专利名称：猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株rt－pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，尤其涉及动物疫病的预防控制。
背景技术：
2006年6月份以来，我国多个省份的养猪场、户爆发猪“高热病”疫情，据不完全统计，在6～9月份，我国共有发病猪约200万头，死亡40余万头，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。申请人研究发现，猪“高热病”疫情的原发病因是猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株(Nsp2 1594～1680变异株)，并分离鉴定了该病毒(分类命名繁殖与呼吸综合征病毒；拉丁文学名Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus，PRRSV；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏日期2007年3月9日；保藏编号CGMCC No.1964)。
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)引起的以母猪发热、流产，断奶前、后的仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病。1991年，荷兰学者Terpstra等人在感染猪体内分离到欧洲型PRRSV，命名为Lelystad病毒(Lv)；同年，美国学者Benfield等人分离到美洲型PRRSV，命名为VR-2332。近年来，我国学者相继分离鉴定了美洲型PRRSV的CH-1a、S1、HB-1和HB-2等毒株。PRRSV为单股正链RNA病毒，包含8个开放阅读框(ORFs)，其中ORF1编码有关RNA复制和转录的蛋白。NSP2属非结构蛋白，位于ORF1区，可能与PRRSV的嗜细胞性和嗜组织性有关。ORF5编码的糖蛋白GP5是主要的保护性抗原，可以诱导细胞凋亡和参与PRRSV粒子与受体的结合；PRRSV的变异分布于整个基因组，但以NSP2基因和ORF5基因变异最大。PRRSV美国分离株MN184和我国分离株HB-2，其NSP2均缺失数量不等的氨基酸；不同的PRRSV分离株，其GP5氨基酸序列存在数量不等的点突变。
2006年9月，申请人研究发现，全国各地发生的猪“高热病”的病原均为NSP2基因缺失第1441～1443位核苷酸和第1594～1680位核苷酸的美洲型PRRSV，该病毒的致病力超过已知的PRRSV强毒株。申请人针对该病毒建立了特异性RT-PCR检测方法，用于诊断和检测该病毒感染。
此前，我国尚无PRRSV超强变异株(NSP2 1594～1680变异株)的特异检测技术。常规RT-PCR技术不能区分PRRSV超强变异株(Nsp2 1594～1680变异株)和非变异毒株，因此不能特异地检测猪PRRSV超强变异株(Nsp2 1594～1680变异株)；基因测序技术可以鉴定该病毒，但需要至少4天时间才能够鉴定出本病毒。
本发明针对PRRSV超强变异株的基因在Nsp2 1594～1680位核苷酸发生缺失的特征，根据缺失位点的上、下游的核苷酸序列，设计一系列PCR引物，采用RT-PCR方法扩增Nsp2基因，通过检测扩增片段的分子量大小，判断是否存在Nsp21594～1680位核苷酸发生缺失的超强变异病毒株，从而特异、敏感、省时、省力、低成本地检测出猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594～1680变异株)。目前其他RT-PCR方法不能解决该问题；基因测序技术需要时间较长，且费时、费力、成本高。因此，该技术可对PRRSV超强变异株的诊断和监测起到重要作用。
发明内容
本申请涉及的猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株(NSP2 1594～1680变异株)，保藏信息如下 分类命名猪繁殖与呼吸综合征病毒 拉丁文学名Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV 保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC) 地址北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所 保藏日期2007年3月9日 保藏编号CGMCC No.1964 理化特性该病毒直径40～80nm、为有囊膜的球形或椭圆形病毒粒子。不能凝集恒河猴、猪、犬、家兔、豚鼠、SD大鼠、Balb/c小鼠、鸡、人O型的红细胞。
培养特性病毒可在Marc-145细胞中培养增殖，并产生CPE(细胞聚集、隆起、细胞轮廓模糊、变圆、皱缩、核固缩，呈灶状脱落)，在PK-15、ST、BHK21、VERO、MDCK等其他5种细胞上均不产生CPE。
