β-甘露聚糖酶及基因和制备方法以及载体和宿主细胞的制作方法

专利名称：β-甘露聚糖酶及基因和制备方法以及载体和宿主细胞的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种(3-甘露聚糖酶及其编码基因和制备方法，以及含有该 基因的重组载体和重组宿主细胞。
背景技术：
甘露聚糖酶是一类能够水解半纤维素中第二大组分——异甘露聚糖的 内切酶，在医药、食品、饲料、造纸、纺织、印染、洗涤、石油开采及生物 技术等诸多领域得到了广泛应用。例如甘露聚糖酶可作为饲料酶添加剂， 饲料中添加甘露聚糖酶可补充内源消化酶不足，消除和降解饲料原料中的抗 营养因子，促进畜禽生长，减少养殖污染(Lee， et al., Poultry Science, 82: 1925-1931,2003);可水解甘露聚糖型植物胶(如角豆胶、瓜儿豆胶、魔芋等)， 生成具有增殖双岐杆菌生理功效的低聚甘露糖，具有较大的市场前景。
卩-甘露聚糖酶的来源非常广泛，细菌中的芽孢杆菌属、气单胞菌属、肠 杆菌属、假单孢菌属和链霉菌属，丝状真菌和酵母，以及高等植物和某些低 等动物中都发现了甘露聚糖酶。各种不同来源的P-甘露聚糖酶，在活性大小 及对环境条件的要求等方面，大多存在或多或少的差别。工业生产一般需要 经过高温过程，所以能够进行工业生产的甘露聚糖酶需要具有一定的耐热性 (最好具有60-7(TC的耐热性)。如果要用于饲料或食物添加剂，还需要具备 一定的耐酸性，这是因为尽管消化碳水化合物的主要过程发生在中性微酸的 小肠和其它消化道中，但是食物或饲料还是要经过胃部的酸性环境。目前分 离到的黑曲霉(ApeW//w "扭。AS2710菌株产生的甘露聚糖酶能够较好 地满足以上两点，该酶耐热性能好，工作温度范围是30-85°C，最适反应温 度70。C;反应pH 2-9.2，最适pH 3.0-3.8( 丁宏标等，中国专利CN 01144782.6，
2001年)。然而，黑曲霉AS2710菌株的甘露聚糖酶基因还没有克隆得到， 其表达主要是通过黑曲霉AS2710菌株发酵，该菌发酵周期长(5天以上)， 另外因为没有有效的启动子控制，也不容易实现甘露聚糖酶基因的高效表 达，且该酶没有有效的亲和标签，不利于快速方便地纯化。

发明内容
本发明的一个目的是克服目前没有适于原核表达且易于纯化分离的耐 酸耐热的P-甘露聚糖酶的缺陷，提供一种适于原核表达且易于纯化分离的耐 酸耐热的(3-甘露聚糖酶。
本发明的第二个目的是提供编码该(3-甘露聚糖酶的基因。 本发明的第三个目的是提供含有该基因的重组载体。 本发明的第四个目的是提供含有该重组载体的宿主细胞。 本发明的第五个目的是提供所述p-甘露聚糖酶的制备方法。 本发明提供了一种卩-甘露聚糖酶，该卩-甘露聚糖酶具有SEQID: NO. 2 所示的氨基酸序列，SEQID: NO. 4所示的氨基酸序列，SEQID: NO. 6所 示的氨基酸序列，SEQID: N0.8所示的氨基酸序列，或者对SEQID: NO. 2、 SEQID: NO. 4、 SEQID: NO. 6或SEQID: NO. 8所示的氨基酸序列进 行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而得到的p-甘露聚糖酶活性不变的氨 基酸序列。
本发明提供了一种编码本发明提供的P-甘露聚糖酶的基因。 本发明提供了一种重组载体，该重组载体含有本发明提供的基因。 本发明提供了一种重组宿主细胞，该宿主细胞含有本发明提供的重组载体。
本发明提供了一种P-甘露聚糖酶的制备方法，该方法包括培养本发明提 供的宿主细胞。
本发明提供的(3-甘露聚糖酶能够水解各种含有卩-1,4甘露糖苷键的甘露 聚糖，生成寡糖，其最适作用条件是pH 5-5.5， 60-65°C，能够作为食物或饲 料添加剂，适应胃部的酸性环境，而且能够满足工业生产对耐热性的需要。 虽然，之前已经分离到的黑曲霉(Jwwg///w "/ge。 AS2710菌株产生的甘 露聚糖酶，具有耐热耐酸性，但是其生产方法是真菌发酵的方法，存在周期 长、产量低的缺点，而本发明提供的(3-甘露聚糖酶可以利用本发明构建原核 表达系统进行生产，克服了上述真菌发酵的缺点。另外，本发明中的重组甘 露聚糖酶，表达后具有六个组氨酸标签，纯化十分方便。
本发明涉及的重组宿主细胞为含有SEQID: NO.l的重组克隆载体转化 菌株DH5a(pUCU7)，分类命名为大肠埃希氏菌，拉丁文学名为^c/^/c/^a 于2007年5月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏编号为CGMCCNo.2051。


图1: SEQID:N0.6所示的(3-甘露聚糖酶和E159A突变体的SDS-PAGE 电泳图2: SEQ ID: N0.6所示的(3-甘露聚糖酶活性随温度和pH变化的曲 线图。
具体实施例方式
本发明提供的(3-甘露聚糖酶具有SEQ ID:NO. 2所示的氨基酸序列，SEQ ID: N0.4所示的氨基酸序列，SEQID: NO. 6所示的氨基酸序列，SEQ ID: NO. 8所示的氨基酸序列，或者对SEQ ID: NO. 2、 SEQ ID: NO. 4、 SEQ ID:
NO. 6或SEQ ID: N0.8所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、缺 失或添加而得到的P-甘露聚糖酶活性不变的氨基酸序列。
组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类1、非极 性的氨基酸丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、 甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro); 2、极 性不带电荷的氨基酸甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱 氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr); 3、带正 电荷的氨基酸精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His); 4、带负电 荷的氨基酸天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(参见"生物化学"(第二版) 上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白 质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由 Leu取代Ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用(比如提供正电荷或形 成疏水囊袋结构的作用)没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影 响，因此仍然可以实现蛋白的功能。例如，本领域技术人员公知，Ala和Ser、 Val和Ile、 Asp和Glu、 Ser和Thr、 Ala和Gly、 Ala和Thr、 Ser和Asn、 Ala 禾口 Val、 Ser禾口 Gly、 Tyr禾卩Phe、 Ala禾口 pro、 Lys禾口 Arg、 Asp禾口 Asn、 Leu 禾口Ile、 Leu禾BVal、 Ala和Glu以及Asp和Gly，两两之间相互取代，不会影 响蛋白的立体结构和功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在 上述(3-甘露聚糖酶的任意一个氨基酸残基位置上。
