专利名称：一种重组抗tnfr单克隆抗体及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗体技术领域。具体地说，本发明涉及一种新的重组抗肿瘤坏死因子受体单克隆抗体，及其制备方法和用途。
背景技术：
肿瘤坏死因子(TNF)是机体内的一种多功能免疫调节分子，它可以和细胞膜上的受体结合发挥作用，往往引起靶细胞的死亡(它的名称即来源于此)或招引免疫效应细胞在局部的聚集。国外对类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)的发病机理进行研究发现，肿瘤坏死因子a(TNF-a)在该疾病的病理进程中起十分关键的作用，患者或动物模型病变关节腔内的TNF水平异常升高(FeldmanM，Brennan FM，Maini RN.The role of cytokines in rheumatoid arthritis.Ann RevImmunol 1996；14397；Grom A，Murray KF，Luyrink L等，Patterns of expression oftumor necrosis factor a tumor necrosis factor f3，and their receptors in synovia ofpatients with juvenile rheumatoid arthritis and juvenile spondyloarthropathy.ArthritisRheum 1996，391703；Saxne T，Palladino Jr MA，Heinegard D等，Detection oftumor necrosis factor alpha but not tumor necrosis factor beta in rheumatoid arthritissynovial fluid and serum.Arthritis Rheum 1998；311041；Klareskog L和McDevittH，Rheumatoid arthritis and its animal modelsthe role of TNF-a and the possibleabsence of specific immune reactions.Current Opinion in Immunology，1999；11657-662)。TNF在关节腔内的含量大量升高，一方面和关节滑膜细胞的受体结合造成该细胞直接损伤，另一方面，它可以召集免疫效应细胞聚集至此，分泌更多的细胞因子，产生更强更持久的自身免疫反应。在RA病患部位有过量的TNF-a表达，是造成患病部位肿胀和疼痛的主要因素之一。
而且有大量研究表明，TNF还是引起脓毒性休克综合症的主要介质。脓毒性休克综合症患者血清中TNF-a水平升高预示着死亡率或致残率升高。被动输入TNF-a的拮抗剂可以防止LPS和细菌引起的休克合组织损伤，临床上应用TNF-a抗体或者其受体对类风湿关节炎和脓毒性休克综合症有一定疗效。
对TNF受体(TNFR)的研究表明，有I型、II型两种肿瘤坏死因子受体，均为I型跨膜糖蛋白。其中以II型分布更为广泛，与肿瘤坏死因子的亲和力更强。两种受体虽然需位于细胞膜上才可以发挥向细胞内传递信号的功能，但仍有部分从细胞表面脱落至体液内，称为可溶性受体。进一步的研究表明，这种可溶性的受体可以中和TNF，在体内对TNF的活性起负调节作用(Smith CA，Farrah T，Goodwin RG.The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteinsactivation，costimulation，and death.Cell 1994；75959)。
为了能够针对TNF特异性地治疗RA，国外采用了另一项将基因工程和免疫学技术结合起来的技术，即受体一免疫球蛋白融合技术，又称“免疫黏附”技术(Immuno-adhesion Technology)。它的原理是利用基因工程技术，将受体的细胞外区与免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)的可结晶片段(Fc段)基因融合，在体外表达出相应的融合蛋白，这种融合蛋白既保留了原受体可以和配基特异性结合的性质(“黏附”特性，在此产品中为中和体内TNF的活性)，也具有免疫球蛋白的体内半衰期长、组织穿透力强等特性，又被称为“免疫黏附素”。该融合蛋白虽为人工制造的新的蛋白分子，但由于它的两个组成部分都是体内原有成分，所以不会引起免疫反应。用这种技术生产的II型TNFR-Fc融合蛋白在RA的动物模型和临床试验中取得了比其它常规药品好得多的疗效，而且副作用轻微所以它的二级结构为多个同源性结构(CH样结构)，链内形成二硫键。它可以特异性地与体内的TNF-α结合，从而抑制关节处的炎症反应。
在TNFR-Fc融合蛋白进行临床前研究及临床研究的过程中，以及将来成为药物后患者应用的过程中，均需要检测受试者(动物或人)或患者的血清TNFR-Fc融合蛋白浓度，在某些造血系统的恶性疾患中，TNFR可能会异常高表达，因此，在这类患者的诊疗过程中，也需要检测患者血清中TNFR浓度。所以迫切需要一种能有效、快速检测TNFR-Fc融合蛋白类药物及TNFR的产品。
发明内容
本发明需要解决的技术问题之一是提供一种重组的抗肿瘤坏死因子受体单克隆抗体，该抗体用于体外检测TNFR的浓度。
本发明需要解决的第二个技术问题是提供一种编码上述抗肿瘤坏死因子受体单克隆抗体的DNA分子。
本发明需要解决的第三个技术问题是提供一种表达载体。
本发明需要解决的第四个技术问题是提供一种真核宿主细胞。
本发明需要解决的第五个技术问题是提供一种上述单克隆抗体的用途。
本发明需要解决的第六个技术问题是提供一种该单克隆抗体的制备方法。
