专利名称：一种毕赤酵母整合载体的构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质表达基因工程领域，尤其是利用毕赤酵母作为细胞工厂表达外源基因的研究领域。
背景技术：
甲醇酵母基因表达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生产系统。甲醇酵母是可利用甲醇作为唯一碳源的酵母，其中Pichia Pastoris作为基因表达系统使用得最多、最广泛。与其它基因表达系统相比，它的基因操作相对简单、外源蛋白的超高量表达、易于工业化生产、能够完成真核系统蛋白的蛋白水解成熟、糖基化修饰和二硫键形成等翻译后的修饰加工过程，已被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的表达系统之一。Lopes等构建了一种新的可稳定整合到S.cerevisiae染色体rDNA位点的载体，在基因组中载体以多拷贝顺序重复的形式整合(Lopes TS，Klootwijk J，Veenstra AE，van derAar PC，van Heerikhuizen H，Raue HA，Planta RJ.High-copy-numberintegration into the ribosomal DNA of Saccharomyces cerevisiaea new vectorfor high-level expression.Gene.1989，79(2)199-206.)。这种载体的特点就是用部分rDNA序列代替了常用的2-μm DNA或CEN/ARS序列。随后的系列研究表明利用rDNA进行整合也可应用到其它酵母中，例如K.lactis(Bergkamp RJ，Kool IM，Geerse RH，Planta RJ.Multiple-copy integration ofthe alpha-galactosidase gene from Cyamopsis tetragonoloba into the ribosomalDNA of Kluyveromyces lactis.Curr Genet.1992，21(4-5)365-370)，Arxulaadeninivorans(Terentiev Y，Pico AH，Boer E，Wartmann T，Klabunde J，Breuer U，Babel W，Suckow M，Gellissen G Kunze G.A wide-range integrative yeastexpression vector system based on Arxula adeninivorans-derived elements.J IndMicrobiol Biotechnol.2004，31(5)223-228)，Yarrowia lipolytica(Juretzek T，LeDall M，Mauersberger S，Gaillardin C，Barth G，Nicaud J.Vectors for geneexpression and ampiification in the yeast Yarrowia lipolytica.Yeast.2001，18(2)97-113.)，Candida utilis(Kondo K，Saito T，Kajiwara S，Takagi M，MisawaN.A transformation system for the yeast Candida utilisuse of a modifiedendogenous ribosomal protein gene as a drug-resistant marker and ribosomalDNA as an integration target for vector DNA.J Bacteriol.1995，177(24)7171-7177.)，Phaffia rhodozyma(Wery J，Gutker D，Renniers AC，Verdoes JC，van Ooyen AJ.High copy number integration into the ribosomalDNA of the yeast Phaffia rhodozyma.Gene.1997，184(1)89-97)，Hansenulapolymorpha(Klabunde J，Hollenberg CP，Gellissen G.Impact of overexpressedsecretory-pathway genes on the secretion of IFN gamma in Hansenulapolymorpha applying an rDNA-cointegration approach for assessment.FEMSYeast Re.s2005.)。由于rDNA的高度保守性，特定的rDNA序列也可用于多种表达宿主的转化和整合。但至今未见rDNA序列在毕赤酵母表达载体中的应用。
发明内容
针对目前未见毕赤酵母rDNA序列在毕赤酵母表达载体中的应用的现状。本发明将毕赤酵母的部分rDNA序列添加到目前常用的毕赤酵母整合表达载体中，获得了一种能够显著提高整合载体转化效率的载体。
本发明提供了重组表达载体的构建，通过将毕赤酵母的部分rDNA序列添加到毕赤酵母整合表达载体中而获得。
本发明提供了，将毕赤酵母的部分rDNA序列添加到毕赤酵母整合表达载体中获得了一种载体具体步骤1、毕赤酵母的部分核糖体DNA(ribosome DNA，rDNA)序列的克隆；2、整合载体的构建；3、转化酵母，运用PCR检测转化阳性克隆数验证获得转化。