本发明提供的P-甘露聚糖酶还可以进行修饰或突变，得到衍生的蛋白 质。本发明所述"衍生的蛋白质"指与具有上述氨基酸序列的P-甘露聚糖酶具 有氨基酸序列上的差异，也可以有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼 而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过 各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变 法或其他已知分子生物学的技术。所述"衍生的蛋白质"还包括具有天然L型 氨基酸的残基的类似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的 氨基酸(如P-氨基酸、，氨基酸等)的类似物。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的蛋白的化学衍生 形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中 或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋 白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。 修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸 苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解 性能的蛋白。
所述(3-甘露聚糖酶优选具有SEQ ID: NO. 2所示的氨基酸序列，SEQ ID: N0.4所示的氨基酸序列，SEQ ID: NO,6所示的氨基酸序列，或者SEQID: NO. 8所示的氨基酸序列，更优选具有SEQID: NO. 2或SEQ ID: NO. 6所
示的氨基酸序列。
本发明提供了一种编码本发明提供的P-甘露聚糖酶的基因。 本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met (ATG)或 Trp (TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码 子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第 二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨 基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不 会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本 领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨 基酸序列得到的(3-甘露聚糖酶活性不变的氨基酸序列，完全可以推导出能够 编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法) 或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在 本发明范围内。相反，利用本文公开的DNA序列，也可以通过本领域公知 的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约， 美国，第二版，1989)进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发
明所述P-甘露聚糖酶活性一致的氨基酸序列。
优选情况下，编码本发明提供的P-甘露聚糖酶的基因具有SEQID: NO. l所示的核苷酸序列，SEQID: N0.3所示的核苷酸序列，SEQID: NO. 5 所示的核苷酸序列，SEQID: N0.7所示的核苷酸序列，或者对SEQID: NO. 1、 SEQID: NO. 3、 SEQID: NO. 5或SEQID: NO. 7所示的核苷酸序 列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码活性不变的P-甘露 聚糖酶的核苷酸序列。更优选的情况下，编码本发明提供的(3-甘露聚糖酶的 基因具有SEQ ID: NO. 1所示的核苷酸序列，SEQ ID: NO. 3所示的核苷酸 序列，SEQID: N0.5所示的核苷酸序列，或者SEQID: N0.7所示的核苷 酸序列。进一步优选的情况下，具有SEQID: NO. 1或SEQID: NO. 5所示 的核苷酸序列
本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、 重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供 的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关 序列。
一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸 序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过 常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。
此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。
本发明提供的重组载体含有本发明提供的基因。
优选所述重组载体为重组质粒pUCl.17或重组质粒pETMAN-HA963。 在本发明中，所述"载体"可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、 粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选pUC18或pET28a质粒。重组载 体构建可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶(如对 于pUC18，可用Sal I 、 BamH I 、 EcoR I等；对于pET28a，可用Nde I 、Nhe I 、 EcoRl 、 BamH、 HindIII等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同 核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。本发明优选采用Sall切 割pUC18及与其连接的基因片段。Nhe I和HindIII双酶切pET28a及与其连 接的PCR产物片段，经连接酶连接，分别构建重组载体pUC1.17和 pETMan-HA963。
本发明提供的重组宿主细胞含有本发明提供的重组载体。
可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主 细胞中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化。所述宿主细 胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为大肠杆菌、枯草杆菌、酵母或各种动 植物细胞，更优选所述宿主细胞为大肠杆菌。
