专利名称：用于多肽融合表达的连接肽及多肽融合表达方法
技术领域：
本发明属于生物技术和基因工程领域；更具体的，本发明涉及一种用于目 的多肽融合表达的连接肽、利用所述连接肽制备的融合多肽以及制备目的多肽 的方法。
背景技术：
蛋白质融合表达在基因工程领域中的应用十分广泛，尤其是小分子多肽。 研究者们在分离到某一基因后，要对其编码蛋白质进行研究最理所当然的工作 就是表达一一即有目的性地合成外源基因产物。在重组DNA技术的发展早期， 人们认为在基因的前面有一个强启动子和一个起始密码子就足以在大肠杆菌 中获得很好的表达。随后，认识到获得有效的翻译所需的条件要复杂得多，除 了要有强启动子和起始密码子外，良好的表达尚需编码目的蛋白的mRNA中含 有核糖体结合位点，表达水平受密码子喜好程度的影响，也受编码序列中其它 目前尚未明了的因素影响。通过改变起始密码子前端的序列，或者在不改变蛋 白质序列的条件下利用密码子的简并性改变5'末端编码序列往往有助于解决 问题。
通常，两个基因之间的融合表达能更快地解决这些问题。在这种方式中， 目的基因被引入某个高表达蛋白序列(fusion tag)的3'末端，比如大肠杆菌 的一段序列，或者任一可在大肠杆菌中高度表达的基因，它提供良好表达所必 需的信号，而表达出的融合蛋白的N末端含有由fusion tag编码的片段。fusion tag所编码的可能是整个功能蛋白或是其中的部分。比如6XHisTag、 P-半乳 糖苷酶融合蛋白和trpE融合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白以及硫氧 还蛋白(Trx)融合蛋白等。
在另外的情况下，对小分子的多肽表达通常采用串联融合表达，即将多个 多肽基因首尾连接，转入表达载体中进行表达；这样有利于小分子的多肽的高 表达，也防止小分子多肽的降解，利于表达后的纯化；采用这种策略表达小分 子多肽，可以降低成本、提高目的多肽的得率。因此，在小分子多肽的表达中，
融合表达也是经常使用的。
在多肽融合表达中，目的多肽之间及目的多肽和引导肽之间都需要引入连 接肽。连接肽是用于切割融合多肽的位点， 一般是特异性断裂的氨基酸位点，
如Me"(溴化氰)、Trpi (BNPS-3-甲基吲哚)、Asn I Gly (羟胺)、 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys I (肠激酶)，Lys-Arg I (Kex2酶)等等。这些特定的切割 位点一般在基因表达前已经引入到目的多肽之间，在融合多肽表达后，使用特 定的切割方法(化学法或者酶切法)在融合多肽特定的位点断裂融合多肽，从而 得到具有生物学活性的目的单体多肽。
多肽串联表达技术的关键是如何加工切除这些目的多肽之间的连接肽，目 前仍然没有十分合适的方法。国际上已建立了数种对融合蛋白进行位点特异性 裂解的方法，包括化学裂解法和蛋白酶法。其中化学裂解如溴化氰(Met I )、 BNPS-3-甲基B引哚(Trp I )、羟胺(Asnl Gly)等，不但便宜且有效，往往还可以 在变性条件下进行反应，在早期得到过广泛应用；但由于裂解位点的特异性低， 可能对目的蛋白产生的不必要修饰，以及化学物质毒性强，在生产中应用受限 等原因，化学法逐渐被反应温和的酶解法取代。
酶解的方法相对来说反应条件较温和，并且具有高度的特异性。其中最为常用 的酶有Xa因子、凝血酶和肠激酶。Xa因子、凝血酶和肠激酶都具有较长的底物 识别序列(如在凝乳酶中为7个氨基酸)，从而降低了蛋白质中其它无关部位发生断 裂的可能性；其中Xa因子和肠激酶切割后的目的多肽与天然产物完全一致，因此 应用范围非常广泛。
在多肽位点特异性裂解方法中，化学裂解法已经渐渐被酶解法取代。国内外对 特异性强的蛋白酶的发现越来越多，对这些蛋白酶的研究也越来越深入。
国内外有大量的文献报道了使用各种蛋白酶切割融合多肽的方法。例如， 专利PCT/JP00/02736(专利名称从新的融合蛋白制造重组胰岛素的方法)报道 了将胰岛素编码基因和引导肽、连接肽在表达载体中融合表达，而后使用凝血 酶进行串联蛋白的裂解；专利200510023428. 9(专利名称重组人甲状旁腺激 素PTH 1-34的制备方法)报道了融合蛋白Trx-PTH(1-34)基因工程表达的方法， 融合蛋白表达后使用肠激酶酶切；专利PCT/JP2002/004735(专利名称肽的制 备方法)报道了一种靶肽或其盐的制备方法，通过酶或化学方式对在靶肽的N 末端和C末端附加酶或化学上的切断位点并重复连接的前体蛋白进行断裂；专 禾廿W0200017336-A (专禾U名称New隨cassette comprising tandem repeating
units of a nucleotide sequence encoding a biologically active peptide and a linker peptide used for producing the biologically active peptide ) 报道了一种DNA元件，它包括多个编码生物活性多肽的DNA序列和链接多肽， 其中链接多肽可以被蛋白酶或化学试剂识别。该发明可以用于制备生物活性多 肽，特别适合用基因工程菌制备短肽。
但是目前的这些方法中还存在以下诸多问题(1)化学方法特异性低，易 产生不必要的化学修饰，并且化学试剂毒性强，难以推广应用；(2)目前的酶 切方法，往往会在末端多出一个或者数个非目的多肽的组成氨基酸，这大大限 制了用此法生产的多肽的用途，尤其是在制药中的应用。上述问题直接影响了 所述方法在多肽融合表达中的应用。
因此，本领域迫切需要进一步改进多肽融合表达的方法，并且开发新的、 更适用于多肽融合表达的连接肽，以克服现有技术的缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于多肽融合表达的连接肽。 本发明的另一目的在于提供一种包含所述连接肽以及目的多肽的融合多肽。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述的连接肽制备目的多肽的方法。 在本发明的第一方面，提供一种连接肽，所述的连接肽具有如下的氨基酸序