为达到上述发明目的，本发明一方面提供了一种重组的抗肿瘤坏死因子受体抗体，该抗体含有重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链可变区具有SEQID NO1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
本发明另一方面提供了编码上述单克隆抗体的DNA分子。
在一个较佳的实例中，该DNA分子含有SEQ ID NO3所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO4所示的编码所述单抗重链可变区的核昔酸序列。
本发明第三方面提供了一种表达载体，该表达载体含有上述DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。
本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其特征在于，它被上述表达载体转化。在一个较佳的实例中，该宿主细胞是CHO细胞。
本发明第五方面提供了一种重组的抗肿瘤坏死因子受体抗体检测TNFR浓度的方法，其特征在于，所述的方法为常规的ELISA法。
本发明第六方面提供了一种制备上述单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括a)提供一表达载体，该表达载体含有上述DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；c)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和
d)分离纯化获得所述单克隆抗体。
本发明提供的一种重组的抗肿瘤坏死因子受体抗体可以在体外检测TNFR的浓度，该抗体可用于制备检测试剂或者检测试剂盒。
本发明的优点在于本发明的单克隆抗体能在TNFR-Fc融合蛋白进行临床前研究及临床研究的过程中，以及将来成为药物后患者应用的过程中，快速检测受试者(动物或人)或患者的血清TNFR-Fc融合蛋白浓度；同时在某些造血系统的恶性疾患中，异常高表达TNFR，本发明提供的单克隆抗体在这类患者的诊疗过程中，也能快速检测患者血清中TNFR浓度。本发明抗体用ELISA法检测TNFR-Fc融合蛋白特异性强、灵敏度高，显著优于市售抗体。本发明抗体阻断TNF-α杀伤靶细胞的能力更强，抗体活性显著高于市售抗体。
图1载体pMG18，并且标明了其中的元件及酶切位点，其中，hCMV pro为人巨细胞病毒主要早期启动子；Ck为人κ轻链恒定区基因；IgG1恒定区为人γ1重链恒定区基因；pA为多聚腺苷化信号；DHFR为二氢叶酸还原酶基因；AmpR为氨苄青霉素抗性基因。
图2本发明所构建的pM载体，其中，Ck仍为人κ链(轻链)恒定区基因，IgG1 constant为小鼠γ1重链恒定区基因。
图3本发明所构建的pM(H+L)载体，含有重组抗TNFR抗体重链全长和轻链全长基因。
图4本发明抗TNFR单克隆抗体与市售抗体分别用于检测rhTNFRFc融合蛋白的灵敏度比较结果(■为本发明的单克隆抗体，○为市售抗体，以下同)。
图5本发明抗TNFR单克隆抗体与市售抗体分别用于阻断TNF杀伤靶细胞功能检测的比较结果。
具体实施例方式
本发明涉及一种重组的抗TNFR单克隆抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链可变区具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。例如，单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等，Nature，256495(1975)首先提出)制得，或用重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)制得。单克隆抗体也可用例如Clackson等，Nature，3 52624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体库中分离获得。
本发明还提供了编码本发明重组抗TNFR单克隆抗体的DNA分子。在一个较佳的实例中，该DNA分子含有SEQ ID NO3所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO4所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。
在获得编码本发明重组抗TNFR单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列后，通常可通过以下方法来制备本发明的单克隆抗体。
首先，提供含有编码本发明单克隆抗体的核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列的表达载体。
编码本发明单克隆抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段来制得。例如，可根据本发明公开的序列人工合成或用PCR法扩增得到编码该单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列。然后，用本领域熟知的各种方法通过选择合适的酶切位点将这些核苷酸序列插入合适的表达载体中，使它们分别在表达载体所携带的重链恒定区编码序列和轻链恒定区编码序列之前，并使它们在同一读框内。
