专利名称：口蹄疫病毒双效疫苗载体、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组疫苗载体，尤其涉及一种具有基因治疗及基因免
疫作用的o型口蹄疫病毒双效疫苗载体，其制备方法以及该双效疫苗载体
在防治口蹄疫病毒中的用途，属于基因工程领域。
背景技术：
目前所有疫苗几乎都存在着时间长短不一的有效抗体产生期，即免疫
空白期，动物在这一时期遇到病原微生物的入侵往往会造成疫病流行；另 外，疫苗接种隐性感染的动物后还可能引起严重的临床反应甚至引起少数 动物死亡；如何使动物在免疫空白期免受病原的攻击、防止隐性感染期的 动物接种疫苗后发生严重的临床反应甚至死亡是亟需要解决的一个问题。
发明内容
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，构建一种 具有基因治疗及基因免疫口蹄疫病毒双重作用的0型口蹄疫病毒(FMDV) 双效疫苗载体。
本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的 一种具有基因治疗及基因免疫口蹄疫病毒双重作用的0型口蹄疫病
毒(FMDV)双效疫苗载体，主要由双顺反子表达载体序列组成，其中含有 能够与口蹄疫病毒基因组5'非编码区(UTR) RNA结合的反义基因序列和 完整的口蹄疫病毒VP1结构蛋白基因序列。
作为优选的，所述的双顺反子表达载体为pIRES，所述的能够与口蹄 疫病毒基因组5'非编码区RNA结合的反义基因序列是口蹄疫病毒基因片 段AsN。
更优选的，本发明0型口蹄疫病毒(FMDV)双效疫苗载体是pAsN-IR-VP1。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种构建上述0型口蹄疫 病毒(FMDV)双效疫苗载体的方法。
本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的
一种上述O型口蹄疫病毒(FMDV)双效疫苗载体的构建方法，包括 将针对FMDV 5' UTR的基因片段反向插入双顺反子表达载体的一个多克隆 位点上，将完整的VP1结构蛋白基因正向插入该双顺反子表达载体的另一 个多克隆位点上。
优选的， 一种上述O型口蹄疫病毒(FMDV)双效疫苗载体的构建方 法，包括将针对FMDV5' UTR的基因片段AsN反向插入双顺反子表达载 体pIRES的多克隆位点A，将完整的VP1结构蛋白基因正向插入双顺反子 表达载体pIRES多克隆位点B中。
本发明依据反义RNA能够通过结合正义的mRNA而阻止mRNA翻译成 蛋白质，从而抑制病毒复制，而核酸疫苗能诱导有效的细胞及体液免疫从 而保护动物免于特异性病原攻击的原理，构建了具有基因治疗及基因免疫 双重作用的0型口蹄疫(FMD)双效疫苗载体。在核酸疫苗产生有效的抗 体之前，利用反义核酸对病原的抑制作用，抵御在注苗前已隐性感染及外 侵的少量特异性病原对动物的危害，解决疫苗免疫空白期的问题。另外， 在特异性抗体产生以后，利用特异性抗体对病原的中和作用及反义核酸对 病原的抑制作用的双重功效达到增强疫苗免疫效力目的，通过双效载体转 染细胞，筛选稳定克隆及扩繁后试制疫苗及疫苗免疫动物后的抗体测定、 动物强毒攻击等试验，获得了较为理想的效果。
用脂质体介导法将本发明双效重组质粒转染入BHK-21细胞中，经 RT-PCR等检测表明本发明双效重组质粒反义RNA在细胞中得到了转录，病 毒抑制试验、蚀斑减少试验表明5' AsN转录子对同源病毒的复制能产生 有效的阻抑作用，转染24h后接毒，抑制率达60%以上。经夹心ELISA及 间接免疫荧光等试验表明本发明双效重组质粒VP1结构蛋白基因在BHK-21 细胞中得到了稳定表达，且有一定的生物学活性。