具体的，本发明的完成包括以下几个步骤1、毕赤酵母的部分核糖体DNA(ribosome DNA，rDNA)序列的克隆依据rDNA序列的保守性，根据S.cerevisiae的25S和18S保守序列设计引物，以毕赤酵母基因组为模板进行扩增，获得包含有部分25S、完整5S及NTS序列的2.8kb对应序列，将扩增获得的序列连接入pMD18-T载体并测序，确定相应的DNA序列，参见SEQUENCE LISTING。
2、整合载体的构建将经过测序的rDNA序列连入常用的表达载体pPIC9K经BgLI I酶切，获得6.8kb左右的片段与pGAPZαA经BgLII/BamHI酶切获得的1.9kb片段连结获得pPIC9k-zeocin载体；将pPIC9k-zeocin载体用BgLII线化，碱性磷酸酶脱磷酸化处理，连入BgLII/BamHI酶切的25S序列，构建成功pPIC9k-zeocin-25S载体。以绿色荧光蛋白(GFP)为指示蛋白，将mGFP PCR扩增经EcoRI/NotI酶切连入相同酶切的pPIC9k-zeocin-25S和pPIC9k-zeoci载体，构建成含有rDNA序列的新载体pPIC9K-zeocin-25S-GFP载体和pPIC9K-zeocin-GFP，参见附图1、2。
3、转化酵母，以线化的pPIC9K-zeocin-25S-GFP载体和pPIC9K-zeocin-GFP载体转化GS115，PCR检测转化阳性克隆数。
对转化的平板进行菌落计数，取三次重复的平均值，pPIC9k-zeocin-25S-mGFP的转化效率可达到3×102/ug质粒，而pPIC9k-zeocin-mGFP的转化效率只能达到1×102/ug质粒，参见附图3，即通过本发明将毕赤酵母的部分rDNA序列应用于毕赤酵母表达系统，通过构建带有rDNA序列的整合载体，提高表达载体的整合效率。
本发明将构建的整合载体应用于外源基因在毕赤酵母中的表达，含有该序列的表达载体转化效率高，能够加快高表达重组菌株的获得。
通过实施本发明具体的技术方案，实现以下有益效果1、通过构建带有rDNA序列的整合载体，提高表达载体的整合效率2倍；2、可以达到一次转化即可获得较多的转化克隆，为进一步的筛选高表达重组菌株奠定基础，从而加快外源蛋白表达的进程。
图1为pPIC9K-zeocin-25S-GFP的载体结构。
图2为pPIC9K-zeocin-GFP的载体结构。
图3为转化获得阳性克隆的效率。
图4为绿色荧光蛋白表达的显微镜图，其中，A为pPIC9k-zeocin-mGFP绿色荧光蛋白表达的显微镜图，B pPIC9k-zeocin-25S-mGFP为绿色荧光蛋白表达的显微镜图。
具体实施例方式
下面，举实施例说明本发明，以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明，但本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，则％皆指重量百分比。
本发明所涉及的菌种毕赤酵母菌株GS115(购自invitrogen)，E.coliDH5α(本实验室保存，很常见，可见于本领域研究的每个实验室)，pPIC9K，pGAPZαA(购自invitrogen)，pMD18-mGFP(绿色荧光蛋白，中国科学院微生物研究所)，pMD18-T(购自大连宝生物工程公司)生化试剂YNB购自Difco公司；Taq DNA聚合酶、pfu Taq购自TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.，LTD公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自大连宝生物工程公司；胰蛋白胨，酵母提取物为Oxoid公司产品；Zeocin购自invitrogen公司；DNA回收试剂盒为新长江公司产品；其它试剂均为国产分析纯。
培养基低盐LB培养基，RDB培养基，YPD培养基，YP培养基，培养基配方参见Invitrogen manual。
实施例1设计PCR扩增引物每一个rDNA由核仁中的聚合酶I转录产生的35S前体加工而成的编码25S、18S和5.8S rRNA的基因序列组成。编码5S的序列位于两个35S前体之间，且以两个非转录区(NTS1and 2)为间隔与35S前体分开。在S.cerevisiae中，聚合酶I转录35S前体的启动子位于外部转录区(ETS)转录起始之前的NTS2区，即18SrRNA编码区上游的800bp处。依据S.cerevisiae的25S和18S保守序列设计引物，以毕赤酵母基因组为模板进行扩增，获得包含有部分25S、完整5S及NTS序列的2.8kb对应序列，参见SEQ NO.1。
25S-fAGATCTGACTACTGGCAGGATCAAC，BgL II25S-bGGATCCGTTTAGACCGTCGTGAGA，BamH I实施例2重组表达载体的构建构建的重组表达载体和对照载体，参见附图1、2。通过pPIC9k载体经BgLII酶切，获得6.8kb左右的片段与pGAPZαA经BgLII/BamHI酶切获得的1.9kb片段连结获得pPIC9k-zeocin载体；将pPIC9k-zeocin载体用BgLII线化，碱性磷酸酶脱磷酸化处理，连入BgLII/BamHI酶切的25S序列，构建成功pPIC9k-zeocin-25S载体。将mGFP PCR扩增经EcoRI/NotI酶切连入相同酶切的pPIC9k-zeocin-25S和pPIC9k-zeoci载体，构建成pPIC9K-zeocin-25S-GFP载体和pPIC9K-zeocin-GFP。