本发明中所用的表达载体是本领域技术人员已知的各种市售的表达载体，例如购自Qiagen和Promega公司的表达载体，以及可购得的表达载体pMG 18(《根据INCP-9质粒序列进行环境监测的工具的开发》(DEVELOPMENT OFTOOLS FORENVIRONMENTAL MONITORING BASED ON INCP-9PLASMIDS SEQUENCES)，A.Created，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.ThomasSchool of Biological Sciences，University of Birmingham，Edgbaston，Birmingham B15 2TT，UK and Faculty of Biology，Dept of Microbiology，Belarus State UniversityScoring Av.4，Minsk 220080 Belarus)。
随后，用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。“宿主细胞”一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。在本发明中，较佳的宿主细胞是CHO细胞。用表达载体转化宿主细胞的方法有很多种，所用的转化程序取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的力一法是本领域所知的，其包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、Polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)介导转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体介导转染以及将DNA直接显微注射到胞核中。在本发明中，较佳的方法是电穿孔法或脂质体介导法等。例如可采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒来转染CHO细胞。
然后，在适合本发明单克隆抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose，轻基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的重组抗TNFR单克隆抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等，Anal.Biochem.，107220(1980)的Scatchard分析来测定。
下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。
实施例中未标明来源的均为市售。
实施例1从抗体库中筛选sTNFR的抗体基因可变区1)鼠源抗体库的构建TNFR-Fc融合蛋白(R&D产品，726R2)与弗氏佐剂免疫Balb/C小鼠，免疫4次后，小鼠血清1∶500稀释后与TNFR-Fc融合蛋白显强阳性反应，取免疫后小鼠脾脏，按照Marks等人J.Mol.Biol.，222，581-597.Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227，381-388.Haidaris CG等人J lmmunol Methods.2001 Nov1；257(1-2)185-202，Griffiths，A.D.等人EMBO J.，13，3245-3260(1994).Nissim，A.等人EMBO J.，13，692-698(1994)中描述的方法，构建鼠源抗体库。
2)筛选将复苏的抗体库菌株1毫升加入新鲜LB培养基14毫升，于50毫升三角瓶中37℃培养16小时。
12000rpm高速离心10分钟，将上清液转移至无菌的50毫升离心管中，保存备用。确保其滴度应在2×1011以上。首先用人IgG1作为抗原，常规方法包被25毫升细胞培养瓶。包被后的细胞瓶中加入不少于3×1010噬菌体，37℃温育1小时。收集培养瓶中的上清液，备用。TNFR-Fc融合蛋白作为抗原，用常规方法包被25毫升细胞培养瓶。包被后的细胞瓶中加入上步收集的上清液，37℃温育1小时。倒掉瓶中的液体，用10毫升加入了1％Tween-20的PBS洗涤培养瓶10次。在培养瓶中加入1毫升对数期的TG1细胞，37℃温育震荡培养16小时。
重复上段所述步骤4次。
将上述获得的细胞稀释至105细胞/毫升后在加有0.1氨苄青霉素的1.5％琼脂平板上培养，获得单克隆。
取上述平板上的克隆在96孔深孔板上进行培养，每孔一个克隆，共作960个克隆(10块96孔板)。
将上述深孔板在96孔板离心机上5000RPM离心20分钟后，将上清转移到新的无菌深孔板，封口后保藏于4℃备用。
取96孔板10块，每孔中加入TNFR(R&D产品，1089-R2/CF，10微克/毫升)10微升常规包被后，分别加入上述保存的上清10微升，37℃温育1小时后用含有1％Tween-20的PBS洗涤20次。加入1微升HRP标记的羊抗M13单抗(购自Pharmacia公司)，37℃温育30分钟后用1％Tween-20的PBS洗涤10次。
加入含有0.025％DAB显色剂的PBS 200微升和1微升1％的H2O2，37℃温育显色20分钟后在读板机上读取595纳米处的光吸收。
根据光吸收读数确定显色反应强的孔，这些孔相对应的克隆即为亲和力较强的抗体可变区克隆。本试验结果共筛选出316个阳性克隆，根据其读数确定其中5个亲和力最强的克隆，用于下一步的研究。
3)抗体可变区编码序列向表达载体的克隆使上述5个克隆的菌株在100毫升LB培养基中扩增，然后按照生产商说明书用Promega公司的质粒DNA抽提纯化试剂盒(WizardPlus SV Minipreps DNAPurification System)纯化质粒DNA。