对经本发明双效质粒转染的细胞克隆经G418多次筛选后得到了稳
定抗性细胞株，经RT-PCR检测表明重组质粒能在BHK-21细胞中能稳定传 代。
大量提取本发明双效疫苗载体试制双效疫苗免疫小鼠后采血经 LBP-ELISA检测表明本发明双效疫苗能刺激机体产生抗体，二免三周时不 同批次小鼠的抗体效价为1: 32-1: 64; MTT法表明本发明双效疫苗载体
能诱导机体产生脾脏T淋巴细胞的增殖反应；免疫小鼠有效抗体的产生及
T淋巴细胞的增殖反应，证实了本发明双效疫苗载体具有基因免疫作用。 用本发明双效疫苗载体免疫乳鼠后6-12h，以20-100TCID5。强毒攻击，结果 该双效质粒能够保护乳鼠免于FMDV强毒攻击感染，保护率达到50%-83%， 说明本发明双效疫苗载体具有基因治疗作用。
图l 5'AsNPCR产物。
图2 VP1PCR产物。
图3 为重组质粒pAsN-IR的酶切及PCR鉴定图。
图4 为重组质粒pAsN-IR-VP1的酶切及PCR鉴定图。
图5为双效疫苗载体RT-PCR检测RNA的转录图。 1， 2:转染后24及48 h细胞液RT-PCR扩增5， AsN; 3: DL2000 Marker
图6为双效疫苗载体RT-PCR检测RNA的转录图。
1: DL2000 Marker.
2:稳定细胞液体扩VP1;
3:提取朋K细胞DNA扩 VP1;
4:阴性对照。
图7转染的BHK-21细胞间接免疫荧光染色结果。
A转染双效质粒；B:未转染细胞。
图8 SDS-PAGE及Western-blot检测结果。
1:细胞培养液上清；
2:经转染的细胞裂解液上清；
3， 10:低分子蛋 白Marker; 4， 5， 6， 7, 9经转染的细胞裂解液；8， BHK-21对照。
图9病毒抑制试验的细胞病变图及蚀斑减少试验结果 (A)第一排，IBRS-2细胞按100 TCIDs。的量接种FMDV OMIII毒:1. IBRS-2 对照；2，3，4及5:分别为IBRS-2细胞接毒后12，24，36， 48h;第二排
转染双效质粒后24h时按100 TCIDs。的量接种FMDV OMIII毒1. IBRS-2对 照；2,3，4及5:分别为转染细胞接毒后12，24，36, 48h; (B)蚀斑减少情况1. IBRS-2细胞对照；2.转染双效质粒后24h时按10TCID5。 的量接种FMDV OMIII毒的蚀斑形成情况；3及4:分别是以100TCID5。和 lOTCIDs。的量接毒后的蚀斑形成情况。
图IO小鼠脾淋巴细胞的增殖图。
图ll本发明双效疫苗载体的构建示意图。
具体实施例方式
以下通过具体实施方式
对本发明进行进一步说明。这里想要指出的 是，下面的具体实施方式
仅用来说明本发明，本领域技术人员在理解本发 明精神的前提下，可以根据本技术领域的现有技术和公知知识对本发明进 行相应变换，这些技术方案均落入本发明的范围之内。
实施例1
双效疫苗载体pAsN-IR-VPl的构建
一、制备目的基因
所设计的5' AsN片段及VPl结构蛋白基因的扩增引物为
AsNl :5，-gcgaattcatgccagcacggcaactttac-3'; (856-873 ) EcoRI
AsN2: 5 ，-ctagctagcgttgggcctggagtagaatg—3; (1200-1219) Nhel
XP1:5，-gcgt2gi^Ccaccatgcacgcagaccacctccac-3'; (3247-3264) Sail
XP2: 5，-gcgcggccgcttcacaggcgccacaatc -3， (3865-3882) Notl
其中，在AsNl及XP1上游引入起始密码子ATG，在其下游引物的3' 端引入终止密码子，同时在XP1上游加入Kozak序列等元件。以口蹄疫病 毒OMIII毒株(为中国农业科学院兰州兽医研究所分离、保存并经 BHK-21细胞传代增殖的细胞毒；该口蹄疫病毒OMIII毒株也可由其它