列
X-Arg-Y-Asp-Asp-Asp—Asp-Lys;
其中，X选自Lys或Arg;
Y为无或1-100个氨基酸构成的序列。
在本发明的另一优选例中，Y为无或l-50个氨基酸构成的序列。更优选的， Y为无或1-15个氨基酸构成的序列；进一步优选的，Y为无或l-10个氨基酸 构成的序列；例如，Y可以为l， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8或9个氨基酸构成的序 列。
在本发明的第二方面，提供所述的连接肽的用途，用于连接2个或多个目的 多肽以制备融合多肽；附加条件是目的多肽中不含有肠激酶、Kex2酶和羧肽酶B 的酶切位点。
在本发明的第三方面，提供一种DNA分子，所述的DNA分子编码所述的连接肽。
在本发明的第四方面，提供一种融合多肽，所述的融合多肽含有以下结构
Z0-(Z-Zl)n;
其中，ZO表示第一目的多肽； Z表示所述的连接肽； Zl表示相同或不同的第二目的多肽； Fl-99;
所述的第一目的多肽和第二目的多肽是相同或不同的，且其中不含有肠激酶、
Kex2酶和羧肽酶B的酶切位点。
优选的，n=l-49;更优选的，n=l-19。
在本发明的另一优选例中，所述的融合多肽可被肠激酶、Kex2酶和羧肽酶B
酶切后形成去除连接肽序列的目的多肽。
在本发明的另一优选例中，所述的融合多肽是重组表达获得的。 在本发明的第五方面，提供一种制备目的多肽的方法，所述的方法包括以下
步骤
在含有所述的融合多肽的体系中加入肠激酶、Kex2酶和羧肽酶B，使融合多 肽被肠激酶、Kex2酶和羧肽酶B酶切，形成目的多肽与连接肽片段的混合物，以 及
从混合物中分离出目的多肽。
在本发明的另一优选例中，在含有融合多肽的体系中同时加入肠激酶、Kex2 酶和羧肽酶B来酶切融合多肽；或者，在含有融合多肽的体系中分别加入肠激酶、 Kex2酶和羧肽酶B来酶切融合多肽。
在本发明的另一优选例中，酶切的温度为4-6(TC。优选的，酶切的温度为10-30 °C，更优选的为25-30°C。
在本发明的另一优选例中，酶切的PH值为4. 0-11.0。优选的，酶切的PH值 为6. 0-9.0;更优选的，酶切的PH值为7.0-8.0;最优选的为7. 3-7. 5。
在本发明的另一优选例中，肠激酶、Kex2酶和羧肽酶B的加入比例按照 酶活为肠激酶Kex2酶羧肽酶B = (1-4) : (1-4) : (0.5-4)。更优选的，肠激酶、
Kex2酶和羧肽酶B的加入比例按照酶活为肠激酶Kex2酶羧肽酶B-2: 2 : 1。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。
图1显示了融合多肽的质粒构建示意图。
图2显示了pTHiohisA-insulin融合蛋白表达的SDS-PAGE电泳鉴定，以及
将融合蛋白进行酶切后的电泳鉴定；其中，
M: Marker (97.4KD， 66.2KD， 42.7 KD， 31.0 KD， 20.1 KD， 14.4 KD);
1: pTHiohisA-insulin融合蛋白的电泳鉴定；
2: pTHiohisA/insulin融合蛋白由EK酶切后的电泳鉴定；
3: pTHiohisA-insulin融合蛋白由EK酶，KEX2酶和CPB酶切后纯化得到
i固li结果。
图3显示了pET30a(+)-PTH融合蛋白表达SDS-PAGE电泳鉴定，以及将融合 蛋白进行酶切后的电泳鉴定；其中，
M: Marker (97.4KD， 66. 2KD， 43 KD， 31.0 KD， 20.1 KD， 14.4 KD); 1: pET30a(+)-PTH融合蛋白的电泳鉴定；
2: pET30a(+)-PTH融合蛋白由EK酶，KEX2酶和CPB酶切后纯化得到PTH 结果。
图4显示了pET30a(+)-C肽融合蛋白表达SDS-PAGE电泳鉴定，以及将融合蛋
白进行酶切后的电泳鉴定；其中，
Ml: Marker (97.4KD， 66. 2KD， 42.7 KD, 31.0 KD， 20.1 KD, 14.4 KD); M2: Marker (16949D， '14404D， 10700D， 8159D， 6214D， 2512D); 1: pET30a(+)-C肽融合蛋白的电泳鉴定；
2-4: pET30a(+)-C肽融合蛋白由EK酶，Kex2酶和CPB酶切后纯化得到C 肽结果。
具体实施例方式
本发明人经过深入的研究，首次设计了一种连接肽，所述连接肽特别适用 于目的多肽的融合表达。所述连接肽在与目的多肽串联表达后，可被肠激酶
(EK)、 Kex2酶和羧肽酶B(CPB) 3种酶酶切，从而形成不带有任何连接肽序列 的目的多肽。此外，该连接肽中含有亲水性氨基酸Asp、 Lys、 Arg，易于被暴 露于融合多肽的表面，从而为酶切提供了便利。在此基础上完成了本发明。
连接肽
本发明提供了一种连接肽，该连接肽具有如下的氨基酸序列
X-Arg-Y-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys; 其中，X选自Lys或Arg;
Y为无或1-100个由任意氨基酸构成的序列；优选的，Y为无或l-50个由 任意氨基酸构成的序列；更优选的，Y为无或1-15个氨基酸构成的序列；进一 步优选的，Y为无或l-10个氨基酸构成的序列；如Y可以为1， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8或9个氨基酸构成的序列。
本发明所述的连接肽中，含有的Arg、 Lys和Asp均属于亲水性氨基酸， 因此当含有所述连接肽的融合多肽处于水溶液中时，连接肽易于被暴露在融合 多肽的表面，从而易于被酶切。
本发明所述的连接肽中，含有肠激酶酶切位点序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys I ; Kex2酶酶切位点序列Lys-Arg I或Arg-Arg | ;以及羧肽酶B酶切位点I Arg禾口/或I Lys。