用XbaI和NheI限制性酶酶切上述质粒DNA后在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离酶切片段，取360bp左右的带进行胶回收，所得片段即为重链可变区。PCR扩增后，进行序列测定。用XbaI和BsiWI限制性酶酶切上述质粒DNA后在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离酶切片段，取333bp左右的带进行胶回收，所得片段即为轻链可变区。PCR扩增后，进行序列测定。确定正确序列后，化学合成法合成轻链全长序列，5’端设计HindIII酶切位点，恒定区为小鼠κ轻链恒定区序列，3’端设计EcoRI酶切位点。
PCR法自小鼠脾细胞扩增IgG1重链恒定区序列，并将CH1起始氨基酸突变为Ala-Ser，同时含有了NheI酶切位点，3’端设计BamHI酶切位点，扩增后测序验证无误后，NheI和BamHI双酶切小鼠IgG1恒定区片段和pMG18，将小鼠IgG1恒定区连入pMG18，构建的新载体命名为pM，如图2所示。
用XbaI和NheI限制性酶酶切表达载体pM。该表达载体的酶切图谱如图2所示。然后将上述重链可变区插入该表达载体的XbaI/NheI位点中。同样，利用HindIII和EcoRI限制性酶将抗体轻链全长cDNA插入到pM载体的HindIII/EcoRI位点中，从而构建得到含有重组抗sTNFR抗体重链全长和轻链全长基因的表达载体pM(H+L)，如图3所示。
4)CHO细胞的转染与重组克隆的筛选上述构建的带有抗体基因的表达载体分别转化大肠杆菌DH5α菌株中接种于100毫升LB培养基中进行扩增，用Qiagen公司的超纯质粒DNA纯化试剂盒(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)抽提纯化质粒DNA。采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒(lipofectamine 2000 transfection reagent，11668-027)，将上述纯化的质粒DNA转染CHO细胞，操作参照厂家的说明书进行。
转化的CHO细胞在MTX选择培养基上进行连续9周的选择，最后在96孔板上进行极限稀释培养，连续进行3次，进行单克隆化。
挑出的单克隆细胞系在RPMI 1640培养基上进行培养，对上清进行Western印迹试验，根据染色反应判断表达强度，挑选出12个表达强的克隆作为候选细胞株。
5)单克隆抗体的纯化用ProteinA亲和层析柱从细胞培养上清中直接分离纯化出上述单克隆抗体，经SDA-PAGE电泳证明，所得产物纯度大于90％。亲和层析的产物再次经过分子筛(Sephadex G200)层析，获得了纯度大于98％的样品。将这些样品用于以下的进一步分析与研究中。
实施例2抗体基因在CHO细胞中的表达强度将上述筛选得到的12个高表达候选克隆培养于10cm的组织培养皿中，如下所述用ELISA法测定抗体的表达量。将羊抗鼠IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，经2％BSA于37℃封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(鼠IgG1)，37℃孵育2小时，加入HRP-羊抗鼠IgG(κ)进行结合反应，37℃孵育1小时，加入TMB于37℃作用1 0分钟，最后用H2SO4终止反应，测A450值。下表1中显示了上述筛选获得的12个候选克隆的表达量。
表1喉选克隆在CHO细胞中的表达量
从上表1可以看出，4D7，9A1和1A2具有很高的表达水平。
实施例3抗TNFR单克隆抗体基因的DNA测序根据系谱，对上述获得的4D7细胞株的抗肿瘤坏死因子受体抗体基因进行DNA测序。结果如下SEQ ID NO3显示了其轻链可变区基因序列(5’到3′)333bp其推测的氨基酸序列显示在SEQ ID NO1中；SEQ ID NO3显示了4D7重链可变区基因序列((5，到3′)360bp)，其推测的氨基酸序列显示在SEQ ID NO2中。
实施例4单克隆抗体亲和力研究按以下方法对各克隆的细胞培养液进行纯化。10000rpm离心除去细胞和细胞碎片，100Kd截留分子量的滤膜超滤浓缩至1/10体积，超滤缓冲液是100mMTris-HCl，pH7.5。过SPA-sepharose亲和层析柱，上样液为100mM Tris-HCl，pH7.5，洗脱液为20mM柠檬酸，pH3.0，100mM NaCl。分子筛(Sephadex G200)层析。洗脱液为100mM Tris-HCl，pH7.5，得纯品。
亲和力测定采用Scatchard分析法(Munson等人，1980，Anal.BioChem.，107220)进行。结果表明，4D7，9A1和1A2三种单抗的亲和力分别达到6.2×10-10，3.68×10-9和8×10-7。
实施例5抗TNFR单克隆抗体检测rhTNFRFc以及与市售抗体的比较1.试剂和材料1.1抗TNFR抗体本发明构建的工程细胞(4D7)经无血清发酵，proteinA亲和层析纯化获得。
1.2抗TNFR抗体R&D产品，MAB726。
1.3重组人TNFR-Fc融合蛋白R&D产品，726-R2。
1.4羊抗人IgG(H+L)多抗，HRP标记，稀释度1∶1000-4000，Southern Biotech。
1.5 HRP显色底物TMB，上海科华公司，分A液及B液，临用前，两者等体积混合。
1.6终止液0.5mol/L硫酸。
1.7pH＝7.2的PBS称取KH2PO40.21g，NaCl 9.0g，Na2HPO4.12H2O 0.97g，加注射用水溶解至1000ml。
1.8包被缓冲液20mmol/l pH＝9.6的碳酸钠缓冲液。
1.9封闭缓冲液称取3g牛血清白蛋白，加入pH7.2的PBS溶解至100ml。
