管中。每管加入鼠尾裂解緩 冲(0.50/oSDS，0.1MNaCl，0.05MEDTA，0.01MTris-ClpH8.0，蛋白酶K， 200ug/ml) 400ul。然后50。C保温过夜。每管加入200ul饱和的NaCl (6M)， 剧烈震荡混匀，然后置于冰上10min。室温14000rpm离心10min，将上清转移 到干净的Eppendorf管中，每管加入0.8ml乙醇，混匀。14000rpm离心5min， 弃上清，室温干燥后将DNA重悬于50 100ulTE中。设计成熟肽基因上游引物 (5，AATCCCTTTCAACAGGACTCACCGGAGCAA3，)和NGF成熟肽下游引 物(5'AAGGGGGCTGCAGGCAAGTCAGCCTCTTC 3，)。以提取的小鼠基 因组DNA(1吗)为摸板，PfU高保真酶进行PCRA应(94。C30秒，55。C30秒， 72。Cl分钟，使用Perkin Elmer 9700型PCR仪,共30循环)，PCR产物经l。/。琼脂 糖电泳后纯化，TA克隆后测序。测序结果表明成熟肽基因为人p-NGF成熟 肽基因。序列如下TCATCATCCCATCCCATCTTCCACAGGGGCGAATTCTCGGTGTGTGAGGGCAAGGAGGTGATGGTGTTGGGAGAGGTGAACATTAACAACAGTTTGACAGCGGGTGCCGGGGCATTGACTCAAAGCACTGGAACTCATATT GTACCACGACTCACACCTTTGTCAAGGCGCTGACCATGGATGGCAAGC AGGCTGCCTGGCGGTTTATCCGGATAGATACGGCCTGTGTGTGTGTGCT CAGCAGGAAGGCTGTGAGAAGAGCCTGA 4)Southern杂交筌定提取鼠尾基因组DNA后用EcoRI消化。用打靶栽体5 ，端的探针aii行 Southem印迹，野生型C57BL/6J应该在10kb处有一阳性条带。而因为在人NGF 成熟肽基因中有一EcoRI位点，所以在杂合子子代小鼠中在5kb处还会有一条 阳性带。在纯合子转基因小鼠中只有5kb处阳性条带(图7)。实施例8 P-NGF突变体基因定位整合小鼠的鉴定1) PCR鉴定和结果同实施例72) 纯合子小鼠的NGF成熟肽基因序列测定剪纯合子小鼠尾巴尖约0.5cm放入Eppendorf管中。每管加入鼠尾裂解緩 沖(0.5%SDS，0.1MNaCl，0.05MEDTA，0.01MTris-ClpH8.0，蛋白酶K， 200ug/ml) 400ul。然后50。C保温过夜。每管加入200ul饱和的NaCl (6M), 剧烈震荡混匀，然后置于冰上10min。室温14000rpm离心10min，将上清转移 到干净的Eppendorf管中，每管加入0.8ml乙醇，混匀。14000rpm离心5min， 弃上清，室温干燥后将DNA重悬于50 100ulTE中。设计成熟肽基因上游引物 (5'AATCCCTTTCAACAGGACTCACCGGAGCAA3，)和NGF成熟肽下游引 物(5，AAGGGGGCTGCAGGCAAGTCAGCCTCTTC3，)。以提取的小鼠基 因组DNA(1吗)为摸板，Pfii高保真酶进行PCR^应(94。C30秒，55。C30秒， 72。Cl分钟，使用PerkinElmer9700型PCR仪，共30循环)，PCR产物经l。/o琼脂 糖电泳后纯化，TA克隆后测序。测序结果表明成熟肽基因为小鼠e-NGF突 变体成熟肽基因。序列如下TCATCCACCCACCCAGTCTTCCACATGGGGGAGTTCTCAGTGTGTGAC AGTGTCAGTGTGTGGGTTGGAGATAAGACCACAGCCACAGACATCGCCGGCGCGGCTGT GACAGTGCTGGCCGAGGTGAACATTAACAACAGTGTATTCAGACAGTACTTTTTTGAGACC AAGTGCCGAGCCTCCAATCCTGTTGAGAGTGGGTGCCGGGGCATCGACTCCAAACACTGG AACTCATACTGCACCACGACTCACACCTTCGTCAAGGCGTTGACAACAGATGAGAAGCA GGCTGCCTGGAGGTTCATCCGGATAGACACAGCCTGTGTGTGTGTGCTCAGCAGGAAGGCTACAAGAAGAGGCTGA3) Southern印迹鉴定提取鼠尾基因组DNA后用5awffl消化。用下游同源臂5，端的探针b进行 Southem印迹，野生型C57BL/6J应该在800bp处有一阳性条带。而在P-NGF 突变基因同源重组后，由于两个丑a附ffl位点之间插入了neo基因，所以杂合 子小鼠在2.7kb左右还会有一条阳性条带。纯合子转基因小鼠中只有2.7kb处 阳性条带(图8)。实施例9人NGF成熟肽基因定位整合的小鼠颌下腺中神经生长因子的提取 1)提取方法健康雄性小鼠，体重30 40g,在一级实验室内，颈推脱臼处死后， 立即摘取颌下腺。按l: 2 5(g:ml)加入纯化水，用高速组织粉碎机充分 匀浆，匀浆液再用冷纯化水稀释2 3倍后12000rpm离心1小时，取离 心上清液在0.02M pH6.8 PB中充分透析。