实施例3重组表达载体的转化和筛选通过构建的重组表达载体pPIC9k-zeocin-25S-mGFP和pPIC9k-zeocin-mGFP重组质粒用TSS方法转化E.coli DH5α扩增质粒。提取质粒，pPIC9k-zeocin-mGFP以HpaI线化，pPIC9k-zeocin-25S-mGFP以SpeI线化。采用电击转化法转化P.pastorisGS115。每次涂10个RDB平板，重复三次，参见附图3。从RDB平板上挑取单菌落，转接添力Zeocin(1mg/mL)的YPD，提取酵母基因组，用绿色荧光蛋白特异引物鉴定基因组中是否有mGFP的基因插入。对转化的平板进行菌落计数，取三次重复的平均值，pPIC9k-zeocin-25S-mGFP的转化效率可达到3×102/ug质粒，而pPIC9k-zeocin-mGFP的转化效率只能达到1×102/ug质粒，即带有25S序列后可提高转化效率2倍左右，参见附图3。
实施例4酵母培养、诱导表达和荧光分析从平板上挑取阳性克隆，接种于2mL含有100μg/mL Zeocin的YPD中。37℃培养24小时，离心收集菌体，转接2mL YP中，每隔12小时补加终浓度为0.5％的甲醇一次。连续诱导48小时。37℃培养，摇床转数200rpm。
48小时诱导后，利用Olympus荧光显微镜(Standard FITC filter set，Zeiss)进行荧光分析。首先通过CCD camera VarioCam(PCO)镜头获取甲醇诱导的酵母细胞图像，利用Image-pro plus获取绿色荧光图像，参见附图4。绿色荧光蛋白是一种极具潜力的标记物，其内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时可高效发射清晰可见的绿光且荧光性质稳定，与现有的标记物相比，GFP有无可比拟的优势。因而自GFP技发现以来，一直作为一个监测完整细胞和组织内基因表选及蛋白定位的理想标记。本发明以绿色荧光蛋白为标记证实了构建的整合表达载体的实用性及可行性。
Sequence NO.1.ST25SEQUENCE LISTING<110>新疆农科院微生物应用研究所<120>一种高效毕赤酵母整合载体的构建<130>一种高效毕赤酵母整合载体的构建<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2823<212>DNA<213>Pichia pastoris<400>1agatctgact actggcagga tcaaccagat aactaggttt tgaagctaga taaagtgttt 60gttcccccgg ctcttttaga gttagtaggc ttaaggccct acgattattt atctacgtag120taatccactt ttcccttgtg ggcatgttag gctggctcgt gtctcccgac cctttgccag180tgttcccatg ccctgcgttc tcagagtttt cactcttctt tcatgtatat ccttccgggt240ccttttcgtc gggtgcaaaa ctagactagg tggatatgcg ttgggtggac tagcggagtg300aattggtcga ctgtttgtta ggagtctggt gtgcgcgaga cgtccctaac aaatgtgcga360tttcgactta cgatttttca gaccgtgaga tgggacaagt atccgcgaat tgccttgctg420ggcattctgg gcgggaagaa tgtttcgctg gaaggggaac tttagattac agggcaaaca480tgcaaatccc aggcggggaa agcgctgatt tctgcggttc aggccctgat ccggagtttg540agaaccccaa catcagaata caccaaaatg ggttgaggtg gtgaatgcta tgtagtgaac600gcttatgtaa gtgagcactt atgtaagcgg ttgaccatta tgtaagcttg tggtttacgt660aaactgttat gtaagctttg accattatgt aagcttgtgg tttacgtaaa ctgttatgta720agcttgtggt ttacgtaaac tgttatgtaa gctttggcca ttatgtaagc ttgtggttta780cgtaaactgt tatgtaagct ttggccatta tgtaagctcg agaccagtta ggtaagcaga840ttgatctatt atgtaagctt tgaatactta tgtaagctcg agcccagtta tgtaagcttc900gaccattatg taagctttga atacttatgt aagctcgagc ccagtatgta agcagattga960cccattatgt aagctttgaa cacttatgta agctcgaaac cagttaggta agcagctttg 1020taagcaatct ggacaattat gtaagcgggt tacgtaaaca gttatgtaag cagaaaaatt 1080tcaaacgaca aaacttgggg tctacagaca cagtagccag aagattgcac taccattcga 1140ctcctcatga cccactcttt cgatccatgt agttaggtta ccgtttttcc taatatttaa 1200ggatgttgaa aattcatttt catttttttc gtttttaaga ttttctcaca actcttccaa 1260agattactag ttgacttttc aaatatttag ggtatttttc