本发明还提供了一种基因，所述基因可编码所述连接肽。
此外，本发明还提供了含有所述连接肽的编码基因的重组载体，以及含有 所述重组载体或基因组中整合有所述连接肽的编码基因的基因工程化细胞。
作为本发明的优选方式，Y所示的氨基酸序列中含有亲水性的氨基酸；优 选地，Y所示的氨基酸序列中含有至少20%的亲水性氨基酸；更优选的，Y所示 的氨基酸序列中含有至少50%的亲水性氨基酸。所述的亲水性氨基酸有助于连 接肽被暴露于融合多肽空间结构的表面上，有利于酶切。
酶
在本发明中，采用联合三种基因工程酶来实现对融合多肽的酶切，从而使 得在经过酶切后目的多肽上不含有连接肽的序列。
肠激酶(Enterokinase， EK):是一种识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列的蛋 白酶，专一性地在Lys的C端水解多肽。通常，肠激酶的适用温度和PH值较 宽，如温度可在4-45""C， pH范围可在4-10。
Kex2酶，其由基因KEX2编码，其能够选择性地识别和水解多肽羧基端的 Lys-Arg或Arg-Arg键残基。Kex2酶作用的较佳温度范围为4-45°C ; PH值范 围为4. 5-9. 5。
羧肽酶B (Carboxypeptidase B， CPB)属于羧肽酶的一种，其能够选择性 地水解羧基端残基为Arg和Lys的肽键。羧肽酶B作用的较佳温度范围为 4-60°C; PH值为5-11。
在本发明中，上述的基因工程酶可在同样的条件(如温度或PH值)下被应 用；或者，本领域人员也可在保持目的多肽活性的前提下，适当调节酶解条件， 分别使用这些酶，以发挥酶的最佳特性。
利用上述肠激酶、Kex2酶和羧肽酶B三种酶联合酶切含有本发明的连接肽 的融合多肽，不仅酶切效率高，并且酶切后产生的目的多肽中不含有任何非目 的多肽的组成氨基酸，与天然的目的多肽完全一致。
目的多肽
适用于本发明的目的多肽(目的蛋白)没有特别的限制，只要其能够通过本 发明的连接肽被串联表达，且其氨基酸序列中不含有肠激酶、Kex2酶和羧肽酶B 的酶切位点。通常，所述的目的多肽的长度在1-500aa;优选的，所述的目的多 肽的长度在5-200aa;更优选的，所述的目的多肽的长度在5-100aa;进一步优 选的，所述的目的多肽的长度在10-80aa;最优选的，所述的目的多肽的长度在 10-50aa，如可以是15aa， 20aa， 25aa， 30aa， 35aa， 40aa， 45aa。
作为本发明的优选方式，所述的目的多肽是小分子多肽。所述的小分子多 肽例如胰岛素(Insulin)、甲状旁腺激素(pTH)、成骨生长肽(OGP)或P-绒毛 膜促性腺激素(e-HCG)等。
作为本发明的优选方式，所述的目的多肽本身也可以是一种融合蛋白，例 如胰岛素A链-Lys-Arg-胰岛素B链。
融合多肽
本发明提供了一种融合多肽(融合蛋白)，所述的融合多肽含有以下结构
Z0-(Z-Zl)n
其中，ZO表示第一目的多肽；
Z表示所述的连接肽；
Zl表示相同或不同的第二目的多肽。
也即，所述的融合多肽含有例如以下的结构目的多肽1-连接肽-目的多肽 2 -连接肽--------目的多肽m (ra为正整数，m《100)。
本发明所述的融合多肽可被肠激酶、Kex2酶和羧肽酶B酶切后形成去除连接 肽序列的目的多肽。
在实际操作中，本领域可以根据需要选择目的多肽的类型。在所述的融合多 肽中，所述的目的多肽可以是具有相同氨基酸序列的多肽，也即是同一种多肽；或 者，所述的目的多肽可以是具有不同氨基酸序列的多肽，也即是不同种多肽。这些 可根据实际操作需求而变化。
也即，所述的第一目的多肽和第二目的多肽可以是相同或不同的，且所述的 第二目的多肽可以是相同或不同的。
通常，目的多肽在融合多肽中的数量根据该目的多肽的长度、性质、表达载 体的类型、工程细胞的类型等条件而定。 一般地，在所述融合多肽中，目的多肽的 数量为2-100 (n=l—99);更优选的，目的多肽的数量为2-50 (n = l — 49);最优 选的，目的多肽的数量为2-20 (n=l — 19)。
作为本发明的优选方式，所述的融合多肽举例如下
(I) Arg-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-insulin B 链一Lys-Arg-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys—insulin A链一Lys-Arg-Gly-Gly-Gly- Gly-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys—insulin B链一Lys-Arg-Ala-Asp-Asp- Asp-Asp-Lys—insulin A 链一Lys-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Asp-Asp- Asp-Lys—insulin B链_ Lys-Arg-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys—insulin A链；或
(II) Arg-Ser-Asp- Asp-Asp-Asp-Lys-PTH—Lys-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys — PTH — Lys-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys—PTH_ Lys-Arg; 或
(III) Arg-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C肽一Lys-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys—C肽一Lys-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp- Lys—C月太- Lys-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys— C肽。