CM-S印harose FF层析柱用 0.02MpH6.8PB充分平衡后上样。上样后用平衡液冲洗，收集蛋白流出 峰。蛋白流出液置0.25mM pH6.8 PB中透析24h,其间换透析液2 ~ 3次。 透析后液加1M乙酸緩冲液(pH4.0)迅速降低pH至4.0，然后加NaCl 使成0.4M，静置约5min后10000g离心30min，取上清。CM-Sepharose FF层析柱用pH4.0 、 0.05M乙酸液(含0.4MNaCl)充分平衡后上样， 上样后用平衡液冲洗到基线后再用pH9.0, 0.05MTris緩沖液洗脱杂峰至 基线后，在该液下用0~0.4M NaCl梯度洗脱，收集目标蛋白峰。然后目标蛋白经凝胶过滤层析，Superdex G75 prep grade层析柱用0.05M pH9.0 (含0.15M NaCl)充分平衡后上样，收集目标蛋白峰。经凝胶过 滤层析纯化的蛋白用孔径20nm除病毒膜包过滤除病毒，收集滤过液。2)电泳鉴定提取的蛋白利用SDS-PAGE鉴定其分子量大小(鉴 定结果见图9)。同时做等电聚焦电泳以测定蛋白的等电点(鉴定结果见 图10)。实施例10 P-NGF突变基因定位整合小鼠颌下腺中神经生长因子的提取方法同实施例9， SDS-PAGE电泳结果见图9实施例11人神经生长因子的比活测定以进一步鉴定实施例9所提取蛋白质采用鸡胚背根神经节培养法测定培养瓶底部涂鼠尾胶，干燥，用含 10%FCS DMEM培养液洗涤2次后加3ml DMEM培养液平衡过夜，临用倒 弃培养液。取8日龄鸡胚背根神经节(DRG)，接种于涂有鼠尾胶原的培养 瓶中，每瓶接种3-5个神经节。置二氧化碳培养箱内，5%C02, 37"C培养2 小时后，加入用DMEM培养液按3倍梯度稀释的NGF待测样品。结果判断 标准无突起生长判为"-"，少量突起判为"+ ",突起较长较密据其程度判 为"++" "+++"，突起最长最密为"++++"，过量抑制以"#，，表示。以生长最长 最密时每毫升中待测样品的含量作为一个活性单位。测活结果见图11。(图9 说明图ll重組人NGF诱导鸡胚背根神经节分化l:27ng/mlNGF;2:9ng/ml NGF; 3: 3ng/mlNGF; 4: lng/mlNGF; 5: 0.33ng/mlNGF; 6:阴性对照， DRG培养在DMEM培养基中)。实施例12突变体NGF的生物学特性鉴定及其活性测定 1)突变NGF的受体结合实验将野生型小鼠NGF和突变的NGF用1251标记。然后分别加入表达TrkA的细 胞和表达P75的A875人黑肿瘤细胞中。配体和受体复合物用 JV-hydroxysuccinimi(iyl-4-azidobenzoate进行化学铰链，裂解细胞，铰链后的复 合物在4匸免疫沉淀过夜，SDS电泳后放射自显影。结果显示突变的NGF和野 生型的NGF都能够与高亲合力受体TrkA结合，而突变后的NGF不能与P75结合。图12 (说明1 TrkA-WtNGF复合物放射自显影2 TricA-MutantNGF复合 物放射自显影3 P75-WtNGF复合物放射自显影4 P75 Mutant NGF复合物放 射自显影)2)突变NGF比活性测定采用鸡胚背根神经节培养法测定培养瓶底部涂鼠尾胶，千燥，用含 10%FCS DMEM培养液洗涤2次后，加3ml DMEM培养液平衡过夜，临用倒 弃培养液。取8日龄鸡胚背根神经节(DRG)，接种于涂有鼠尾胶原的培养 瓶中，每瓶接种3-5个神经节。结果判断标准无突起生长判为"-，，，少量 突起判为"+ "，突起较长较密据其程度判为"++"~"+++",突起最长最密为 "++++",过量抑制以"#"表示。结果发现在高浓度的情况下突变NGF和野生 型NGF对促进神经节生长的能力相当(27ng/ml、 9ng/ml、)。而在低浓度下 (3ng/ml 、 lng/ml、 0.3ng/ml)促进神经节生长的能力明显减弱。测定方法同实施例11实施例13人神经生长因子制剂配方1)人神经生长因子冻干制剂神经生长因子半成品用Lowry法测定含量，将蛋白液用无热原25mM、 pH6.8的PB(含0.05%人血白蛋白、5%甘露醇)稀释至所需体积，经0.22拜 滤膜过滤后，无菌分装后冷冻、千燥，轧盖，4'C保存。 2)人神经生长因子水针剂神经生长因子半成品用Lowry法测定含量，将蛋白液用无热原25mM、 pH6.8的PB(含0.05%人血白蛋白)#释至所需体积，经0.22拜滤膜过滤后， 无菌分装后轧盖，-20°(:保存。3)神经生长因子滴眼液神经生长因子半成品用Lowry法测定含量，将蛋白液用无热原20mM、 pH6.8的PB(^f浓度均为3.33mg/ml甘氨酸、丙氨酸和精氨酸及0.5%NaCl) 稀释至所需体积，经0.22pm滤膜过滤后，无菌分装后轧盖，-20°(:保存。 实施例14突变神经生长因子制剂配方方法同实施例13根据上述，显然可对本发明作大量的改变。因此，在所附的权利要求范 围内，除了上述具体描述的方法外，可用其它方法实施本发明。