分离鉴定 该病毒分离自江西省病死猪脑组织。将病死猪脑组织样品接种在PK-15细胞单层上，37℃温箱静置培养、观察7天，待出现细胞病变时收获培养物，-70℃保存。
负染电镜观察可见直径约50nm、具有囊膜的球形病毒粒子；超薄切片电镜观察结果可见细胞浆内聚集有大量典型的球形、椭圆星病毒粒子，直径40～80nm不等。
经RT-PCR鉴定和单克隆抗体中和试验，鉴定为美洲型PRRSV。全基因测序结果表明，除去Poly A尾，病毒全基因长度为15320bp，与美洲型PRRSV HB-1(sh)毒株的同源性最高，为96.5％。该病毒毒株与美洲型PRRSV标准株(VR-2332株)比较，其NSP2基因缺失第1441～1443位核苷酸和第1594-1680位核苷酸。
致病性病毒接种5头21日龄仔猪，10天内5头全部发病死亡，其临床症状和大体剖检变化与临床发病猪基本相似，用RT-PCR和病毒分离试验可以检测和回收到病毒。接种2月龄猪29头，发病率100％，病死率57％。因此，该病毒与此前常见的PRRSV强毒相比，致病力显著提高，可称为PRRSV超强变异株。
本申请涉及针对PRRSV超强变异株的NSP2基因的第1594～1680位核苷酸缺失片断设计的引物对，用于检测猪“高热病”病原PRRSV超强变异株(NSP21594～1680变异株)。
该引物对是含有下列核苷酸序列(或其反义互补序列)中任意截取的、长度在5-60个核苷的寡核苷酸，或其衍生物。
包括上游引物SEQ ID NO1和下游引物SEQ ID NO2，见图1和图2。
优选的，上游引物 SEQ ID NO35′-AAGCCTGTCCCYGCYCCGCGCA-3′ SEQ ID NO45′-GGTTCGGAAGAAACTGTCGGTGGT-3′ SEQ ID NO55′-TAACGGTTCGGAAGAAACTGTC-3′ SEQ ID NO65′-GTCCTAACGGTTCGGAAGAAAC-3′ SEQ ID NO75′-GTCCTAACGGTTCGGAAGAAACT-3′ 优选的，下游引物 SEQ ID NO85′-GAGCTGAGTATTTTGGGCGTGT-3′ SEQ ID NO95′-CARGGAGCTGCTTGATGACAC-3′ SEQ ID NO105′-CTGCGAYGGTGCTAGGGGGAAAG-3′ SEQ ID NO115′-GAGCTGAGTATTTTGGGCGTGT-3′ SEQ ID NO125′-GAGCTGAGTATTTTGGGCGTGT-3′ 本申请还提供一种能够特异、敏感、省时、省力、低成本地检测出PRRSV超强变异株(Nsp2 1594～1680变异株)的RT-PCR试剂盒以及一种检测PRRSV超强变异株(Nsp2 1594～1680变异株)的方法。
一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株的试剂盒，包括如SEQ IDNO1和SEQ ID NO2所示的引物对。
进一步的，一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株的试剂盒，包括如SEQ ID NO3和SEQ ID NO8；SEQ ID NO4和SEQ ID NO9、SEQ IDNO5和SEQ ID NO10、SEQ ID NO6和SEQ ID NO11、SEQ ID NO7和SEQ ID NO12所示的引物对。
具体的，该试剂盒包括 1.RNA提取试剂由醋酸钠溶液350μl，酚/氯仿/异戊醇混合液3.5ml，异丙醇3.5ml，75％乙醇12ml，无菌DEPC水450μl，RNA酶抑制剂24μl组成。
2.RT-PCR反应试剂由RT反应液200μl(含反转录引物序列RT引物5’-TCgCCCTAAT-3’)、RNA酶抑制剂24μl、AMV反转录酶12μl、PCR反应液200μl、0.5U/μL Taq DNA聚合酶25μl、矿物油300μl组成。
3.电泳检测试剂包括50×TAE电泳缓冲液20ml、溴化乙锭溶液100μl、上样缓冲液50μl。
4.阴性对照350μl、阳性对照350μl、变性液7ml。
以上试剂的基本制备方法为 1)RNA酶抑制剂购自Promega公司，250μL/管，50U/μL。
2)AMV反转录酶购自Promega公司，1000μL/管，10U/μL。
3)Taq DNA聚合酶购自Promega公司Taq DNA聚合酶，100U/管，5U/μL。将Taq DNA聚合酶与无菌DEPC水以1∶9体积比混合，混匀。
4)RT反应液按下列配方配制 A)无菌DEPC水8μL B)2.5mmol/L dNTP2μL(购自Promega公司，dATP、dCTP、dGTP、dTTP(统称为dNTP)浓度均为100mmol/L。将dATP、dCTP、dGTP、dTTP等体积混匀后，再用DEPC水稀释10倍，即为制备的2.5mmol/L dNTP) C)16pmol/μL RT引物液2μL，RT引物用700μL/OD无菌DEPC水溶解，即为16pmol/μL RT引物溶液。
引物序列RT引物5’-TCgCCCTAAT-3’ D)5倍RT缓冲液4μL(购买Promega公司的AMV反转录酶时，附带的产品，2mL/管)。