本发明中制备的含连接肽和目的多肽的融合多肽，在肠激酶、羧肽酶B和 Kex2酶联合酶切作用下，目的多肽的N端和C端不会多出任何非目的多肽所 有的氨基酸。通过表达融合多肽的方式来制备目的多肽，可大大提高目的多肽 的生产效率和产品质量。
本发明还提供可编码所述融合多肽的基因，含有所述融合多肽的编码基因 的重组载体，以及含有所述重组载体或基因组中整合有所述融合多肽的编码基 因的基因工程化细胞。
融合多肽的制备或表达方法是本领域技术人员所熟知的，例如可采用如下 的步骤
(1) 将编码目的多肽的基因与编码连接肽的基因根据所需的拷贝数相串联 连接，形成融合基因；其中所述的连接比如可采用设计适当引物的方式实现， 或者也可采用人工合成的方法合成所需的融合基因；
(2) 将(l)制备的融合基因插入表达载体的多克隆位点中，获得插入了融 合基因的表达载体；
(3) 将(2)获得的插入了融合基因的表达载体转入宿主细胞，获得转化的 宿主细胞；
(4) 培养转化的宿主细胞，从而表达出融合多肽；
(5) 分离获得融合多肽。
在本发明的一个优选例中，制备融合多肽的常规方法可以如下进行采用 基因重组技术，先将编码目的多肽的基因和编码连接肽的基因重组连接，再将 此重组基因序列串联成多个拷贝；测序分析验证后，将该融合基因插入到表达 载体中，转入宿主细胞内，诱导表达、纯化融合多肽。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含融合多肽编码基因的序列和 合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述融合多肽编码基因的序列可有效连接到表达
载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还可包括翻译起始用的 核糖体结合位点和转录终止子。
宿主细胞是任何适于表达所述融合多肽的细胞，例如可以是原核细胞，如 细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。 代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主 细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿 主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法 如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的融合多肽。根据所用的 宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长 的条件下进行培养。
所述的融合多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果 需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化该融 合多肽。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限 于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处 理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层 析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
目的多肽的制备方法
技术领域：
本发明提供了一种制备目的多肽的方法，所述的方法包括步骤
(a) 制备含有以下结构的融合多肽-
ZO-(Z-Zl)n 其中，Z0、 Z、 Zl以及n的定义同前述。
(b) 利用肠激酶、Kex2酶和羧肽酶B酶切(a)制备的融合多肽，形成目的多肽 与连接肽片段的混合物。
(c) 从混合物中分离出目的多肽。
在步骤(b)中，肠激酶、Kex2酶和羧肽酶B可同时加入到含有(a)制备的融 合多肽的体系中；或者，可在含有(a)制备的融合多肽的体系中分别加入肠激酶、 Kex2酶和羧肽酶B。当用于酶切时，本发明对肠激酶、Kex2酶和羧肽酶B在含有 融合多肽的体系中的加入次序没有特别的限制。
作为一种方式，可在所述含有融合多肽的体系中依次加入肠激酶、Kex2酶和 羧肽酶B，这些酶切除融合多肽中连接肽的次序可以如下
3 2 1
(羧肽酶B)(Kex2酶) (肠激酶)
------X — Arg - Y - Asp — Asp — Asp - Asp — Lys----
作为另一种方式，可在所述含有融合多肽的体系中依次加入Kex2酶、肠激酶 和羧肽酶B，这些酶切除融合多肽中连接肽的次序可以如下
3 1 2
(羧肽酶B)(Kex2酶) (肠激酶)
----—X - Arg _ Y - Asp - Asp - Asp - Asp - Lys---
在用于酶切时，肠激酶、Kex2酶和羧肽酶B的加入量通常根据融合蛋白中含 有连接肽的拷贝数的多少而定，在本发明中没有特别的限制。例如，当融合蛋白中 含有1拷贝的连接肽时，肠激酶的加入量为1-5单位/50u g融合多肽；Kex2酶的 加入量为1-5单位/50 u g融合多肽；或羧肽酶B的加入量为0. 5-3单位/50 u g融 合多肽。
作为本发明的优选方式，酶切的温度为4-60°C;优选的，酶切的温度为10-30 °C;更优选的为25-30°C。
作为本发明的优选方式，酶切的PH值为4. 0-11.0。优选的，酶切的PH值 为6. 0-9.0;更优选的，酶切的PH值为7.0-8.0;最优选的为7. 3-7. 5。