SEQUENCE LISTING<110>北京三诺佳邑<120>神经生长因子基因定位改造动物及其制备方法和应用 <130> OICN073024 <160> 26<170> Patentln vision 3.3<210> 1<211> 33<212> DNA <213>人工序列<400> 1cggaa加gt ccctagctca cttcattc助鹏 3 3<210> 2<211> 40<212> DNA <213>人工序列<400> 2ggaaga鹏at鹏agpt鹏cgcttgctcc鹏agt 40<210> 3<211> 50<212> DNA <213>人工序列<400> 3actcaccgga gc鄉cgctc atectcccat cccatc加c acag^gcga 50<210> 4<211> 35<212> DNA <213>人工序列<400> 421gggctgcagg caagtc^gc tcttctcaca gcctt 3 5<210> 5<211> 47<212> DNA <213>人工序列<400> 5aaggctgtga gaagagcctg acttgcclgc agcccccttc cccacct 47<210> 6<211> 30<212> DNA <213>人工序列<400> 6accagatctg ccatgacagg cctcaggaga 30<210> 7<211> 41<212> DNA <213>人工序列<400> 7cggaattcgt cgacggtttc atgtte^at tgcctttgct c 41<210> 8<211> 46<212> DNA <213>人工序列<400> 8cggaattcgc ggccgctcct ggaaccagga gtcag^gga atggat 46<210> 9<211> 40<212> DNA <213>人工序列<400> 9ggaagactgg gtgggtggat gagcgcttgc tccggagt 40<210> 10<211> 49<212> DNA <213>人工序列<400> 10actcaccgga gcaagcgctc atccacccac ccagtcttcc acatggggg 49<210> 11<211> 35<212> DNA <213>人工序列<400> 11gggctgcagg caagtcagcc tcttcttgta gcctt35<210> 12<211> 47<212> DNA <213>人工序列<400> 12aaggctacaa gaagaggctg acttgcctgc agcccccttc cccacct 47<210> 13<211> 27<212> DNA <213>人工序列<400> 13gctcatcctc ccatcccatc ttccaca 27<210> 14<211> 26<212> DNA <213>人工序列<400> 143g咖gagatc agcagcctct gttcca<210> 15<211> 27<212> DNA <213>人工序列<400> 15gctcatccac ccacccagtc ttccaca<210> 16<211> 26<212> DNA <213>人工序列<400> 16gaacgagatc agcagcctet gttcca<210> 17<211> 27<212> DNA <213>人工序列<400> 17acaggactca ccggagcaag cgcteat<210> 18<211> 26<212> DNA <213>人工序列<400> 18gaacgagatc agcagcctet gttcca<210> 19<211> 24<212> DNA <213>人工序列gaactcccag tgtggat鄉啤a 24<210> 20<211> 27<212> DNA <213>人工序列<400> 20aatagtagag aagcagcoat c呢agca 27<210> 21<211> 30<212> DNA <213>人工序列<400> 21aatccctttc aacaggactc accggagcaa 30<210> 22<211> 29<212> DNA <213>人工序列<400> 22旭gggggctg caggcaagtc agcctcttc 29<210> 23<211> 363<212> DNA <213>测序结果<400> 23tcatcatccc atcccatctt ccacaggggc gaattctcgg tgtgtgacag tgtcagcgtg 60tgggttgggg ataagaccac cgccacagac atcaa^gca aggaggtgat ggtgttggga 120gaggtgaaca ttaacaacag tgtattcaaa cagtactttt ttgagaccaa gtgccgggac 180ccaaatcccg ttgacag鄉gtgixggggc attgactc助agcact^aa ctcatattgt 