5)PCR反应液按下列配方配制 A)无菌DEPC水8μL B)2.5mmol/L dNTP2μL C)8pmol/μL PCR引物混合液2μL。上游引物用256μL/OD无菌DEPC水溶解，下游引物用294μL/OD灭菌DEPC水溶解。等体积混合上游引物和下游引物溶液，即为每条引物浓度为8pmol/μL PCR引物溶液。
D)15mmol/L MgCl2 2μL，购买Promega公司的Taq DNA聚合酶时，附带的产品，规格为750μL/管，取750μL MgCl2溶液加入500μL灭菌DEPC水即为15mmol/L MgCl2溶液。
E)10倍PCR缓冲液2μL，购买Promega公司的Taq DNA聚合酶时，附带的产品，50μL/管。
6)电泳上样缓冲液溴酚蓝0.2g，加双蒸水10mL过夜溶解。50g蔗糖加入50mL水溶解后，移入已溶解的溴酚蓝溶液中，摇匀用双蒸馏水定容至100mL。
本申请还提供一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株的方法，包括 1.样品处理 组织样品处理称取待检组织0.5g置研磨器中剪碎并研磨，加入1.5mL PBS(pH7.2)继续研磨。取已研磨好的待检组织液，置1.5mL灭菌离心管中，8000g离心5min，取上清100μL，再加入300μL变性液，混匀。
血清样品处理取血清100μL，置1.5mL灭菌离心管中，加入300μL变性液，混匀。
阳性对照样品处理取阳性对照样品100μL，置1.5mL灭菌离心管中，加入300μL变性液，混匀。
阴性对照样品处理取阴性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中，加入300μL变性液，混匀。
2.病毒提取RNA取已处理的待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品，每管依次加入醋酸钠溶液30μL、酚/氯仿/异戊醇混合液300uL，颠倒10次，混匀冰浴15min，4℃13000g离心15min。取300μL上清置于新的经无菌DEPC水处理过的1.5mL灭菌离心管中，加入300μL异丙醇，混匀，置液氮3min或-70℃冰箱中30min。室温融化，4℃20000g离心20min。弃上清，沿离心管开口方向管壁缓缓滴入-20℃预冷的75％乙醇溶液1mL，轻轻旋转一周后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1min，真空抽干15min(以无乙醇味为准)。用9μL无菌DEPC水和1μL RNA酶抑制剂沿离心管开口相反方向溶解沉淀，备用。
3.RT操作RT反应液体系配制，N个检测样品反应体系配制为取16×(N+3)μl RT反应液(用前融化，混匀)、(N+3)μl RNA酶抑制剂、(N+3)μl反转录酶，混匀。取N+2个0.2ml薄壁PCR管作好标记，将配制的混合液以每管18μl分配至薄壁PCR管中。根据标记分别加入2μl提取的样品RNA(一份样品换用一个吸头)，其中2管分别加入2μl阳性对照和阴性对照样品RNA，混匀。将0.2ml薄壁PCR管放置在PCR扩增仪上进行以下温度控制程序42℃60min，98℃5min。
4.PCR操作PCR反应液体系配制，N个检测样品反应体系配制为取16×(N+3)μl PCR反应液(用前融化，混匀)、2(N+3)μl 0.5U/μl Taq DNA聚合酶，混匀。取N+2个0.2ml薄壁PCR管作好标记，将配制的混合液以每管18μl分配至薄壁PCR管中。根据标记分别加入2μl cDNA模板(一份样品换用一个吸头)，混匀。加入矿物油一滴(约15μl)覆盖。将0.2mL薄壁PCR管放置在PCR扩增仪上进行以下温度控制程序94℃30s、55℃30s、72℃30s循环，35个循环后，72℃延伸10min。
5.电泳称4g琼脂糖置500mL锥形瓶中，加入1倍TAE电泳缓冲液200mL(取4mL 50×TAE电泳缓冲液，用双蒸水稀释至200mL)，于微波炉中或电热器上熔解，再加入20μL溴化乙锭溶液混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产物15μL混合3μL上样缓冲液，加样于琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压电30min，紫外灯下观察结果，照相。
6.判定变异株的方法 被检样品出现一条与阳性对照病毒(PRRSV NSP2 1594～1680变异株)大小相同的扩增片段，判定为PRRSV超强变异株阳性。
被检样品出现与阳性对照病毒(PRRSVNSP2 1594～1680变异株)大小不同的扩增片段，或不出现扩增片段，判定为PRRSV超强变异株阴性。
图1SEQ ID NO1 图2SEQ ID NO2 图3RT-PCR检测部分省(市)PRRSV超强变异株(NSP2 1594～1680变异株)的电泳结果。
具体实施例方式 实施例1 一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，按下表组装 表1 试剂盒组成 1病毒株 病毒株背景制造本品使用PRRSV超强变异株(NSP2 1594～1680变异株)—-NVDC-JXA1分离株作为阳性对照。