的口蹄疫病毒毒株来代替，本领域技术人员按照现有技术或文献所公开 的方法均可以分离或获得类似的口蹄疫病毒毒株，这些毒株均可替代口
蹄疫病毒OMIII毒株)为模板进行扩增(AsN基因片段的扩增程序94°C 预变性5min; 94°C， lrain; 58°C， 45s; 72°C 50s; 30个循环后，72 °C 延伸8 min。 VPl基因的扩增程序94"C预变性5 min; 94°C， lmin; 60 °C， lmin; 72°C lmin; 30个循环后，72 °C延伸8 min)。扩增后所得到 的PCR产物分别见图l和图2。
二、双效疫苗载体的构建
将5， AsN基因片段及VPl结构蛋白基因分别亚克隆到双顺反子表达 载体pIRES (购自Invitrogen生物公司)(双顺反子载体启动子为CMV; 终止子为polyA)的多克隆位点A及B中，构建成了 FMDV双效载体 pAsN-IR-VP1。
所述的双顺反子表达载体的构建包括以下操作
1) 将回收得到的目的基因5， AsN经EcoRI及Nhel双酶切，并纯化 回收目的片段；
2) 将双顺反子载体pIRES经EcoRI及Nhel双酶切，得到线性化的载
体；
3) 用T4 DNA连接酶对上述产物进行粘端连接；
4) 按常规方法将连接产物转化大肠埃希氏菌(JM109)，在氨苄抗性 的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，提取质粒；
5) 采用酶切、PCR扩增方法鉴定(图3)，得到阳性重组质粒pAsN-IR。
6) 目的基因VPl经Sal I及Not I双酶切后，形成带有粘性末端的目 的基因；
7) 将前面得到的pAsN-IR质粒经EcoRI及Nhel双酶切，得到线性化 的载体；
8) 连接、转化、挑选克隆、提取质粒，采用酶切、PCR扩增及DNA测 序等方法鉴定(图4)，得到双效疫苗载体pAsN-IR-VPl。
试验例1双效疫苗载体pAsN-IR-VP1体外表达的检测 一、用双效疫苗载体pAsN-IR-VPl转染BHK-21细胞 1)转染质粒的制备按照超纯质粒DNA制备试剂盒的操作步骤，无
菌提取质粒pAsN-IR-VPl。经琼脂糖凝胶电泳检测后鉴定质粒正确，分光光
度计确定DNA的含量及纯度；
2 )细胞转染BHK-21细胞用含6X小牛血清的DMEM培养液在37。C、
5%C02的培养箱中培养，待细胞长满时挑取生长状况良好的细胞经胰酶消
化，血细胞记数板记数后接种于6孔细胞培养板，用不含抗生素的完全培
养液37X:培养过夜；
3) 将脂质体(Lipofectamine 2000)悬液加至DMEM培养液中， 充分将二者混匀，室温下温育；在此期间吸弃细胞原培养液，用DMEM培
养液洗细胞一次；
4) 待细胞融合达50%-80%时，在Lipofectamine 2000介导下进行 转染，往每平皿加DNA/脂质体复合物，在5%(]02培养箱中温育后吸弃含 DNA/脂质体复合物的培养液，转染4 h后补加含5%血清无抗生素的DMEM 以维持细胞的正常生长。细胞对照孔内加入含相同浓度Lipofectamine1" 2000的MEM培养液。
5) 脂质体转染后用转染细胞进行稳定抗性细胞系的筛选及双效质 粒体外表达的检测等工作。
二、体外表达的检测
1、 用RT-PCR法检测重组质粒pAsN-IR-VP1中反义RNA部分在细胞中 的转录情况结果见图5;
2、 用pAsN-IR-VP1瞬时转染的BHK-21或筛选出的稳定细胞系进行病 毒抑制试验，以评价反义RNA转录子对病毒产生的抑制效果，主要包括以 下操作
①pAsN-IR-VPl转染细胞后24h按100 TCID50/0. lmL接种FMDV OMIII， 吸附lh后弃去细胞上清液，用DMEM洗涤细胞2次后加入含4 % FBS的DMEM继 续培养；
