专利名称：蛇足石杉(Huperzia Serrata (Thunb.)Trev)的一种内生真菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及徼生物技术领域，特别是涉及一种其发酵产物 含石杉碱甲的微生物。肚+战器忟不R京随着社会人口的老龄化，老年性痴呆症发病率相对上升，据统计，当今世界有5000多万老年人患有不同程度的老年性 痴呆症。我国60岁以上人口预计道2010年将占总人口的 15.7%，痴呆症问题同样是我们所面临的不可回避的问题。因 此寻找治疗老年性痴呆病的有效药物已受到各国的高度重 视，成为当务之急。近年来，国内外学者在应用天然药物有 效成分治疗老年痴呆病方面做了大量基础研究和临床应用研 究工作由于脑中胆碱能系统受到了损害，导致突触部位乙酰 胆碱含量的下降，从而对病人的学习、记忆能力产生影响。 因此，针对提高老年性痴呆病人脑中的乙酰胆碱含量，促进 胆碱能神经功能的药物应运而生。石杉碱甲(huperzirie A) 为我国首创的可逆性强效乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂.是近 年来从石杉属植物蛇足石杉(^// e2^j'a 6"erra" f 77 "/^. J 7>e"中分离得到的一种新的生物碱对老年性痴呆症，单纯 记忆障碍以及重症肌无力症治疗有显著疗效，且药效持续时 间长，无严重不良反应，是国内外上述病症最有效的药物， 深受关注，在国际上已被列为第二代胆碱酯酶的抑制剂之一。但石杉碱甲生产还是依赖于从蛇足石杉植株中提取。其缺 点是l.石杉碱甲含量很低。2.生产周期长。3.生产效率低。4.人工栽培困难。5.蛇足石杉植株生长缓慢。6.破坏野生 资源及生态环境。7.生产成本高。现在虽有关于蛇足石杉细 胞培养及化学合成来生产石杉碱甲的报道，但存在大规模植 物细胞细胞培养难度高，生长缓慢，成本髙，产量低等缺点-， 而石杉碱甲结构复杂，化学合成反应步骤多、污染大、条件 苛刻、产率极低、毒副作用大、成本高，而无法商业化生产。 石杉碱甲用微生物发酵方式获得尚未见任何形式的报道。 发明内容本发明的目的是提供一种其发酵物具有药用功能的木霉菌。本发明所述的霉菌命名为木霉属，木霉菌(7^ic力ofl^r历a M.)，编号DOl。保藏在国家知识产权局指定保藏单位，保藏 编号为CGMCC No. 1905本发明所述的木霉菌D01系 (i7〃pem'a 5"ei"rata (^77 m6. j 到的。现保藏在国家知识产权局指 位名称中国微生物菌种保藏管理 保藏编号为CGMCC No. 1905本发明所述菌株的固体培养特征1. PDA培养基28。C培养4天，菌落直径30咖，7天蔓延整从石杉科植物蛇足石杉 7>6k)植物活体中分离得 定保藏单位保藏，保藏单 委员会普通微生物中心，个培养皿。菌丝白色，平长茸状，生长紧密，边缘不齐，背 面淡黄色。2.麦芽汁培养基28。C培养4天，菌落直径30咖，7天蔓 延整个培养皿。菌丝白色，生长紧密，边缘不齐，背面淡黄色。本发明所述木霉菌D01液体发酵培养；1. 培养基PDA。摇床培养时间5-7天。培养温度28°C ±2°C 。2. 发酵培养特征培养第一天，菌种有零星的白色菌丝点； 培养第二天长满白色菌丝；培养第5-7天发酵液中长满白 色菌丝体。3. 木霉菌D01液体发酵5-7天后，对发酵液进行化学提取、 分离可得到胆碱酯酶抑制剂一石杉碱甲。本发明所述的木霉菌D01液体发酵提取工艺为菌种一种子 培养一发酵培养一发酵物提取一分离化合物一石杉碱甲。 上述步骤中，发酵原料为马铃薯培养基(PDA)。 上述的------液态发酵工艺中，发酵条件参数如下(1) 发酵方式液态发酵。(2) 菌种斜面试管斜面菌种培养采用马铃薯葡萄糖固体培 养基(固体PDA)。(3) 种子培养种子培养为马铃薯葡萄糖液体培养基(液体 PDA)。马铃薯葡萄糖培养基(PDA)制备取新鲜马铃薯200克，去皮切成小块，加水1升煮沸30分钟，过滤弃去马铃薯，滤液 加水补至1升，加入葡萄糖20克，pH值自然。上述马铃薯葡萄糖培养基中加入琼脂15克，即为固体 PM培养基。