保存在本试验室PRRSV超强变异株NVDC-JXA1分离株已用Marc-145细胞传代3次；-70℃以下，保存期为24个月。
1.1阴性对照样品的制备 取灭菌的DEPC水，置-20℃冰箱保存。
1.2阳性对照样品的制备 将Marc-145细胞培养的PRRSV超强变异株NVDC-JXA1分离株，60℃灭活30min，用合格的本试剂盒检测，出现特异的扩增带，为阳性。其余的培养毒放于-70℃保存备用。
2试剂盒中其他成分的制造 2.1变性液的制备 购自Promega公司Reagent Total RNA Isolation Kit中的组份，120mL/瓶。
2.2醋酸钠溶液的制备 购自Promega公司Reagent Total RNA Isolation Kit中的组份，10mL/瓶。
2.3酚/氯仿/异戊醇混合液的制备 购自Promega公司Reagent Total RNA Isolation Kit中的组份，100mL/瓶。
2.4异丙醇的制备 购自Promega公司Reagent Total RNA Isolation Kit中的组份，100mL/瓶。
2.5无菌DEPC水的制备 纯化水的制备 用双蒸馏水，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，要求纯化水的电阻率≥18.2MΩ.cm，贮于无菌瓶中。
无菌DEPC水的制备 Millipore-Q纯化水加入DEPC至终浓度为0.1％，37℃搅拌处理12h，15lbf/in2(1.034×105Pa)高压蒸汽灭菌15min。
2.675％乙醇的制备 取无水乙醇750mL，加入DEPC水250mL，混匀。
2.7RNA酶抑制剂的制备 购自Promega公司，250μL/管，50U/μL。
2.8AMV反转录酶的制备 购自Promega公司，1000μL/管，10U/μL。
2.9RT反应液的制备和检验 按下列配方配制RT反应液 无菌DEPC水 8μL 2.5mmol/L dNTP 2μL 16pmol/μL RT引物液 2μL 5倍RT缓冲液 4μL 混匀后，用0.22μm滤膜过滤。-20℃保存，检验合格后分装，用于成品试剂盒。
2.10PCR反应液制备 按下列配方配制PCR反应液 无菌DEPC水 8μL 2.5mmol/L dNTP 2μL 8pmol/μL PCR引物混合液2μL 15mmol/L MgCl22μL 10倍PCR缓冲液 2μL 混匀后，用0.22μm滤膜过滤。-20℃保存，检验合格后分装，用于成品试剂盒。
2.11 0.5U/μL Taq DNA聚合酶的制备 购自Promega公司Taq DNA聚合酶，100U/管，5U/μL。将Taq DNA聚合酶与无菌DEPC水以1∶9体积比混合，混匀。
2.12 50×TAE电泳缓冲液的制备 0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0)配制 EDTA 18.61g 灭菌双蒸水 80mL 氢氧化钠 调pH至8.0 灭菌双蒸水 加至100mL 50×T AE电泳缓冲液配制 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 242g 冰乙酸 57.1mL 0.5mol/L EDTA溶液(pH8.0) 100mL 灭菌双蒸水 加至1000mL 使用时灭菌双蒸水稀释50倍。
2.13溴化乙锭溶液制备 溴化乙锭 0.2g 灭菌双蒸水 加至20mL 2.14上样缓冲液的制备 溴酚蓝0.2g，加双蒸水10mL过夜溶解。50g蔗糖加入50mL水溶解后，移入已溶解的溴酚蓝溶液中，摇匀用双蒸馏水定容至100mL。
2.15矿物油的制备 购自Sigma公司，500mL/瓶。
实施例2 一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594～1680变异株)的方法，包括 1.样品处理 组织样品处理采集19个省(市)154头疑似“高热病”发病猪的肺、扁桃体、脑等脏器组织或血清样品，称取待检组织0.5g置研磨器中剪碎并研磨，加入1.5mL PBS(pH7.2)继续研磨。取已研磨好的待检组织液，置1.5mL灭菌离心管中，8000g离心5min，取上清100μL，再加入300μL变性液，混匀。血清样品处理取血清100μL，置1.5mL灭菌离心管中，加入300μL变性液，混匀。
阳性对照样品处理取阳性对照样品100μL，置1.5mL灭菌离心管中，加入300μL变性液，混匀。
阴性对照样品处理取阴性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中，加入300μL变性液，混匀。