240accacgactc acacctttgt caa^cgctg accatg^^ gcaagcaggc tgcctggcgg 3 00tttatccgga tagatacggc ctgtgtgtgt gtgctcagca ggaaggctgt gagaagagcc tga<210> 24<211> 30<212> DNA <213>人工序列360 363<400> 24aatccctttc aacaggacte accggagcaa<210> 25<211> 29<212> DNA <213>人工序列<400> 25aagggggctg c鄉caagtc agcctcttc<210> 26<211> 363<212> DNA <213>测序结果<400> 26tcatccaccc acccagtctt ccacatgggg gagttctcag tgtgtgacag tgtcagtgtg tgggttggag ataagaccm;鄉cacagac atcgccggcg cggctgtgac agtgctggcc gaggtgaaca ttaacaacag tgtattcaga cagtactttt ttgagaccaa gtgccgagcc tccaatcctg ttgagagtgg gtgccggggc atcgactcca aacactggaa ctcatactgc accacgactc acaccttcgt caaggcgttg acaacagatg agaagcaggc tgcctggagg ttcatcc銘a tagacacagc ctgtgtgtgt ggctcagca ggaaggctac aagaagaggc tga302960120180240300 360 36权利要求
1. 一种转基因啮齿类动物，其特征在于所述动物基因组中的NGF-β基因被改变，所述动物表达该动物NGF-β的突变体蛋白质。
2. 根据权利要求1所述的转基因啮齿类动物，其特征在于所述动物表达 人源NGF-p蛋白或其突变体蛋白质。
3. 根無权利要求1或2所述的转基因啮齿类动物，其特征在于所述动物 的基因組中至少一条染色体上的NGF-p基因被该动物NGF-p基因的突变体所 替换。
4. 根据权利要求1或2所述的转基因啮齿类动物，其特征在于所述动物 的基因组中的全部NGF-p基因都被该动物NGF-P基因的突变体所替换。
5. 根据权利要求1 4中任一项所述的转基因啮齿类动物，其特征在于所 述的啮齿类动物为小鼠。
6. —种获得权利要求1~5中任一项所述的转基因动物的方法，其特征在 于通过同源重組技术使所述动物的NGF-p基因被改变，进而使该动物表达该 动物NGF-p的突变体蛋白质。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述动物表达人源NGF-(3蛋白质或其突变体蛋白质。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于包括以下步骤1) 构建打靶栽体，其中所述栽体含有外源NGF-(3基因或突变的NGF-卩基因；2) 使用步骤l)中所构建的打靶载体转染胚胎千细胞； 3 )制备餘沐囊胚；4) 将步骤2)中获得的经过转染的胚胎干细胞显微注射入步骤3)中所获 得的供体囊胚中；5) 将步骤4)中所获得的供体囊胚转移到受体动物的子宫中；以及6) 获得转基因动物。
9. 一种制备啮齿类动物NGF-jJ的突变体蛋白质的方法，其特征在于包括以 下步骤1) 培养4,权利要求1 5中任一项所述的啮齿类动物； 2) 从步骤1)中所培养的动物的组织中提取目标蛋白。
10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述啮齿类动物为小鼠。
11. 根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于所迷的组织为颌下腺。
12. 根据权利要求9 11中任一项所述的方法，其特征在于所提取的目标蛋 白是人源NGF-p蛋白质或其突变体蛋白质。
13. 通过权利要求9 12中任一项所述的方法所制备的蛋白质。
14. 根据权利要求13所述的蛋白质，其特征在于所述蛋白质被制成药学上 可以接受的制剂。
15. 根据权利要求13所述的蛋白质，其特征在于所述蛋白质被制成注射剂 或滴眼液的形式。
全文摘要
本发明涉及通过转基因方法获得的动物及其制备方法和应用。具体地，本发明涉及利用胚胎干细胞(ES)培养技术和同源重组技术将目的基因定位整合到小鼠基因组中，从而获得稳定表达目的基因的转基因动物。该方法得到的动物可以应用于基础研究和获得目的蛋白。更具体地本发明涉及使用神经生长因子基因定位改造小鼠及其制备人源性神经生长因子及其突变体蛋白质的方法和应用。
文档编号C12N15/85GK101260398SQ20071008601
公开日2008年9月10日 申请日期2007年3月7日 优先权日2007年3月7日
发明者冯宇霞, 周志文, 张洪山, 陈红波 申请人:舒泰神(北京)药业有限公司