(4) 发酵培养发酵的培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基(液 体PDA)， pH值自然。(5) 培养时间种子摇床培养时间48-72小时，发酵培养时 间5-7天。(6) 培养温度种子摇床培养温度28°C ±2°C ，发酵培养温度 为28°C ±2°C 。(7) 发酵物提取发酵完毕，过滤，收集菌体和发酵液。发 酵液用有机酸浸提、萃取、反萃取、脱色和重结晶等技术分 离得到石杉碱甲。本发明所述的木霉菌D01是从蛇足石杉活体植物中分离得到的，能够人工发酵产生与寄主植物相同化合物的一株丝 状真菌。蛇足石杉主要药用成分之一为石杉碱甲，具有可逆 性抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)的作用，在国际上已被列为第二 代胆碱酯酶的抑制剂之一。本发明是通过蛇足石杉内生真菌 的纯培养，以马铃薯培养基(PDA)为原料，采用现代微生物 发酵技术，结合化学手段，寻找具有老年性痴呆病药用成分 另一类生物资源提供一种新途径。 本发明实施例在无菌条件下，用接种针挑取少许菌种到已灭好菌的种子液体PDA培养基中，在28。C 士2。C下摇床培养72-96小时，即 为种子菌。发酵采用1000亳升玻璃三角瓶，装入配制好的液体PDA培 养基400毫升，12lr灭菌30分钟后，取出待冷却至约3(TC， 在无菌条件下，取种子菌，接种于装有400毫升液体PDA培养 基的三角瓶中，接种量为4-8% (V/V)，置于28。C 士2。C摇床培 养5-7天。发酵期间，注意检查有无染菌现象。发酵完毕，酸调发酵液至pH值1-3， 10-12小时后过滤收 集滤液，浓縮至原体积的五分之一，调pH值至9-10，氯仿反 复萃取三次，集氯仿液，浓縮氯仿液经反萃取、脱色、结晶 重结晶等技术手段分离得到石杉碱甲。产品鉴定(l)分离所得产品的溶液在200 nm至400 nm 光谱扫描，在231 nm与313 nm的波长处有最大吸收。(2)分离所得产品的溶液与石杉碱甲对照品溶液分别点于同一硅 胶GF254薄层板上(厚度0. 20 0. 25 mm， 10X10 cm，用甲 醇预展两次，其间干燥10分钟)以环己垸-丙酮-乙醇-浓氨 溶液(2 : 3 : 0. 1 : 0. 3)为展开剂，直立式展开至10cm，晾 干，先置紫外光灯(254 nm)下检视，再喷以0.3%高锰酸钾 水溶液，于4 5分钟内检视，与对照品相同的位置显示相似 斑点。木霉菌D01的18S rDNA序列表
附图为木霉菌D01的电镜显微照片(X 1000倍)。
权利要求
1. 一种从石杉科植物蛇足石杉植物活体中分离得到的木霉菌Trichoderma D01，其特征在于，该菌为于2006年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的木霉菌Trichoderma D01.，其保藏号为CGMCC No.1905。
2、根据权利要求l所述的木霉菌，其特征在于，该霉菌的18S rDNA序列为
3、 根据权利要求l所述的木霉菌Trichoderma D01.的工业用 途，其特征在于可以发酵产生石杉碱甲或者其它石杉碱类化合物。
4、 根据权利要求1所述的木霉菌Trichoderma D01,其特征 在于所述的木霉菌TrichodermaD01游激沐i,孝錄,..PDA 培养基28。C培养4天，菌落直径30咖，7天蔓延整个培养皿， 菌丝白色，长茸状，生长紧密，边缘不齐，背面淡黄色。
全文摘要
石杉碱甲是我国首创的治疗老年痴呆的生物碱，其疗效显著，且药效持续时间长，无严重不良反应，是国内外上述病症最有效的药物之一。但石杉碱甲生产还是依赖于从蛇足石杉植株中提取，这种生产方法产量很低，生产成本高。本发明主要涉及一种从石杉科植物活体中分离得到的木霉菌D01，保藏在国家知识产权局指定保藏单位，保藏编号为CGMCC No.1905。该木霉菌可发酵产生石杉碱甲类化合物，提供了石杉碱甲的微生物发酵生产方式，具有良好的应用前景。
文档编号C12R1/885GK101265451SQ200710086540
公开日2008年9月17日 申请日期2007年3月13日 优先权日2007年3月13日
发明者晶 张, 郭丽燕 申请人:张 晶;郭丽燕