1.10洗涤缓冲液取1ml Tween20，加入PBS至1升。
1.11酶标仪。
1.12低吸附96孔酶标板Nunc。
1.13其它多道加样器、吸嘴等2.方法夹心ELISA法2.1小鼠抗TNFR抗体(本发明)及市售同类抗体(MAB726)稀释于包被缓冲液中，浓度2μg/ml，包被96孔酶标板，0.1ml/well，37℃ 2h。
2.2洗涤洗涤缓冲液洗涤2遍，每次均在吸水纸上拍干。
2.3封闭封闭缓冲液加满孔后37℃ 2h。
2.4洗涤洗涤缓冲液洗涤3遍，每次均在吸水纸上拍干。
2.5加抗原加入用封闭缓冲液稀释至100，50，25，12.5，6.25(pg/mL)的TNFR-Fc融合蛋白，0.1ml/well，设2复孔。
2.6 37℃ 2h。
2.7洗涤洗涤缓冲液洗涤5遍，每次均在吸水纸上拍干。
2.8加入HRP标记的羊抗人IgG二抗加入用PBS 1∶2000稀释的二抗，37℃ 1h。
2.9洗涤洗涤缓冲液洗涤5遍，每次均在吸水纸上拍干。
2.10显色加显色底物100μL/孔，避光显色5～20min(显色时间视显色情况而定)，加终止液50μL/孔。
2.11酶标仪读数测量450nm光吸收，以630nm为参考波长。
2.12用标准品浓度(对数)与A450/630nm值做直线回归方程。
本发明抗体用该法检测TNFR-Fc融合蛋白灵敏度高，可以达到6.25pg/mL，特异性强，而市售同类抗体检测TNFR-Fc融合蛋白灵敏度只有0.6ng/ml。本发明抗体的灵敏度为市售抗体的100倍，如图4所示。
实施例6抗TNFR单克隆抗体阻断TNF杀伤靶细胞功能检测以及与市售抗体的比较1.材料和试剂1.1测活细胞株L929细胞，用含10％新生小牛血清的RPMI-1640培养液传代培养。
1.2TNF-αR&D，210-TA/CF。
1.3放线菌素D上海华美生物工程公司产品。
1.4抗TNFR单克隆抗体及市售同类抗体同实施例5。
1.5试剂盒使用CellTiter 96 Aqueous非同位素细胞增殖试验试剂盒(Promega公司产品，Catalog#G5430)检测细胞活力。
2.方法1.对数生长期的L929细胞，胰蛋白酶消化，计数，调整细胞密度至1.5×105/ml，加入96孔培养板中，0.1ml/孔，培养过夜(18-24h)。
2.次日用12mL培养液稀释放线菌素D至浓度为4μg/mL，加入TNF-α至浓度为1ng/mL。
3.培养液2倍比梯度稀释抗TNFR抗体及市售同类抗体。
4.在接种L929细胞的培养板中，加入步骤2的培养液0.05mL/well，再分别加入步骤3的序列稀释液0.05mL/well，均设置复孔。
5.终点测定孵箱中培养14～16h后，加入新鲜配制的显色液20μL/孔，继续培养2小时，用酶标仪测量其A490-A630值。
3.结果分析采用4参数Logistic回归模型拟合标准曲线。
该软件给出的回归方程为Y＝(A-B)/[1+(X/C)D]+B根据该方程，X＝+∞时，Y＝B，即最高限；当X＝0时，Y＝A，即最低限；而当X＝C时，Y＝(A+B)/2，即半数有效。因此C的数值即为半数有效浓度(ED50)。
本发明抗体阻断TNF-α杀伤靶细胞的能力更强，ED50值为0.01μg/mL，而市售同类抗体MAB726ED50值为1μg/mL，即本发明抗体活性为MAB726的100倍，如图5所示。
本发明抗体具有特异性强、亲和力高的优点，作为检测抗体，灵敏度高于市售抗体，与市售抗体比较具有显著进步，因此，可以替代市售抗体用于制备检测TNFR浓度的试剂。
此外，市售的检测试剂盒通常是利用ELISA双抗体夹心法原理，预先将抗体包被于试剂盒中，用于检测相应的抗原物质，这种方法更加简便、快速。因此，本发明抗体也可以替代现有检测试剂盒中的包被抗体，用于制备检测TNFR浓度的试剂盒。
序列表<110>上海中信国健药业有限公司<120>一种重组抗TNFR单克隆抗体及其制备方法和用途<150>CN200610026638.8<151>2006-05-17<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>111<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(111)<223>轻链可变区氨基酸序列<400>1Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Thr Asp Ser Arg Ser20 25 30Ala Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Gly Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His65 70 75 80Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Ser Cys Pro His Arg Ser85 90 95Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110