本发明还提供的制备P-甘露聚糖酶的方法包括培养本发明提供的重组 宿主细胞。所述培养条件为常规的培养条件，如使用LB培养基(酵母粉5 克/升，蛋白胨10克/升，NaCl 10克/升)，在37'C下培养。由于本发明提供 的重组宿主细胞中含有编码(3-甘露聚糖酶的基因，可以高效地表达P-甘露聚 糖酶。培养后经过分离提纯，即可得到高纯度的p-甘露聚糖酶。
下面的实施例将对本发明作进一步的描述。
实施例1.含有SEQ ID: NO.l所示的P-甘露聚糖酶基因的重组质粒 pUC1.17和转化菌株DH5a (pUC1.17)的构建
从云南腾冲热泉(pH 2， 90°C)采集水样2L，经0.22pm微孔滤膜 (Milipore公司)过滤收集水样中的菌体，用STE缓冲液(0.1MNaCl; 10 mM Tris-HCl， pH 8.0; 1 mM EDTA， pH 8.0)洗下滤膜上的菌体，离心4000 rpm， 10 min，得菌体新鲜湿重约0.5g。菌体沉淀物用UltraClean Soil DNA Kit 提取总DNA(10(Hd, 4|ig/Vl)，测定吸光度比值为A260/A280= 1.947， A260/A230 = 2.15。取上述总DNA溶液50 |il (约含200 |ag DNA)，用限制
酶Sa/1酶切，酶切体系中含有5 pi 1酶(20 U/pl), 5 |il Buffer 1 (10 mM KC1， 10 mM Tris画HCl， 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 ng/ml BSA, 50%甘油， NEB公司)，35pl去离子水，37'C温育4h充分反应。反应产物经琼脂糖凝 胶电泳回收2-4kbDNA片段，溶于50julTE (10 mM Tris-Cl， pH 8.0; 1 mM EDTA， pH8.0)溶液中，即得环境基因组DNA。采用与酶切基因组相同的 反应体系和条件用1酶切pUC18质粒，琼脂糖凝胶电泳回收后溶于3(^1 去离子水中(浓度约10ng4U)，加入1 jul热敏磷酸酶(5U4d, NEB公司生产)， 5.6^1 10倍热敏磷酸酶反应缓冲液(NEB公司生产)，37t:反应30min，再 于65。C水浴5min使磷酸酶失去活性，12000 rpm离心10 min后，上清即为 去磷酸化的pUC18质粒DNA溶液。取2 |il此质粒DNA溶液与14 pl上述 环境基因组DNA溶液混合，另外加入2 |il 10X连接酶缓冲液和2 nl的连接 酶(10U 1，NEB公司生产)，4r条件下过夜连接，得连接混合物。取4支含 50 pl电转化感受态细胞的1.5ml离心管，于冰浴中融化10 min后，每管加 入上述连接混合物2 pl，混匀，冰浴2min，然后将其转入已预冷的电转槽 中，电击(1.8kV，电容25vF，电击时间5ms，如无特别说明，本说明书 均采用此条件进行电击转化)后迅速加入液体LB培养基1 ml，混匀后于37°C 摇床培养，转速220 rpm， 50 min后按100 pl/平板涂布于含有安苄青霉素(100 lng/mL)、 5-溴-4-氯-3』引哚半乳糖苷(X-gal， 20 ng/mL)和异丙基-卩-D-硫代半 乳糖苷(IPTG， 20|ig/mL)的LB (LB培养基的基本成分为酵母粉5克/ 升,蛋白胨10克/升，NaC110克/升)平板上，37。C培养15h。获得了近10000 个克隆子。克隆子经过substrate overlay method (参看Teather， R. M., and P. J. Wood, Applied and Environmental Microbiology 43:777-80, 1982)活性测定， 筛选得到一个具有甘露聚糖酶的阳性克隆子，经测序公司(均尧公司，北京， 下同)对其插入片段进行测序，该插入片段的序列如SEQID: N0.9所示， 该序列中自核苷酸175位至1137位为一个编码基因，该基因的序列如SEQ
ID: NO.l所示，可以得知SEQID: NO.l所示的基因即为甘露聚糖酶m"W 基因，编码的氨基酸序列如SEQ ID: NO.2所示。该阳性克隆子即为含有SEQ ID: NO.l所示序列的重组克隆载体转化菌株DH5a (pUCl.17)(此菌种已 保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2051)。转化菌株DH5a(pUC1.17)中的重组质粒pUC1.17(含有SEQ ID: NO.l所示的序列)可用于进一步构建表达载体。
实施例2.卩-甘露聚糖酶表达载体和转化菌株的构建
根据SEQ ID: NO.l所示的核苷酸序列(ma"」序列)，合成正反向引 物，IF.向引物为5，-GTGCGCTAGCATGGGACG-3，，下划线部分为Nhe I的 酶切位点，反向引物为5，- GCGAAGCTTTCATCGATTTG-3，，下划线部分 为Hindin的酶切位点。采用这两个引物，以质粒pUCl.17为模板，禾U用下 面PCR反应体系(Taq DNA聚合酶及其缓冲液、dNTP采用天根公司成品)
IOX缓冲液 5|il
dNTP 4 nl
Taq DNA聚合酶 0.5 pi
正向引物(25 pM) 1 pi 反向引物(25 pM)
pUC1.17模板(lpgAil) 1 ^
反应条件94。C预变性4min，然后94。C变性30秒-5(TC退火30秒-72。C延 伸1 min30个循环，最后72"C延伸10min。 PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳 检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒(超薄离心柱型，天根公司生产) 纯化。纯化后用Nhe I和HindIII双酶切该PCR产物，反应体系为50 pl PCR 产物、Nhe I (10U/nl， NEB公司)和HindlII(10U/ul， NEB)各5pl、 10jal Buffer 2 (50 mM NaCl， 10 mM Tris画Cl, 10 mM MgC12, lmM DTT， NEB公司)，30^1
去离子水，37'C温育4h，琼脂糖电泳回收。质粒pET28a经同样条件双酶切， 电泳回收。所回收双酶切PCR产物和质粒进行连接(连接酶用量、反应条 件同实施例1)，构建成pETMan-HA963重组表达载体。此重组载体电击转 化大肠杆菌BL21 (DE3)后涂布于含有50|ng/mL卡那霉素的LB平板，37°C 培养15 h，即得含有SEQ ID: NO. l所示序列的重组表达载体的转化菌株 Man-HA963。由于连接到pET28a的SEQ ID: NO. 1所示序列与pET28a中 编码组氨酸标签的序列处于同一阅读框，实际获得的蛋白质序列如SEQ ID: NO. 6所示，与SEQ ID: N0.2相比，该序列在前端多了 23个由pET28a上 游序列编码的氨基酸，其中包括用于分离纯化的六个组氨酸标签。编码SEQ ID: NO. 6的核苷酸序列如SEQ ID: NO. 5所示。
实施例3.甘露聚糖酶基因突变体的制备
以实施例2的表达载体pETMan-HA963为模板，采用Stratagene公司的 定点突变试剂盒(QuikChange site-directed mutagenesis kit),参照说明书，通 过在引物中引入突变碱基并进行PCR扩增，将SEQ ID: NO. l所示的核苷 酸序列在476位A突变为C，获得含有该突变体的载体pETMan-E159A。该 突变体的核苷酸序列经北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，结果如SEQ ID: N0.3所示，实现了预设的点突变，艮卩，与SEQ ID: NO. 1相比，该突 变体基因的核苷酸序列在476位A突变为C，三联体密码子GAA变为GCA， 相应的氨基酸序列(如SEQ ID: N0.4所示)159位氨基酸Glu变为Ala。 按照与实施例2相同的方法，将此重组质粒pETMan-E159A电击转入大肠杆 菌BL21 (DE3)，含有此重组质粒的大肠杆菌称为Man-HA963-E159A。由 于连接到pET28a的SEQ ID: NO. 3所示序列与pET28a中编码组氨酸标签 的序列处于同一阅读框，实际获得的蛋白质序列如SEQID: N0.8所示，与 SEQ ID: N0.4相比，该序列在前端多了23个由pET28a上游序列编码的氨