在本发明的一个优选例中，将肠激酶、羧肽酶B和Kex2酶三种酶加入同一 个酶切反应体系中对pTH-Lys-Arg-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-pTH-Lys-Arg-Ala-Asp-Asp -Asp-Asp-Lys-pTH-Lys-Arg-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-pTH融合 蛋白进行酶切。反应的温度为25-30°C，反应的pH为7.4，缓冲体系为 20mM Tris. CIlOOmM NaCl。
目的多肽的分离
在经过酶切后，可采用本领域技术人员熟知的多种蛋白分离技术从混合体 系中分离出所述的目的多肽。所述的分离方法通常根据目的多肽的特性而定。 例如可根据混合体系中待分离的目的多肽与其它肽的等电点的不同进行分离。 其它方法的例子包括但并不限于分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交 换层析、高效液相层析(HPLC)或这些方法的结合。
本发明的主要优点在于
(1) 通过在融合表达的多肽之间引入本发明提供的连接肽，在融合多肽表 达后可以使用多酶联合酶切，不仅可大大提高目的多肽的生产效率，而且所表 达的融合多肽经酶切后所得到的目的多肽中不含有任何非目的多肽组成氨基 酸，与天然多肽完全一致。
(2) 所述的连接肽含有多个亲水性氨基酸，易于被暴露于融合多肽的表面， 因而酶切加工效率特别高。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。
实施例1胰岛素(Insulin)的融合表达和多酶联合酶切加工
本实施例中，所需制备的目的多肽是胰岛素A链(Insulin A链，GenBank登 录号NM—000207)和胰岛素B链(Insulin B链，GenBank登录号NM—000207)，采 用的连接肽序列如下
Arg-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO: 1)，其相应的编码基因的序 列为AGA TCT GAT GAC GAT GAC AAA(SEQ ID NO: 2);
Lys-Arg-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO: 3)，其相应的编码基因 的序列为AAG AGA GCT GAT GAC GAT GAT AAG(SEQ ID NO: 4);
Lys-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO: 5)， 其相应的编码基因的序列为AAG AGA GGT GGA GGT GGA TCT GAT GAC GAT GAC AAA (SEQ ID NO: 6)。
1.制备融合多肽
设计融合多肽如下Arg-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-insulin B链一 Lys-Arg-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys—insulin A链一Lys-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys — insulin B 链一 Lys-Arg-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys — insulin A链一Lys-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys—insulin B链一Lys-Arg-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys—insulin A链； 其中带有3拷贝insulin B链和3拷贝insulin A链。
首先，通过人工合成的方法合成含有胰岛素A链、连接肽和胰岛素B链编码 基因的如下序列(SEQ ID NO: 7):
GAT GAC GAT GAC AAA TTC GTT AAC C|AA CAC TTG TGC GGT TCC CAC TTG GTT GAG GCT TTG TAC TTG GTT TGC GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC ACT CCT AAG ACT AAG AGA GCT GAT GAC GAT GAT AAG GGT ATT GTC GAA CAA TGC TGT ACC TCC ATC TGC TCC TTJG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGC AAC AAG AGA GGT GGA GGT
接着，设计的引物如下
正向引物gga AGA TCT GAT GAC GAT GAC AAA TTC GTT AAC C (SEQ ID NO: 8，其中下划线为Bgl II酶切位点)；
反向引物eg GGA TCC ACC TCC ACC TCT CTT GTT GCA GTA GTT TTC CAA TTG GTA C (SEQ ID NO: 9，其中下划线为Bam HI酶切位点)。
以前述制备的含有胰岛素A链、连接肽和胰岛素B链编码基因的序列为模板 进行PCR反应，获得可编码i扁lin B链一Lys-Arg-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys— insulin A链序列且两端携带酶切位点的目的基因。
其次，为了合成含有3拷贝insulin B链和3拷贝insulin A链的融合多 肽，进行如下操作(见图1):
(1) 用Bgl II和Bam HI酶切前述获得的目的基因，将酶切产物克隆入经 过5W II酶切的pET30a( + )载体(购自Novagen)中(Bgl II和Bam HI为同尾 酶)，构成含l拷贝目的基因的重组载体。