<210>2<211>120<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(120)<223>重链可变区氨基酸序列<400>2Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30Trp Thr Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Glu Ile Ser Pro Gly Asn Ser Leu Thr Ser Tyr Asn Arg Thr Phe50 55 60Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr His Cys85 90 95Ala Arg Leu Ala Cys Arg Asp Leu Val Ala Ala His Ala Ile Ser Ser100 105 110Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val115 120<210>3<211>333<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(333)<223>轻链可变区核苷酸序列<400>3gacattcaaa tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60atctcatgca gggccagcaa aactgacagt agatctgcct atagttatat gcactggtac120caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtggatccaa cctagaatct180ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat240cctgtggagg aggaggatgc tgcaatctat tcatgtccgc acagaagcga gcttccttac300acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 333<210>4<211>360<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(360)<223>重链可变区核苷酸序列<400>4caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaaagtg 60tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc aactactgga catactgggt gaagcagagg120cctggacagg gccttgagtg gattggagag attagtcctg gcaacagtct tactagctat180aataggacct tcaagaccaa ggccacactg actgtagaca aatcctccaa cacagcctac240atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct atcactgtgc aagattagcc300tgcagggacc tagtcgccgc tcacgcaatc tcctcagcca aaacaacacc cccatcggtc360
权利要求
1.一种重组抗TNFR单克隆抗体，它包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链可变区具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ IDNO2所示的氨基酸序列。
2.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，该DNA分子含有SEQ ID NO3所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO4所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。
4.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。
5.一种真核宿主细胞，其特征在于，它被权利要求4所述的表达载体转化。
6.根据权利要求5所述的真核宿主细胞，其特征在于，它是CHO细胞。
7.一种利用权利要求1所述的单克隆抗体检测TNFR浓度的方法，其特征在于，所述的方法为ELISA法。
8.一种制备权利要求1所述的单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括a)提供一表达载体，该表达载体含有权利要求2所述的DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；b)用步骤a)所述的表达载体转化真核宿主细胞；c)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤b)所得的真核宿主细胞；和d)分离纯化获得所述单克隆抗体。
9.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测TNFR浓度的试剂中的应用。
10.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测TNFR浓度的试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种重组抗TNFR单克隆抗体，轻链可变区具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本发明还公开了编码该抗体的DNA分子，表达该抗体的载体以及被该表达载体转化的真核宿主细胞。本发明提供的抗TNFR单克隆抗体能在TNFR－Fc用药过程中快速检测受试者血清中TNFR－Fc浓度，同时也能快速检测患有某些造血系统的恶性疾患的患者血清中TNFR浓度。
文档编号C12N15/85GK101074265SQ20071010149
公开日2007年11月21日 申请日期2007年4月23日 优先权日2006年5月17日
发明者郭亚军, 钱卫珠, 寇庚, 候盛 申请人:上海中信国健药业有限公司