基酸，其中包括用于分离纯化的六个组氨酸标签。编码SEQID: N0.8的核 苷酸序列如SEQID: N0.7所示。
实施例4.重组卩-甘露聚糖酶的表达和纯化
将上述含有重组表达载体的转化菌株Man-HA963培养于含有50 )ig/ml 卡那霉素的LB培养基(基本成分为酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升， NaCl 10克/升)中，37。C培养3 h， OD6oo=0.7，加入IPTG至终浓度为0.8 pM， 转至3(TC继续培养4h。 5000rpm， 10min离心收集菌体，悬浮于溶液A (20 mM Tris-Cl， pH 7.9, 0.5 MNaCl， 10 mM咪唑)中，于冰浴中超声破碎(60W， 10min内循环超声，超声2s，停止2s，防止溶液过热导致蛋白失活)，之后 15000 rpm离心10 min除去细胞碎片，上清过Ni-IDA His'Bind Superflow纯 化柱，用5 ml溶液A冲洗，再用10 ml溶液B (20 mM Tris-Cl， pH 7.9， 0.5 M NaCl, 60 mM咪唑)漂洗，最后用5 ml溶液C (20 mM Tris-Cl, pH 7.9, 0.5 M NaCl, 500 mM咪唑)洗脱，收集洗脱液。然后将洗脱液用FPLC (快速 蛋白液相层析)的脱盐、凝胶过滤和离子交换层析柱分别进行纯化，获得纯 化蛋白。Man-HA963-E159A的培养和甘露聚糖酶突变体的纯化同上，获得 甘露聚糖酶突变体E159A。 10% SDS-PAGE电泳(120V, 2 h， 25°C)显示 所得重组蛋白均显示为一条纯的单一蛋白带(如图1所示，图1中泳道1表 示低分子量蛋白Marker,泳道2表示SEQ ID: NO. 6所示的蛋白，泳道3 为SEQ ID: NO. 8所示的突变重组蛋白)。SDS-PAGE电泳显示SEQ ID: NO. 6所示的蛋白和突变蛋白的分子量均为约36 kD左右，基本符合理论推断的 38 kD。
实施例5.甘露聚糖酶活性测定
标准活性测定体系为1 ml，其中含有0.9 ml 0.5%槐豆胶溶液(pH 5.5
的50mM磷酸柠檬酸缓冲液配制)，O.lml如SEQID: N0.6所示的P-甘露 聚糖酶的酶液(0.05 ^M)。底物在测定温度先温育5min后加入酶液，反应 10 min后加入二硝基水杨酸溶液(DNS)终止反应(张龙翔等主编.《生化 实验方法和技术》，高等教育出版社，1996.)，然后沸水浴IO min后测定在 540 nm处的吸光值。酶活单位定义为1 min内催化产生1 )iimol还原糖所需 的酶量。测定最适反应温度时采用pH 5.5的50 mM磷酸柠檬酸缓冲液，在 测定温度温育5 min，加入0.1 ml酶液，继续在该温度反应10 min后加入1 ml DNS终止反应，其余同标准活性测定。最适反应pH测定在4(TC进行，分别 采用pH为4.5、 5、 5.5、 6、 6.5、 7、 7.5和8的磷酸柠檬酸缓冲液配制底物 溶液，其余反应同标准活性测定。结果见图2。该重组蛋白最适作用pH5.5， 最适温度65'C。测定还显示突变体活性与SEQ ID: N0.6所示的p-甘露聚 糖酶完全相同。本发明重组表达菌株产酶活力为78 U，mr1，约为黑曲霉 AS2710菌株150 Unnl"的一半，但考虑到发酵周期，黑曲霉发酵周期需要 至少5天，而本发明中菌株活化需要10h左右，加上诱导表达的8h，共18 h，所以日平均产酶活力本发明中的甘露聚糖酶为104 U，ml、day'1，黑曲霉 AS2710菌株的甘露聚糖酶小于30U，ml、da/1，另外，本发明中的重组甘露 聚糖酶，表达后在蛋白的第5到第10个氨基酸的位置有六个组氨酸，使得 目的蛋白一次纯化即达到90%以上，十分方便有效。因此本发明在发酵生产 上比黑曲霉AS2710菌株具有更大的优势。
SEQUENCE LISTING
〈110〉中国科学院微生物研究所
〈120〉 (3-甘露聚糖酶及基因和制备方法以及载体和宿主细胞 〈130〉 I7947ZKW 〈160〉 9
〈170〉 Patentln version 3. 1 <210〉 1 <211〉 1173 〈212〉 DNA 〈213〉人工合成 〈400〉 1
atgggacgga tcgaaagcgc attcgatctc gtcggccagc acgggacgtg gggaaccgac gaacagccct tcaactgggt gacgctcgcc cccgccatcg cgtatgggcc tccggtcacc gagcttgccc acgcactcgg gctcaaggtg gggacgtggc gaggcgagat ccggttcgag gaagcgtggt ttgggtctta ttccgacatg acgggttgcg卿tgttctg cgtgggctgc atgtggcgcg ,ccatcgc gcgcgtgcga tgcaaccacg ggcgcgagga gcacgtgcgc agcgcctact atcccatcga ccggtggcga gaggcgcatg aaaagccgct cttcttcatg ggcgcctgcc cgtgggacta ccggcaccca
ggcttcatcc gaggcatgac gaggcgcgcg catcgatgcg ttcgcgggcc tcatggagca gtgagcgacg acg卿ttgc tgcctgaagc cgaccgtgaa 33ggaac3cg gcccggatct atggcccact acgcgcatgt gagatgacga ctgccgagcc accgagtacg acggcctcgt ttctgggacg cggtcgatct gatcgcgtgc ctgtgctccg gaagtggggt gcccgagccg ggcgccgtct gtcttgacga
ctttggcttc 60
tgcgcttgcc 120
ccccggcgat 180
gtcgatggcg 240
ctgccgagac 300
cgagtcctgg 360
ggcg犯gcgc 420
acacgaagcc 480
gacgtacaac 540
catctcgtcg 600
cgaggtggca 660
ctccggctcc 720
gcaggcgcgg 780200710121923.2
ttctacgaag ccatgttcgc cgccatgccc gacgagccgt tgggaatggc cgtggaagct gtacccgcgc gaagcggcgt atctacggca aaccggccga ggacgtcgtg gcgcgggcgt tga
说明书第14/22页 ggttcaaggg ttacatgctg 840 ccgaggacgg aagctactgc 900 tctcggccat cgcaaatcga 960
963
〈210> 2 〈211〉 320 〈212〉 PRT 〈213〉 重组表达 〈400〉 2