2.病毒提取RNA取已处理的待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品，每管依次加入醋酸钠溶液30μL、酚/氯仿/异戊醇混合液300μL，颠倒10次，混匀冰浴15min，4℃ 13000g离心15min。取300μL上清置于新的经无菌DEPC水处理过的1.5mL灭菌离心管中，加入300μL异丙醇，混匀，置液氮3min或-70℃冰箱中30min。室温融化，4℃20000g离心20min。弃上清，沿离心管开口方向管壁缓缓滴入-20℃预冷的75％乙醇溶液1mL，轻轻旋转一周后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1min，真空抽干15min(以无乙醇味为准)。用9μL无菌DEPC水和1μL RNA酶抑制剂沿离心管开口相反方向溶解沉淀，备用。
3.RT操作RT反应液体系配制，N个检测样品反应体系配制为取16×(N+3)μl RT反应液(用前融化，混匀)、(N+3)μl RNA酶抑制剂、(N+3)μl反转录酶，混匀。取N+2个0.2ml薄壁PCR管作好标记，将配制的混合液以每管18μl分配至薄壁PCR管中。根据标记分别加入2μl提取的样品RNA(一份样品换用一个吸头)，其中2管分别加入2μl阳性对照和阴性对照样品RNA，混匀。将0.2ml薄壁PCR管放置在PCR扩增仪上进行以下温度控制程序42℃60min，98℃5min。
4.PCR操作PCR反应液体系配制，N个检测样品反应体系配制为取16×(N+3)μl PCR反应液(用前融化，混匀)、2(N+3)μl 0.5U/μl Taq DNA聚合酶，混匀。取N+2个0.2ml薄壁PCR管作好标记，将配制的混合液以每管18μl分配至薄壁PCR管中。根据标记分别加入2μl cDNA模板(一份样品换用一个吸头)，混匀。加入矿物油一滴(约15μl)覆盖。将0.2mL薄壁PCR管放置在PCR扩增仪上进行以下温度控制程序94℃30s、55℃30s、72℃30s循环，35个循环后，72℃延伸10min。
5.电泳称3g琼脂糖置500mL锥形瓶中，加入1倍TAE电泳缓冲液200mL(取4mL 50×TAE电泳缓冲液，用双蒸水稀释至200mL)，于微波炉中或电热器上熔解，再加入20μL溴化乙锭溶液混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产物15μL混合3μL上样缓冲液，加样于琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压电30min，紫外灯下观察结果，照相。
6.判定变异株的方法 被检样品出现一条与阳性对照病毒(PRRSV NSP2 1594～1680变异株)大小相同的扩增片段，判定为PRRSV超强变异株阳性。
被检样品出现与阳性对照病毒(PRRSV NSP2 1594～1680变异株)大小不同的扩增片段，或不出现扩增片段，判定为PRRSV超强变异株阴性。
结果 19省(市)的154头猪“高热病”发病猪的样品均为PRRSV(NSP21594～1680变异株)阳性，其RT-PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳可见特异性扩增片段的条带，大小约400bp，与阳性对照的扩增片段大小一致。
实施例3 灵敏度和敏感度试验 1.材料 猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株的分离毒株共5株 PRRSV/HEB1/2006、PRRSV/JXB2/2006、PRRSV/HBB1/2006、PRRSV/NM1/2006和PRRSV/HNXTA3/2006。作为猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594～1680变异株)RT-PCR检测试剂盒的敏感性质控样品。
2方法 2.1灵敏度试验 取PRRSV分离株PRRSV/JXB2/2006，稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594～1680变异株)RT-PCR检测试剂盒检测每个稀释度样品。
2.2敏感性试验 用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594～1680变异株)RT-PCR检测试剂盒检测5株临床上分离鉴定过的猪繁殖与呼吸综合征病毒，重复检测3次。考查试剂盒检测不同来源猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594～1680变异株)的敏感性。
3结果 3.1灵敏度试验结果 RT-PCR对不同浓度的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594～1680变异株)的检测结果见表2。RT-PCR检测试剂盒可以检出10-3稀释的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594～1680变异株)细胞培养毒。 表2 灵敏度试验结果