tcactttttc ctagcaaact 1320ccaattggtg ggttcagtgc aatggagtat caccttgcaa ccacaacgta atagctaact 1380tgtggccacc atgtctggtt gtagagataa ttggattcta atgtggatca catgactact 1440cacgtgtcaa aaacccaacc tgacttggcc cagcttagca agaatatttc gaatccactc 1500ttgtggccta gtggacaact gggaaagctt gcgacgcagt cgtttttggc gatccaggcg 1560tagtactagg ttcgagcctg gtcattcaga tggctcagaa cttgaggttg actgagttcc 1620aggttcgagt ccaggacggg ttggttggtg tcgtcggctt tcggttggtc tttgatcggc 1680actcggcatg atgatgttga gactgacgcg tcgactggac gtgtttagta cacggtccac 1740gcgtaatgtg tggtcttatc ttgttggtgt cttcttttgt ctggtatctt atcttatctg 1800
Sequence NO.1.ST25ggatgtgtat tatgtaagct ggagaaaact ctgcggcaag agaaaaaaac aacaagtcca1860accgcgggag actatccggc gggagatcat ccggcgagcg gagcgcagct ggggggagtc1920aagatgatgg caagtccaac cgcgggagac tatccggcgg gagatggtcc ggcgagcgga1980gcgcagctgg ggggtgatgc tgagggagtc aaggtgaggt caggtgaagg tctcaagttc2040ctatagtttt tcaagtgcgt gcaagtgcaa gtgcaagtcc aggtgggaca gttttttgga2100aagtggaggt gtcacgtgag gacttctaag gagaatctca agtccaggac aatcctcaca2160gatccaggtg gtcaatggaa cggcaggcca cgggagcgga gcaggacagg gccgcctgtt2220ggactcaaca aggagggtct gtcggggtac gacggggcgt ggttgactgg tggagatttg2280cgttcaccaa ccagcgttgt tgcggttgct tggtacgctt ggtgggtagt tgactggtgg2340ttgactgttg gtggaagaat acaagttcac caaccagcgt cgctgcgctc gcttggtacc2400gcttggttaa ccgtcttcgg aacgagccac gaccaccacc ttcgctgcgc tcggtggggt2460ctaggctcgt ccttcggtat ggaagttcca atcgctcgac cggggcttaa tctcagcaga2520tcgtgacggc aaggccactc ttctgcgtac aataccctgt cggggtcaag tcgtgggcgg2580gagattgtgg aatgctgcta tgaaatatat ccttcttgta cactcctccc caccccagca2640cagattctga cttagaggcg ttcagccatg atctgacgga cgtagcgtcg gggctgcttt2700gtcaggcagc cccaaaaacc aaatgtccga atgaacggtt cctctcgtac taagttcaat2760tactgccgtg gggctcatca gtagggtaaa actaacctgt ctcacgacgg tctaaacgga2820tcc 282权利要求
1.一种重组表达载体的构建，其特征在于，通过将毕赤酵母的部分rDNA序列添加到毕赤酵母整合表达载体中而获得。
2.如权利要求1所述的将毕赤酵母的部分rDNA序列添加到毕赤酵母整合表达载体中获得重组载体，具体获得步骤包括，(1)、毕赤酵母rDNA序列的克隆；(2)、整合载体的构建；(3)、转化酵母，运用PCR检测转化阳性克隆数验证获得转化。
3.如权利要求2所述的毕赤酵母rDNA序列的克隆，其特征在于，由毕赤酵母克隆出的包含有部分25S、完整5S及NTS的序列SEQUENCELISTING。
4.如权利要求2所述的整合载体的构建，其特征在于，该基因序列能够应用于目前常用毕赤酵母整合表达载体的构建，提高整合载体的转化效率。
5.如权利要求2所述的将构建的整合载体应用于外源基因在毕赤酵母中的表达，其特征在于，含有该序列的表达载体转化效率高，能够加快高表达重组菌株的获得。
全文摘要
本发明将毕赤酵母的部分rDNA序列添加到目前常用的毕赤酵母整合表达载体中，本发明的目的是将毕赤酵母的rDNA序列应用于毕赤酵母表达系统，通过构建带有rDNA序列的整合载体，获得了一种能够显著提高整合载体转化效率的载体。提高表达载体的整合效率，加速外源蛋白表达毕赤酵母重组菌株的获得速度。
文档编号C12N15/31GK101063148SQ20071010151
公开日2007年10月31日 申请日期2007年4月24日 优先权日2007年4月24日
发明者霍向东, 石玉瑚, 欧阳平凯, 孙建, 张志东 申请人:新疆农业科学院微生物应用研究所