Met Gly Arg lie Glu Ser Ala Phe Asp Leu Gly Phe lie Arg Gly Met
1 5 10 15
Thr Phe Gly Phe Val Gly Gin His Gly Thr Trp Gly Thr Asp Glu Ala
20 25 30
Arg Ala Ser Met Arg Ala Leu Ala Glu Gin Pro Phe Asn Trp Val Thr
35 40 45
Leu Ala Phe Ala Gly Leu Met Glu His Pro Gly Asp Pro Ala lie Ala
50 55 60
Tyr Gly Pro Pro Val Thr Val Ser Asp Asp Glu lie Ala Ser Met Ala 65 70 75 80
Glu Leu Ala His Ala Leu Gly Leu Lys Val Cys Leu Lys Pro Thr Val
85 90 95
Asn Cys Arg Asp Gly Thr Trp Arg Gly Glu lie Arg Phe Glu Lys Glu
100 105 110
His Gly Pro Asp Leu Glu Ser Trp Glu Ala Trp Phe Gly Ser Tyr Ser
115 120 125
Asp Met Met Ala His Tyr Ala His Val Ala Lys Arg Thr Gly Cys Glu
130 135 140
Met Phe Cys Val Gly Cys Glu Met Thr Thr Ala Glu Pro His Glu Ala 145 150 155 160
Met Trp Arg Glu Thr lie Ala Arg Val Arg Thr Glu Tyr Asp Gly Leu
165 170 175
Val Thr Tyr Asn Cys Asn His Gly Arg Glu Glu His Val Arg Phe Trp
180 185 190
Asp Ala Val Asp Leu lie Ser Ser Ser Ala Tyr Tyr Pro lie Asp Arg
195 200 205
Trp Arg Asp Arg Val Pro Val Leu Arg Glu Val Ala Glu Ala His Glu
210 215 220
Lys Pro Leu Phe Phe Met Glu Val Gly Cys Pro Ser Arg Ser Gly Ser 225 230 235 240Gly Ala Cys Pro Trp Asp Tyr Arg His Pro Gly
245 250 Glu Gin Ala Arg Phe Tyr Glu Ala Met Phe Ala
260 265 Pro Trp Phe Lys Gly Tyr Met Leu Trp Glu Trp
275 280 Pro Arg Glu Ala Ala Ser Glu Asp Gly Ser Tyr
290 295 Pro Ala Glu Asp Val Val Ala Arg Ala Phe Ser 305 310 315
<210〉 3 〈211> 963 〈212〉 腿 〈213〉人工合成 <400〉 3 atgggacgga
Ala Val Cys Leu Asp 255
Ala Met Pro Asp Glu 270
Pro Trp Lys Leu Tyr 285
Cys lie Tyr Gly Lys 300
Ala lie Ala Asn Arg 320
60
tcgaaagcgc attcgatctc ggcttcatcc gaggcatgac ctttggcttc
gtcggccagc acgggacgtg gggaaccgac gaggcgcgcg catcgatgcg tgcgcttgcc 120
gaacagccct tcaactgggt gacgctcgcc ttcgcgggcc tcatggagca ccccggcgat 180
cccgccatcg cgtatgggcc tccggtcacc gtgagcgacg acgagattgc gtcgatggcg 240
gagcttgccc acgcactcgg gctcaaggtg tgcctgaagc cgaccgtgaa ctgccgagac 300
gggacgtggc gaggcgagat ccggttcgag aaggaacacg gcccggatct cgagtcctgg 360
gaagcgtggt ttgggtctta ttccgacatg atggcccact acgcgcatgt ggcgaagcgc 420
acgggttgcg agatgttctg cgtgggctgc gagatgacga ctgccgagcc acacgcagcc 480
atgtggcgcg agaccatcgc gcgcgtgcga accgagtacg acggcctcgt gacgtacaac 540
tgcaaccacg ggcgcgagga gcacgtgcgc ttctgggacg cggtcgatct catctcgtcg 600
agcgcctact atcccatcga ccggtggcga gatcgcgtgc ctgtgctccg cgaggtggca 660
gaggcgcatg aaaagccgct cttcttcatg gaagtggggt gcccgagccg ctccggctcc 720
ggcgcctgcc cgtgggacta ccggcaccca ggcgccgtct gtcttgacga gcaggcgcgg 780
ttctacgaag ccatgttcgc cgccatgccc gacgagccgt ggttcaaggg ttacatgctg 840
tgggaatggc cgtggaagct gtacccgcgc gaagcggcgt ccgaggacgg aagctactgc 900
atctacggca aaccggccga ggacgtcgtg gcgcgggcgt tctcggccat cgcaaatcga %0
tga 963
〈210〉 4 〈211〉 320 〈212〉 PRT 〈213>重组表达 〈400〉 4
Met Gly Arg lie Glu Ser Ala Phe A印Leu Gly 1 5 10
Thr Phe Gly Phe Val Gly Gin His Gly Thr Trp
20 25 Arg Ala Ser Met Arg Ala Leu Ala Glu Gin Pro
35 40 Leu Ala Phe Ala Gly Leu Met Glu His Pro Gly
50 55 Tyr Gly Pro Pro Val Thr Val Ser Asp Asp Glu 65 70 75
Glu Leu Ala His Ala Leu Gly Leu Lys Val Cys
85 90 Asn Cys Arg Asp Gly Thr Trp Arg Gly Glu lie
100 105 His Gly Pro Asp Leu Glu Ser Trp Glu Ala Trp
115 120 Asp Met Met Ala His Tyr Ala His Val Ala Lys
130 135 Met Phe Cys Val Gly Cys Glu Met Thr Thr Ala 145 150 155
Met Trp Arg Glu Thr lie Ala Arg Val Arg Thr
165 170 Val Thr Tyr Asn Cys Asn His Gly Arg Glu Glu