3.2敏感性试验结果 用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594～1680变异株)RT-PCR检测试剂盒检测5株临床上分离鉴定过的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594～1680变异株)，结果全部为阳性(见表3)。 表3 敏感性试验结果 实施例4 特异性试验 1材料 1.1样品 1.1.1其它猪易感病毒毒株日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，由本单位保存。
1.1.2 2份SPF猪肺和血清。
1.1.3PRRSV标准株(VR2332毒株)和PRRSV标准株(LV毒株)。
2方法 2.1特异性试验方法 用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594～1680变异株)RT-PCR检测试剂盒检测6株其它猪易感病毒毒株，2份SPF猪肺和血清，2份PRRSV标准株VR2332毒株和LV毒株。考查试剂盒检测不同样品的特异性。
3结果 3.1检测其它猪易感病毒毒株、SPF猪样品和其它猪繁殖与呼吸综合征病毒结果 用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594～1680变异株)RT-PCR检测试剂盒其它猪易感病毒毒株、SPF猪样品和其它猪繁殖与呼吸综合征病毒，结果均为阴性，结果见表4。
表4 特异性试验检测结果 实施例5 猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株(Nsp2 1594～1680变异株)RT-PCR检测试剂盒与细胞分离培养试验比较 1材料 1.1毒株20株PRRSV超强变异株国内分离株和6株其它猪易感毒株均由中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室保存。
1.2SPF猪肺、血清由中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室保存。
2方法 2.1检测方法 2.1.1 RT-PCR检测按试剂盒检测方法进行。
2.1.2病毒分离鉴定参考GB/T 18090-2000《猪繁殖与呼吸综合征诊断方法》中细胞分离培养方法进行。
2.2符合率试验 2.2.1用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594～1680变异株)RT-PCR检测试剂盒与细胞分离培养方法检测20株PRRSV分离株。
2.2.2用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594～1680变异株)RT-PCR检测试剂盒与细胞分离培养方法检测6株其它猪易感病毒和2份SPF猪样品。
3结果 3.1猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594～1680变异株)RT-PCR检测试剂盒与细胞分离培养方法检测20株分离的PRRSV。符合率为95％。 表5 PRRSV分离株检测结果 3.2检测其它猪易感病毒毒株及SPF猪样品与细胞分离培养方法结果 用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594～1680变异株)RT-PCR检测试剂盒与细胞分离培养方法分别检测其它猪易感病毒毒株及SPF猪样品，结果所有被检的样品均为阴性，符合率为100％。结果见表5。
表6 其它猪易感病毒毒株及SPF猪样品检测结果
权利要求
1、一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株(NSP2 1594～1680变异株)的引物对，其特征在于针对猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因第1594～1680位核苷酸缺失片断而设计，从如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列任意截取、长度为5～60个连续核苷的寡核苷酸。
2、根据权利要求1的引物对，其特征在于如SEQ ID NO3和SEQ ID NO8；SEQ ID NO4和SEQ ID NO9、SEQ ID NO5和SEQ ID NO10、SEQ IDNO6和SEQ ID NO11、SEQ ID NO7和SEQ ID NO12所示的核苷酸序列。
3、一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于包括如权利要求1所述的引物对。
4、一种如权利要求3所述的快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于包括选自如权利要求2所述的引物对中的一种。
5、如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于还包括RNA提取试剂，RT-PCR反应试剂，电泳检测试剂，阴性对照、阳性对照、变性液。
6、如权利要求3-5任一项所述的试剂盒，其特征在于