8
②于感染的不同时间取细胞上清，用BHK-21细胞检测不同时间所收 集细胞的病毒毒价(Bigeriego et al. ， 1999; Gutie'rrez et al. ， 1993)。 计算3次独立的病毒抑制试验抑制率的平均值，以空质粒转染细胞克隆作 为空白对照，计算病毒产生抑制率PI。
3、用pAsN-IR-VPl瞬时转染的BHK-21或用所筛选出的稳定细胞系进 行蚀斑减少试验，更直观地了解反义RNA转录子对病毒产生的抑制效果。 主要包括以下操作
① 按常规方法培养IBRS-2细胞；
② 无菌PBS洗涤细胞，按100 TCID50/0. lmL接种FMDV OMIII (200uL/ 孔，6孔板)，置于二氧化碳培养箱；
③ lh之后按2mL/孔加入overlay培养液(一份2XMEM， 一份1.2% agar)静置培养24-48h;
④ 吸弃培养液，加入冰冷的固定液(50%丙酮+50%甲醇)，-2(TC固定 lOminj
⑤ 加入结晶紫染色液约2mL，室温染色30min;
⑥ 蒸馏水冲洗，自然干燥后计数蚀斑数，获得病毒毒价。试验结果见 图9。
4、用双抗体夹心ELISA检测VP1结构蛋白基因在BHK-21细胞中的表 达情况主要包括以下操作
① 用重组双效质粒pAsN-IR-VPl转染BHK-21细胞，继续培养；
② 分别于24及48h时收取细胞，用0. 01M PBS液(pH7. 4)洗涤后胰 酶消化，离心后弃上清；细胞沉淀经裂解液裂解并离心，上清用于ELISA 检测。
③双抗体夹心ELISA法检测抗原96孔酶标板用FMDV兔阳性血清 (1:1000)包埋，4。C过夜，马血清封闭后，将FMDV抗原、转染质粒 pAsN-IR-VP1的细胞裂解液及未转染的空白对照细胞裂解液以2倍梯度稀 释，每个稀释度设两复孔，37°C温育lh后，洗涤后加入口蹄疫豚鼠阳性
抗血清(1:800) ， 37°C作用lh，洗涤后加入服P-兔抗豚鼠IgG (1:2000)， 37°C作用lh，加入底物0PD-HA于37°C作用15min，用终止液结束反应， 于入492nm处测定0D值。
5、间接免疫荧光试验检测VP1结构蛋白基因在BHK-21细胞中的表达 主要包括以下操作
① 收取培养皿中转染细胞生长密度达90%以上的盖玻片，0.01 mol/L PBS液(pH7. 4 )漂洗，固定30 min后PBS液漂洗；
② 滴加FMDV兔阳性血清(1:1000)，湿盒孵化30 min后加FITC-羊抗兔 IgG (1:40);
③ 染色30 min后PBS液漂洗，自然干燥后甘油封片于荧光显微镜下 观察，拍照。试验结果见图7。
试验例2稳定抗性细胞株的筛选与鉴定
稳定抗性细胞株的筛选过程包括以下操作DG418的浓度确定G418 的最适用量通过建立细胞死亡曲线获得，即将细胞稀释至1000 cell/mL， 每孔按100pL加入含有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0， 100， 200， 300， 400， 500， 600， 700， 800， 900， 1000， 1100pg/mL等 12个级别，继续培养3-4周，每3-4d换一次培养液，以最低细胞全部死亡 浓度为基准，建立细胞死亡曲线， 一般为400-800吗/mL左右，筛选时比 该浓度再高一个级别。选取B服-21细胞全部死亡孔G418的浓度为筛选 稳定抗性B服-21细胞的最适用量，最后筛选浓度确定为500|ig/mL，维持时 使用筛选浓度的一半即可。