180 185 Asp Ala Val Asp Leu lie Ser Ser Ser Ala Tyr
195 200 Trp Arg Asp Arg Val Pro Val Leu Arg Glu Val
210 215 Lys Pro Leu Phe Phe Met Glu Val Gly Cys Pro 225 230 235
Gly Ala Cys Pro Trp Asp Tyr Arg His Pro Gly
245 250 Glu Gin Ala Arg Phe Tyr Glu Ala Met Phe Ala
Phe lie Arg Gly Met 15
Gly Thr Asp Glu Ala 30
Phe Asn Trp Val Thr 45
Asp Pro Ala lie Ala 60
lie Ala Ser Met Ala 80
Leu Lys Pro Thr Val 95
Arg Phe Glu Lys Glu 110
Phe Gly Ser Tyr Ser 125
Arg Thr Gly Cys Glu 140
Glu Pro His Ala Ala 160
Glu Tyr Asp Gly Leu 175
His Val Arg Phe Trp 190
Tyr Pro lie Asp Arg 205
Ala Glu Ala His Glu 220
Ser Arg Ser Gly Ser 240
Ala Val Cys Leu Asp 255
Ala Met Pro Asp Glu
260 265 Pro Trp Phe Lys Gly Tyr Met Leu Trp Glu Trp
275 280 Pro Arg Glu Ala Ala Ser Glu Asp Gly Ser Tyr
290 295 Pro Ala Glu Asp Val Val Ala Arg Ala Phe Ser
305
<210> 5
〈211〉 1032
〈212〉 腿 <213〉人工合成
<400> 5 atgggcagcfi
310 315
270
Pro Trp Lys Leu Tyr 285
Cys lie Tyr Gly Lys 300
Ala lie Ala Asn Arg 320
60
gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat
atggctagca tgggacggat cgaaagcgca ttcgatctcg gcttcatccg aggcatgacc 120
tttggcttcg tcggccagca cgggacgtgg ggaaccgacg aggcgcgcgc atcgatgcgt 副
gcgcttgccg aacagccctt caactgggtg acgctcgcct tcgcgggcct catggagcac 240
cccggcgatc ccgccatcgc gtatgggcct ccggtcaccg tgagcgacga cgagattgcg 300
tcgatggcgg agcttgccca cgcactcggg ctcaaggtgt gcctgaagcc gaccgtgaac 360
tgccgagacg ggacgtggcg aggcgagatc cggttcgaga aggaacacgg cccggatctc 420
gagtcctggg aagcgtggtt tgggtcttat tccgacatga tggcccacta cgcgcatgtg 480
gcgaagcgca cgggttgcga gatgttctgc gtgggctgcg agatgacgac tgccgagcca 540
cacgaagcca tgtggcgcga gaccatcgcg cgcgtgcgaa ccgagtacga cggcctcgtg 600
acgtacaact gcaaccacgg gcgcgaggag cacgtgcgct tctgggacgc ggtcgatctc 660
atctcgtcga gcgcctacta tcccatcgac cggtggcgag atcgcgtgcc tgtgctccgc 720
gaggtggcag aggcgcatga aaagccgctc ttcttcatgg aagtggggtg cccgagccgc 780
tccggctccg gcgcctgccc gtgggactac cggcacccag gcgccgtctg tcttgacgag 840caggcgcggt tctacgaagc catgttcgcc gccatgcccg acgagccgtg gttcaagggt 900
tacatgctgt gggaatggcc gtggaagctg tacccgcgcg aagcggcgtc cgaggacgga 960
agctactgca tctacggcaa accggccgag gacgtcgtgg cgcgggcgtt ctcggccatc 1020
gcaaatcgat ga 1032
〈210〉 6
<211〉 343
〈212〉 PRT
<213〉 重组表达
<400> 6
Met Gly Ser Ser 1
Arg Gly Ser His 20
Leu Gly Phe lie 35
Thr Trp Gly Thr 50
Gin Pro Phe Asn 65
Pro Gly Asp Pro
Asp Glu lie Ala 100
Val Cys Leu Lys 115
Glu lie Arg Phe 130
Ala Trp Phe Gly 145
Ala Lys Arg Thr
Thr Ala Glu Pro 180
Arg Thr Glu Tyr 195
Glu Glu His Val
His His His His His His Ser 5 10 Met Ala Ser Met Gly Arg lie 25
Arg Gly Met Thr Phe Gly Phe 40
Asp Glu Ala Arg Ala Ser Met 55
Trp Val Thr Leu Ala Phe Ala
70 75 Ala lie Ala Tyr Gly Pro Pro 85 90 Ser Met Ala Glu Leu Ala His 105
Pro Thr Val Asn Cys Arg Asp 120
Glu Lys Glu His Gly Pro Asp 135
Ser Tyr Ser Asp Met Met Ala 150 155 Gly Cys Glu Met Phe Cys Val 165 170 His Glu Ala Met Trp Arg Glu 185
Asp Gly Leu Val Thr Tyr Asn 200
Arg Phe Trp Asp Ala Val Asp
Ser Gly Leu Val Pro 15
Glu Ser Ala Phe Asp 30
Val Gly Gin His Gly 45
Arg Ala Leu Ala Glu 60
Gly Leu Met Glu His 80
Val Thr Val Ser Asp 95
Ala Leu Gly Leu Lys 110
Gly Thr Trp Arg Gly 125
Leu Glu Ser Trp Glu 140
His Tyr Ala His Val 160
Gly Cys Glu Met Thr 175
Thr lie Ala Arg Val 190
Cys Asn His Gly Arg 205
Leu lie Ser Ser Ser
210 215 Ala Tyr Tyr Pro lie Asp Arg Trp Arg Asp Arg 225 230 235