(2) 同样用Bgl II和Bam HI酶切前述获得的目的基因，将酶切产物克隆 入经过^g7 II酶切的前述(l)获得的重组载体中，构成含2拷贝目的基因的重 组载体。
(3) 同样用Bgl II和Bam HI酶切前述获得的目的基因，将酶切产物克隆 入经过Sg7 1I酶切的前述(2)获得的重组载体中，构成含3拷贝目的基因的重 组载体。
在进行如上连接后，获得的融合基因经测序分析结果正确，获得由所述连 接肽的编码基因相连接的、可编码3拷贝胰岛素A链和3拷贝胰岛素B链的基因如 下(SEQ ID NO: 10，该序列也可通过常规的人工合成技术全合成)
ccAGA TCT GAT GAC GAT GAC AAA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGC GGT TCC CAC TTG GTT GAG GCT TTG TAC TTG GTT TGC GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC ACT CCT AAG ACT AAG AGA GCT GAT GAC GAT GAT AAG GGT ATT GTC GAA CAA TGC TGT ACC TCC ATC TGC TCC TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGC AAC AAG AGA GGT GGA GGT GGA TCT GAT GAC GAT GAC AAA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGC GGT TCC CAC TTG GTT GAG GCT TTG TAC TTG GTT TGC GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC ACT CCT AAG ACT AAG AGA GCT GAT GAC GAT GAT AAG GGT ATT GTC GAA CAA TGC TGT ACC TCC ATC TGC TCC TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGC AAC AAG AGA GGT GGA GGT GGA TCT GAT GAC GAT GAC AAA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGC GGT TCC CAC TTG GTT GAG GCT TTG TAC TTG GTT TGC GGT GAA AGA GG丁 TTC TTC TAC ACT CCT AAG ACT AAG AGA GCT GAT GAC GAT GAT AAG GGT ATT GTC GAA CAA TGC TGT ACC TCC ATC TGC TCC TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGC AAC AAG AGA GGT GGA GGT GGA TCC
接着，用Bgl II和Bam HI进行双酶切，将酶切产物克隆入经过同样双酶 切的pTHiohisA载体(购自Invitrogen公司)中。再将形成的重组表达载体转 化入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建工程菌BL21(DE3)/pTHiohisA/insulin3融合 基因，诱导表达，经鉴定有胰岛素3拷贝融合蛋白表达(见图2，泳道l)，进 行纯化得到胰岛素3拷贝融合蛋白。
2.酶切
将肠激酶、羧肽酶B和Kex2酶3种酶加入同一个酶切反应体系中对上述制备 的融合多肽进行酶切，其中肠激酶使用浓度约为12unit/50ug融合蛋白(每条
融合蛋白含6个肠激酶酶切位点)，羧肽酶B使用浓度为6unit/50ug融合蛋白 (每条融合蛋白含6个羧肽酶B酶切位点)，Kex2酶使用浓度为12unit/50ug融 合蛋白(每条融合蛋白含6个羧肽酶B酶切位点)。
酶切反应的温度为25-30°C，反应的pH为7.4，缓冲体系为20mMTris.Cl 100mM NaCl。
pTHiohisA/insulin融合蛋白由EK酶切后的SDS-PAGE电泳鉴定结果见图 2(泳道2); pTHiohisA-insulin融合蛋白由EK酶，KEX2酶和CPB酶切后纯化得 到insulin的SDS-PAGE电泳鉴定结果图2(泳道3)。
进一步的鉴定表明，分离获得的胰岛素A链和B链具有与天然胰岛素相同 的序列以及活性。
实施例2 PTH的融合表达和多酶联合酶切加工
本实施例中，所需制备的目的多肽是甲状旁腺激素(PTH) (GenBank登录号 画—000315)，采用的连接肽序列如下
Arg-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO: 1);
Lys-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO: 5)。
1. 制备融合多肽
参照如实施例l所述类似的方法，利用前述连接肽的编码序列将pTH基因 串联成含有3拷贝的目的基因且编码如下融合多肽的融合基因Arg-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Ly s-PTH 一 Lys-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys — PTH — Lys-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys — PTH-Lys-Arg拷贝。
测序分析结果正确。将含有3拷贝pTH基因的融合基因插入pET30a(+)载 体(购自Novagen)，构建工程菌BL21 (DE3) / pET30a(+)/ pTH 3拷贝，诱导表 达，经鉴定有pTH 3拷贝融合蛋白表达(图3，泳道1)，进行纯化得到pTH 3 拷贝融合蛋白。