(1)RNA提取试剂由醋酸钠溶液350μl，酚/氯仿/异戊醇混合液3.5ml，异丙醇3.5ml，75％乙醇12ml，无菌DEPC水450μl，RNA酶抑制剂24μl组成。(2)RT-PCR反应试剂由RT反应液200μl(含反转录引物序列RT引物5’-TCgCCCTAAT-3’)、RNA酶抑制剂24μl、AMV反转录酶12μl、PCR反应液200μl、0.5U/μL Taq DNA聚合酶25μl、矿物油300μl。
(3)电泳检测试剂包括50×TAE电泳缓冲液20ml、溴化乙锭溶液100μl、上样缓冲液50μl。
(4)阴性对照350μl、阳性对照350μl、变性液7ml。
7、权利要求3-6任一项所述的试剂盒在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒中的用途。
8、利用权利要求3-6任一项的试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，包括
(1)样品处理
组织样品采集猪的肺、扁桃体、脑等脏器组织，称取待检组织0.5g置研磨器中剪碎并研磨，加入1.5mL PBS(pH 7.2)继续研磨。取已研磨好的待检组织液，置1.5mL灭菌离心管中，8000g离心5min，取上清100μL，再加入300μL变性液，混匀。
血清样品处理取猪血清100μL，置1.5mL灭菌离心管中，加入300μL变性液，混匀。
阳性对照样品取阳性对照样品100μL，置1.5mL灭菌离心管中，加入300μL变性液，混匀。
阴性对照样品取阴性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中，加入300μL变性液，混匀。
(2)病毒提取RNA取已处理的待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品，每管依次加入醋酸钠溶液30μL、酚/氯仿/异戊醇混合液，颠倒10次，混匀冰浴15min，4℃13 000g离心15min。取300μL上清置于新的经无菌DEPC水处理过的1.5mL灭菌离心管中，加入300μL异丙醇，混匀，置液氮3min或-70℃冰箱中30min；室温融化，4℃20 000g离心20min；弃上清，沿离心管开口方向管壁缓缓滴入-20℃预冷的75％乙醇溶液1mL，轻轻旋转一周后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1min，真空抽干15min；用9μL无菌DEPC水和1μL RNA酶抑制剂沿离心管开口相反方向溶解沉淀，备用；
(3)RT操作RT反应液体系配制，N个检测样品反应体系配制为取16×(N+3)μl RT反应液、(N+3)μl RNA酶抑制剂、(N+3)μl反转录酶，混匀；取N+2个0.2ml薄壁PCR管作好标记，将配制的混合液以每管18μl分配至薄壁PCR管中；根据标记分别加入2μl提取的样品RNA，其中2管分别加入2μl阳性对照和阴性对照样品RNA，混匀；将0.2ml薄壁PCR管放置在PCR扩增仪上进行以下温度控制程序42℃60min，98℃5min；
(4)PCR操作PCR反应液体系配制，N个检测样品反应体系配制为取16×(N+3)μl PCR反应液、2(N+3)μl 0.5U/μl Taq DNA聚合酶，混匀；取N+2个0.2ml薄壁PCR管作好标记，将配制的混合液以每管18μl分配至薄壁PCR管中；根据标记分别加入2μl cDNA模板，混匀；加入矿物油一滴覆盖；将0.2mL薄壁PCR管放置在PCR扩增仪上进行以下温度控制程序94℃30s、55℃30s、72℃30s循环，35个循环后，72℃延伸10min；
(5)电泳
称4g琼脂糖置500mL锥形瓶中，加入1倍TAE电泳缓冲液200mL(取4mL50×TAE电泳缓冲液，用双蒸水稀释至200mL)，于微波炉中或电热器上熔解，再加入20μL溴化乙锭溶液混匀；在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产物15μL混合3μL上样缓冲液，加样于琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压电30min，紫外灯下观察结果，照相；
(6)判定变异株的方法
被检样品出现一条与阳性对照病毒(PRRSV NSP2 1594～1680变异株)大小相同的扩增片段，判定为PRRSV超强变异株阳性；
被检样品出现与阳性对照病毒(PRRSV NSP2 1594～1680变异株)大小不同的扩增片段，或不出现扩增片段，判定为PRRSV超强变异株阴性。
9、权利要求8所述的方法在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒和使用该试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，该方法是采用特异性RT－PCR方法检测PRRSV超强变异株(Nsp2 1594～1680变异株)，具备特异、敏感、省时、省力、低成本的特点。
文档编号C12N15/11GK101063173SQ200710086548
公开日2007年10月31日 申请日期2007年3月14日 优先权日2007年3月14日
发明者田克恭 申请人:中国动物疫病预防控制中心