Glu Val Ala Glu Ala His Glu Lys Pro Leu Phe
245 250 Cys Pro Ser Arg Ser Gly Ser Gly Ala Cys Pro
260 265 Pro Gly Ala Val Cys Leu Asp Glu Gin Ala Arg
275 280 Phe Ala Ala Met Pro Asp Glu Pro Trp Phe Lys
290 295 Glu Trp Pro Trp Lys Leu Tyr Pro Arg Glu Ala 305 310 315
Ser Tyr Cys lie Tyr Gly Lys Pro Ala Glu Asp
325 330 Phe Ser Ala lie Ala Asn Arg 340
〈210〉 7 〈211〉 1032 〈212〉 DNA 〈213〉人工合成 〈400〉 7
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac
220
Val Pro Val Leu Arg 240
Phe Met Glu Val Gly 255
Trp Asp Tyr Arg His 270
Phe Tyr Glu Ala Met 285
Gly Tyr Met Leu Trp 300
Ala Ser Glu Asp Gly 320
Val Val Ala Arg Ala 335
60
agcagcggcc tggtgccgcg cggcagcca/t
atggctagca tgggacggat cgaaagcgca ttcgatctcg gcttcatccg aggcatgacc 120
tttggcUcg tcggccagca cgggacgtgg ggaaccgacg aggcgcgcgc atcgatgcgt 訓
gcgcttgccg aacagccctt caactgggtg acgctcgcct tcgcgggcct catggagcac 240
cccggcgatc ccgccatcgc gtatgggcct ccggtcaccg tgagcgacga cgagattgcg 300
tcgatggcgg agcttgccca cgcactcggg ctcaaggtgt gcctgaagcc gaccgtgaac 360
tgccgagacg ggacgtggcg aggcgagatc cggttcgaga aggaacacgg cccggatctc 420
gagtcctggg aagcgtggtt tgggtcttat tccgacatga tggcccacta cgcgcatgtg 480
gcgaagcgca cgggttgcga gatgttctgc gtgggctgcg卿tgacgac tgccgagcca 540
cacgcagcca tgtggcgcga gaccatcgcg cgcgtgcgaa acgtacaact gcaaccacgg gcgcgaggag cacgtgcgct atctcgtcga gcgcctacta tcccatcgac cggtggcgag gaggtggcag aggcgcatga aaagccgctc ttcttcatgg tccggctccg gcgcctgccc gtgggactac cggcacccag caggcgcggt tctacgaagc catgttcgcc gccatgcccg t織tgctgt gggaatggcc gtggaagctg tacccgcgcg agctactgca tctacggcaa accggccgag gacgtcgtgg gcaaatcgat ga
〈210〉 8
〈211〉 343
〈212〉 PRT
<213〉 重组表达
<400〉 8
Met Gly Ser Ser 1
Arg Gly Ser His 20
Leu Gly Phe lie 35
Thr Trp Gly Thr 50
Gin Pro Phe Asn 65
Pro Gly Asp Pro
Asp Glu lie Ala 100
Val Cys Leu Lys 115
Glu lie Arg Phe
His His 5
Met Ala
Arg Gly
Asp Glu
Trp Val 70 Ala lie 85
Ser Met Pro Thr Glu Lys
His His His
Ser Met Gly 25
Met Thr Phe 40
Ala Arg Ala 55
Thr Leu Ala
Ala Tyr Gly
Ala Glu Leu 105
Val Asn Cys
120 Glu His Gly
His Ser 10
Arg lie
Gly Phe
Ser Met
Phe Ala
75 Pro Pro 90
Ala His Arg Asp Pro Asp
ccgagtacga cggcctcgtg 600
tctgggacgc ggtcgatctc 660
atcgcgtgcc tgtgctccgc 720
aagtggggtg cccgagccgc 780
gcgccgtctg tcttgacgag 840
acgagccgtg gttcaagggt 900
aagcggcgtc cgaggacgga 960
cgcgggcgtt ctcggccatc 1020
1032
Ser Gly Leu Vsl Pro 15
Glu Ser Ala Phe Asp 30
Val Gly Gin His Gly 45
Arg Ala Leu Ala Glu 60
Gly Leu Met Glu His 80
Val Thr Val Ser Asp 95
Ala Leu Gly Leu Lys 110
Gly Thr Trp Arg Gly 125
Leu Glu Ser Trp Glu130 135 140
Ala Trp Phe Gly Ser Tyr Ser Asp Met Met Ala His Tyr Ala His Val 145 150 155 160
Ala Lys Arg Thr Gly Cys Glu Met Phe Cys Val Gly Cys Glu Met Thr
165 170 175
Thr Ala Glu Pro His Ala Ala Met Trp Arg Glu Thr lie Ala Arg Val
180 185 190
Arg Thr Glu Tyr Asp Gly Leu Val Thr Tyr Asn Cys Asn His Gly Arg
195 200 205
Glu Glu His Val Arg Phe Trp Asp Ala Val Asp Leu lie Ser Ser Ser
210 215 220
Ala Tyr Tyr Pro lie Asp Arg Trp Arg Asp Arg Val Pro Val Leu Arg 225 230 235 240
Glu Val Ala Glu Ala His Glu Lys Pro Leu Phe Phe Met Glu Val Gly
245 250 255
Cys Pro Ser Arg Ser Gly Ser Gly Ala Cys Pro Trp Asp Tyr Arg His
260 265 270
Pro Gly Ala Val Cys Leu Asp Glu Gin Ala Arg Phe Tyr Glu Ala Met
275 280 285
Phe Ala Ala Met Pro Asp Glu Pro Trp Phe Lys Gly Tyr Met Leu Trp
290 295 300