2)稳定抗性细胞系的筛选:转染BHK-21细胞后待细胞生长接近融合 时按1:4密度传代，继续培养至细胞密度至50%-70%时弃培养液，更换为 500y g/mL的G418培养液进行筛选，同时用未经转染的正常细胞作对照， 当对照细胞大部分死亡时再更换一次筛选液，G418浓度可以降至 250 u g/mL，以维持筛选作用。约10-20d后，可见有抗性克隆形成，待其逐 渐增大后在镜下计数细胞，以细胞套管套住单克隆细胞岛后进行消化，将
消化下的细胞转移入96孔板培养细胞，每孔加100 u L完全培养液置C02 培养箱中孵育24 h后，每孔加入100uL工作浓度的G418选择培养液。 按此条件，每隔3-4d换液培养，14 21d后， 一些孔内可见细胞集落形 成。挑取集落转移至6孔板中培养，生长良好后，再转移至培养瓶中培 养。
3)稳定抗性细胞系的RT-PCR鉴定对经G418多次筛选后的BHK-21 细胞用胰酶消化后4000 r/min离心5min，弃上清后沉淀用细胞裂解液裂解 后反复冻融，再次离心后取上清进行PCR扩增，同时提取BHK-21细胞的DNA 也进行PCR扩增，看是否有目的基因的存在。对扩增得到的基因经纯化后 与Teasy载体连接，转化后挑斑提取质粒，经PCR及酶切鉴定后阳性克隆 测序，分析序列变异情况。
试验结果对用双效质粒pAsN-IR-VPl转染的细胞克隆经G418多 次筛选后得到了稳定抗性细胞株，经RT-PCR及蚀斑减少试验等检测表明 双效质粒能在BHK-21细胞中能稳定传代。对转染双效质粒pAsN-IR-VP1 的BHK-21细胞克隆经G418多次筛选后得到了稳定抗性细胞株，经RT-PCR 检测表明双效质粒能在BHK-21细胞中稳定传代。
试验例3动物免疫试验
1) 用0MEGA公司的E. Z. N. AFastfilterEndo-freePlasmidMaxi Kit 大量提取质粒pAsN-IR-VPl，方法参见试剂盒的操作步骤，分光光度计确 定DNA的含量及纯度。
2) 将24只5-6日龄小鼠随机分为4组(6只/组)，分为双效质粒 pAsN-IR-VPl免疫组、双效质粒pAsN-IR-VPl+利多卡因组、灭活疫苗组及 缓冲液对照组。第一次免疫后第四周加强免疫一次，第二次免疫后四周处 死小鼠。利多卡因组为注射质粒前一周注射利多卡因(4rag/Kg体重)，以 提高细胞对质粒DNA的摄取量，免疫后不同时间经尾静脉采血。
3)分离血清后以LBP-ELISA法检测小鼠血清抗体的产生情况，结果 见表l。
表l VP1特异性抗体的检测组别21天28 天14天(二21天(二28天(二
(一免)(一免)免)免)免)
本发明双效质1:2 1:21:41:8<1:4
粒
本发明双效质1:4 1:41:161:321:16
粒+
利多卡因
0型灭活疫苗1:4 1:12l:卯1:60<1:16
组
PBS<1:2 <1:2<1:2<1:2<1:2
4)于小鼠免疫前、 一免后28d及二免后21d采集小鼠脾脏淋巴细胞， 按MTT法进行T淋巴细胞增殖试验。
无菌制备小鼠淋巴细胞悬液，将细胞稀释成2xl(y个/mL的单细胞悬 液，加入96孔细胞培养板中，每孔加入50uL。然后加入50uLPHA溶液 (浓度500y g/mL)，设三复孔，另设对照孔，对照孔中不加单细胞悬液， 只加入RPMI 1640培养液，其余同单细胞悬液孔。细胞置40。C、 5% C02饱 和湿度条件下培养45h，然后每孔加MTT溶液(5 mg/mL) 10uL，继续培 养3h。取出后每孔加入10% SDS-O. Olmol/L HC1溶液100 yL，混匀后置 细胞培养箱中2h后取出，以对照孔调零，在X570nm处，测定每孔OD值， 结果以三个孔平均值表示，结果见图IO。
试验结果大量提取质粒pAsN-IR-VPl试制双效疫苗免疫小鼠后采血 经LBP-ELISA检测表明本发明双效疫苗pAsN-IR-VPl能剌激机体产生抗体， 二免3周时不同批次的抗体效价达1: 32-1: 64; MTT法检测表明本发明 双效质粒pAsN-IR-VP1能诱导机体产生脾脏T淋巴细胞的增殖反应；免疫 小鼠有效抗体的产生及T淋巴细胞的增殖反应，证实了本发明双效质粒pAsN-IR-VPl的基因免疫作用。