2. 酶切
将肠激酶、羧肽酶B和KEX2酶三种酶加入同一个酶切反应体系中对pTH 4 拷贝融合蛋白进行酶切。酶切反应的温度为25-30°C，反应的pH为7.4，缓冲体系为20mM Tris. CI lOOmM NaCl。
pET30a(+)-PTH融合蛋白由EK酶，KEX2酶和CPB酶切后纯化得到PTH结 果见图3(泳道2)。
进一步的鉴定表明，分离获得的PTH多肽具有与天然pTH多肽相同的序列 以及活性。
实施例3 C肽的融合表达和多酶联合酶切加工
本实施例中，所需制备的目的多肽是C肽(编码基因为GAA GCT GAA GAT TTG CAA GTT GGT CAA GTT GAA TTG GGT GGT GGG CCC GGT GCT GGT TCT TTG CAA CCA TTG GCT TTG GAA AAT TCT TTG CAA (SEQ ID NO: ll))，采用的连接肽序列如 下
Arg-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO: 1);
Lys-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO: 5)。
参照如实施例l所述类似的方法，利用前述连接肽的编码序列将C肽基因 串联成含有4拷贝的目的基因且编码如下融合多肽的融合基因 Arg-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C 肽一 Lys-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys—C肽一Lys-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys—C肽- Lys-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys—C肽。
测序分析结果正确。将含有4拷贝C肽基因的融合基因插入pET30a(+)载 体，构建工程菌BL21(DE3)/ pET30a(+)/ pTH 4拷贝，诱导表达，经鉴定有C 肽4拷贝融合蛋白表达(图4，泳道l)，进行纯化得到C肽4拷贝融合蛋白。
2.酶切
将肠激酶、羧肽酶B和KEX2酶三种酶加入同一个酶切反应体系中对C肽4 拷贝融合蛋白进行酶切。
反应的温度为25-30°C，反应的pH为7.4，缓冲体系为20mMTris.Cl lOOmM NaCl。
pET30a(+)-C肽融合蛋白由EK酶，Kex2酶和CPB酶切后纯化得到C肽结 果见图4(泳道2， 3， 4)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单 独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域 技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利 要求书所限定的范围。
序列表
<110〉上海新生源医药研究有限公司 上海新生源生物医药有限公司
<120>用于多肽融合表达的连接肽及多肽融合表达方法
<130〉 072677
<160〉 11
<170〉 Patentln version 3. 3
<210〉 1
<211〉 7
〈212〉 PRT
<213〉 人工序列
<220〉
<221〉 MISC—FEATURE <223〉连接肽
<400〉 1
Arg Ser Asp Asp Asp Asp Lys 1 5
<210〉 2
<211> 21
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220>
<221〉 misc_feature <223〉连接肽基因
<400〉 2
agatctgatg acgatgacaa a 21
<210〉 3
<211〉 8
〈212〉 PRT
<213〉 人工序列
<220>
<221〉 MISC_FEATURE
<223>连接肽基因 <220>
<221〉 MISC—FEATURE <223〉连接肽
<400〉 3
Lys Arg Ala Asp Asp Asp Asp Lys 1 5
<210> 4
<211> 24
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc_feature <223〉连接肽基因
<400> 4
aagagagctg atgacgatga taag 24
<210〉 5
<211〉 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220〉
<22〉MISC_FEATURE <223>连接肽
<400〉 5
Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 10
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〈211〉 36
<212〉 DNA <213〉人工序列
<220>
<221> misc—feature <223〉连接肽基因
<400> 6
aagagaggtg gaggtggatc tgatgacgat gacaaa 36
<210> 7
<211〉 207
<212> 腿 <213〉人工序列
<220〉
<221> misc—feature
<223〉胰岛素A链-连接肽-胰岛素B链编码基因 <400> 7
gatgacgatg acaaattcgt taaccaacac ttgtgcggtt cccacttggt tgaggctttg 60 tacttggttt gcggtgaaag aggtttcttc tacactccta agactaagag agctgatgac 120 gatgataagg gtattgtcga acaatgctgt acctccatct gctccttgta ccaattggaa 180 aactactgca acaagagagg tggaggt 207