Glu Trp Pro Trp Lys Leu Tyr Pro Arg Glu Ala Ala Ser Glu Asp Gly 305 310 315 320
Ser Tyr Cys lie Tyr Gly Lys Pro Ala Glu Asp Val Val Ala Arg Ala
325 330 335
Phe Ser Ala lie Ala Asn Arg
340
<210〉9
<211>1173
<212〉DNA
〈213〉人工合成
〈400〉9
tcgacggcat ggtcgcccac accgagagca tgatccaagc ggggcttccg cttctccagc 60 gaggcgaata c已caggcggc cgatacgcgt acttcgacgg cgcgtcgtct gcgcgagccg 120 tgattgaact gctggaa獄gaccgccgtt gaggcgcctt ggaggtgaac tgggatggga 180cggatcgaaa gcgcattcga tctcggcttc atccgaggca tgacctttgg cttcgtcggc 240
cagcacggga cgtggggaac cgacgaggcg cgcgcatcga tgcgtgcgct tgccgaacag 300
cccttcaact gggtgacgct cgccttcgcg ggcctcatgg agcaccccgg cgatcccgcc 360
atcgcgtatg ggcctccggt caccgtgagc gacgacgaga ttgcgtcg已t ggcggagctt 420
gcccacgcac tcgggctcaa ggtgtgcctg aagccgaccg tgaactgccg agacgggacg 480
tggcgaggcg agatccggtt cgag3aggaa cacggcccgg atctcgagtc ctggga3gcg 540
tggtttgggt cttattccga catgatggcc cactacgcgc atgtggcg犯gcgcacgggt 600
tgcgagatgt tctgcgtggg ctgcgagatg acgactgccg agccacacga agccatgtgg 660
cgcgagacca tcgcgcgcgt gcgaaccgag tacgacggcc tcgtgacgta caactgcaac 720
cacgggcgcg aggagcacgt gcgcttctgg gacgcggtcg atctcatctc gtcgagcgcc 780
tactatccca tcgaccggtg gcgagatcgc gtgcctgtgc tccgcgaggt ggcagaggcg 840
catgaaaagc cgctcttctt catggaagtg gggtgcccga gccgctccgg ctccggcgcc 900
tgcccgtggg actaccggca cccaggcgcc gtctgtcttg acgagcaggc gcggttctac 960
gaagccatgt tcgccgccat gcccgacgag ccgtggttca agggttacat gctgtgggaa 1020
tggccgtgga agctgtaccc gcgcgaagcg gcgtccgagg acggaagcta ctgcatctac 1080
ggcaaaccgg ccgaggacgt cgtggcgcgg gcgttctcgg ccatcgcaaa tcgatgacgg 1140
gc已cgcggtt cgtccgcgcc atccggtcga
1170
权利要求
1、一种β-甘露聚糖酶，该β-甘露聚糖酶具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.6所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列，或者对SEQ IDNO.2、SEQ IDNO.4、SEQ IDNO.6或SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而形成的β-甘露聚糖酶活性不变的氨基酸序列。
2、 根据权利要求1所述的P-甘露聚糖酶，其中，该(3-甘露聚糖酶具有 SEQ ID: N0.2所示的氨基酸序列，SEQ ID: N0.4所示的氨基酸序列，SEQ ID: N0.6所示的氨基酸序列，或者SEQID: NO. 8所示的氨基酸序列。
3、 编码权利要求l所述的P-甘露聚糖酶的基因。
4、 根据权利要求3所述的基因，该基因具有SEQID: NO. l所示核苷 酸序列，SEQ ID: N0.3所示的核苷酸序列，SEQ ID: NO. 5所示的核苷酸 序歹U， SEQ ID: NO. 7所示的核苷酸序列，或者对SEQ ID: NO. 1、 SEQ ID: NO. 3、 SEQ ID: NO. 5或SEQ ID: NO. 7所示的核苷酸序列进行一个或几 个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码活性不变的P-甘露聚糖酶的核苷酸 序列。
5、 根据权利要求4所述的基因，该基因具有SEQ ID: NO. l所示的核 苷酸序列，SEQ ID: N0.3所示的核苷酸序列，SEQ ID: NO. 5所示的核苷 酸序列，或者SEQID: N0.7所示的核苷酸序列。
6、 一种重组载体，该重组载体含有权利要求3-5中任意一项所述的基因。
7、 根据权利要求6所述的重组载体，其中，该重组载体为重组质粒。
8、 根据权利要求7所述的重组载体，其中，该重组载体为重组质粒 pUC1.17或重组质粒pETMAN-HA963。
9、 一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞含有权利要求6所述的重组载体。
10、 根据权利要求9所述的重组宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌。
11、 根据权利要求10所述的重组宿主细胞，所述大肠杆菌为大肠杆菌 DH5a或大肠杆菌BL21 (DE3)。
12、 根据权利要求11所述的重组宿主细胞，该重组宿主细胞为保藏编 号为CGMCCNo.2051的重组大肠杆菌DH5a (pUC1.17)。
13、 一种(3-甘露聚糖酶的制备方法，该方法包括培养权利要求9-12中 任意一项所述的重组宿主细胞。
全文摘要
本发明提供了一种β-甘露聚糖酶，该β-甘露聚糖酶具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.6所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列，或者对SEQ IDNO.2、SEQ IDNO.4、SEQ IDNO.6或SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而得到的β-甘露聚糖酶活性不变的氨基酸序列。本发明还提供了编码上述β-甘露聚糖酶的基因、含有所述基因的重组载体和含有所述重组载体的宿主细胞。本发明还提供了一种β-甘露聚糖酶的制备方法，该方法包括培养本发明提供的宿主细胞。本发明提供的β-甘露聚糖酶具有耐热耐酸性，可以利用本发明构建的原核表达系统进行生产，而且可以利用六个组氨酸标签进行纯化。
文档编号C12N1/21GK101392241SQ20071012192
公开日2009年3月25日 申请日期2007年9月18日 优先权日2007年9月18日
发明者张跃灵, 薛燕芬, 马延和 申请人:中国科学院微生物研究所