试验例3 乳鼠攻毒试验
用重组菌大量提取双效质粒pAsN-IR-VPl制成疫苗免疫动物或用 筛选出的稳定含有双效质粒pAsN-IR-VPl的BHK-21细胞制成疫苗进行动 物免疫。
先用3-4日龄的清洁级的乳鼠测定FMDV OM III毒的LD5()。随后 选用24只乳鼠进行攻毒试验，将乳鼠随机分为4组，本发明双效质粒 pAsN-IR-VPl免疫组及PBS对照组，按20LDso及1000)5()两个剂量攻毒。 对双效质粒pAsN-IR-VPl免疫组乳鼠先背部肌肉100pg/只的双效质粒 pAsN-IR-VPl， 6-12h后按20LD5()及100 LD5q的量经乳鼠背部皮下接种 lOOpL的OM III株细胞毒(g卩104及l(T3的病毒)，对照组也按两个攻毒剂 量攻毒，观察10天，计算乳鼠的保护率，试验结果见表2。
_表2乳鼠攻毒试验结果
组别 攻毒剂量(100pL)
率
缓冲液 10—3 本发明双效质粒免疫组 10—3
50%
缓冲液 10—4
本发明双效质粒免疫组 10—4 83%_
试验结果表明本发明双效质粒pAsN-IR-VP1对乳鼠的保护率达到50 %-83%，表明本发明双效疫苗对口蹄疫病毒具有显著的基因治疗作用。
死亡比率 保护
权利要求
1、O型口蹄疫病毒双效疫苗载体，主要由双顺反子表达载体序列组成，其特征在于含有能够与口蹄疫病毒基因组5’非编码区RNA结合的反义基因序列和完整的口蹄疫病毒VP1结构蛋白基因序列。
2、 按照权利要求l的O型口蹄疫病毒双效疫苗载体，其特征在于所述的双 顺反子表达载体为pIRES;所述的能够与口蹄疫病毒基因组5'非编码区RNA结合 的反义基因序列是口蹄疫病毒基因片段AsN。
3、 按照权利要求l的O型口蹄疫病毒双效疫苗载体，其特征在于所述的双 顺反子表达载体是pAsN-IR-VPl。
4、 权利要求l的O型口蹄疫病毒双效疫苗载体的构建方法，包括将针对口 蹄疫病毒5'非编码区RNA的基因片段反向插入双顺反子表达载体的一个多克隆位 点上，将完整的VP1结构蛋白基因正向插入该双顺反子表达载体的另一个多克隆位 点上。
5、 权利要求3的0型口蹄疫病毒双效疫苗载体pAsN-IR-VPl的构建方法，包 括将针对口蹄疫病毒5'非编码区RNA的基因片段AsN反向插入双顺反子表达载 体pIRES的多克隆位点A，将完整的VP1结构蛋白基因正向插入双顺反子表达载体 pIRES多克隆位点B中。
6、 一种治疗和预防口蹄疫病毒的分子疫苗，含有免疫或治疗上有效量的权利 要求1的0型口蹄疫病毒双效疫苗载体和药学上可接受的载体或辅料。
7、 权利要求1-3任意一种所述的0型口蹄疫病毒双效疫苗载体在制备口蹄疫 病毒药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种口蹄疫病毒双效疫苗载体以及该双效疫苗载体的构建方法和用途。本发明口蹄疫病毒双效疫苗载体主要由双顺反子表达载体序列组成，其中含有能够与口蹄疫病毒基因组5’非编码区RNA结合的反义基因序列和完整的口蹄疫病毒VP1结构蛋白基因序列。动物试验表明，本发明口蹄疫病毒双效疫苗在动物口蹄疫的防制方面具有基因治疗及基因免疫双重功效。
文档编号C12N15/63GK101195831SQ20071010308
公开日2008年6月11日 申请日期2007年5月28日 优先权日2007年5月28日
发明者喜 兰, 刘兆弼, 方玉萍, 李学瑞, 李宝玉, 李志勇, 彬 杨, 柳纪省, 殷相平, 韩晓荣 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所