<210〉 8
<211〉 34
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220〉
<221> misc—feature <223〉 引物
<400> 8
ggaagatctg atgacgatga caaattcgtt aacc
34
<210> 9
<211〉 48
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220>
<221〉 misc—feature <223〉 引物
<400〉 9
cgggatccac ctccacctct cttgttgcag tagttttcca attggtac 48 <210〉 10 <211> 647 <212〉 DNA <213〉 人工序列
<220〉
<221> misc_feature
<223>编码3拷贝胰岛素A链和3拷贝胰岛素B链的基因
<400〉 10
ccagatctgatgacgatgaceteiattcgttaaccaacacttgtgcggttcccacttggttg60
aggctttgtacttggtttgcggtga犯gaggtttcttctacactcctaagactaagagag120
ctgatgacgatgataagggtattgtcgaacaatgctgtacctccatctgctccttgtacc180
ctactgcaac卿agaggtggaggtggatctgatgacgatgacaaattcg240
11 aac c aac acttgtgcggttcccacttggttgaggctttgtacttggtttgcggtgaaa300
gaggtttcttctacactcctaagactaagagagctgatgacgatgat肌gggtattgtcg360
tacctccatctgctccttgtacc犯ttggaaaactactgc420
gtggaggtggatctgatgacg8Ltgaca犯ttcgttaaccaacacttgtgcggttcccact■
tggttgaggctttgtacttggtttgcggtgaaagaggtttcttctacactcctaagacta540
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tgtaccaattggaaaactactgcaacaagag鄉tggsggtggatcc647
<210〉 11
<211> 93
<212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature <223〉 C肽编码基因
<400〉 11
gaagctgaag atttgcaagt tggtcaagtt gaattgggtg gtgggcccgg tgctggttct 60 ttgcaaccat tggctttgga aaattctttg caa 9权利要求
1.一种连接肽，其特征在于，所述的连接肽具有如下的氨基酸序列X-Arg-Y-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys；其中，X选自Lys或Arg；Y为无或1-100个氨基酸构成的序列。
2. 如权利要求1所述的连接肽，其特征在于，Y为无或l-50个氨基酸构成 的序列。
3. 权利要求1所述的连接肽的用途，其特征在于，用于连接2个或多个目的 多肽以制备融合多肽；附加条件是目的多肽中不含有肠激酶、Kex2酶和羧肽酶B的酶切位点。
4. 一种DNA分子，其特征在于，所述的DNA分子编码权利要求1所述的连接肽。
5. —种融合多肽，其特征在于，所述的融合多肽含有以下结构Z0-(Z-Zl)n;其中，ZO表示第一目的多肽；Z表示权利要求1所述的连接肽； Zl表示相同或不同的第二目的多肽； n=l-99;所述的第一目的多肽和第二目的多肽是相同或不同的，且其中不含有肠激酶、 Kex2酶和羧肽酶B的酶切位点。
6. —种制备目的多肽的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤 在含有权利要求5所述的融合多肽的体系中加入肠激酶、Kex2酶和羧肽酶B，使融合多肽被肠激酶、Kex2酶和羧肽酶B酶切，形成目的多肽与连接肽片段的混 合物，以及从混合物中分离出目的多肽。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，酶切的温度为4-60。C。
8. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，酶切的ra值为4. 0-11.0。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，肠激酶、Kex2酶和羧肽酶B的加 入比例按照酶活为肠激酶Kex2酶羧肽酶B = (1-4): (1-4): (0.5-4)。
全文摘要
本发明公开了一种连接肽，所述的连接肽具有如下的氨基酸序列X-Arg-Y-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys。本发明还公开了一种含有所述连接肽以及目的多肽的融合多肽。本发明还提供了一种制备目的多肽的方法。本发明所述的连接肽在与目的多肽串联形成融合多肽后，可被肠激酶、Kex2酶和羧肽酶B三种酶酶切，从而形成不带有任何连接肽序列的目的多肽。
文档编号C12N15/11GK101172996SQ20071010344
公开日2008年5月7日 申请日期2007年5月10日 优先权日2006年9月29日
发明者军 任, 姚惠珍, 孙九如, 翊 张, 梁光军, 黄阳滨 申请人:上海新生源医药研究有限公司;上海新生源生物医药有限公司