用于鉴定亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)基因型的核酸引物组和探针的制作方法

专利名称：：用于鉴定亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)基因型的核酸引物组和探针的制作方法用于鉴定亚曱基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因型的核酸引物组和探针发明背景本发明涉及用于检测亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因中单核苷酸多态性的核酸引物组和探针。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是参与叶酸代谢的酶。其对于同型半胱氨酸的正常代谢是必需的。编码MTHFR的基因具有单核苷酸多态性C677T和A1298C。MTHFR基因的突变改变了其M酸构型并且降低了其活性。MTHFR基因中的突变会导致高同型半胱氨酸血症，并报道提高了患动脉石更化和结肠癌症的危险。此外，还报道了抗风湿药氨甲喋呤的副作用发生可能性与MTHFR基因多态性相关联。因此，值得分析MTHFR基因的突变以便预防药物的副作用。通过确定MTHFR基因的基因型还可以为患者量身定制药物施用和治疗。通常通过借助于聚合酶链式反应(PCR)扩增靶核普酸并用特异性探针检测野生型和突变体扩增产物来检测单核苷酸多态性(见JainK.K.，ApplicationofAmplicip.CYP450，MolDiagn.9，119國27[2005)。然而，PCR方法具有一些缺点，例如预处理过程(包括核苷酸提取)复杂，需要复杂的温控设备，例如热循环仪，以及需要2小时或更长的反应时间。通过PCR方法扩增的产物为双链，这导致产生一个问题，即互补链降低了检测灵敏度，在检测过程中其又作为探针的竟争者起作用。已经研究了将扩增产物转变成单链的多种方法，例如通过使用酶或磁珠将互^h^分解或分离。但是这些方法也存在操作复杂且昂贵的问题。发明简述根据本发明的一个方面，提供了用于检测MTHFR基因中单核苷酸多态性C677T的基因型的LAMP扩增的核苷酸引物组，其中当靼核苷酸从5，末端依次具有F3区、F2区和Fl区并且从3，末端依次具有B3c区、B2c区和Blc区时，并且当引物组包括在3，末端侧具有与F2区相同的序列并在5，末端侧具有与Fl区互补的序列的FIP引物、具有与F3区相同的序列的F3引物、在3'末端侧具有与B2c区互补的序列并在5，末端侧具有与Blc区相同的序列的BIP引物、以及具有与B3c区互补的序列的B3引物时，引物组包括选自表2所示引物组1-8的FIP引物和BIP引物、结合至M苦酸上距F2区5，末端60个g内区域的F3引物、以及结合至M苷酸上距B2c区3，末端60个碱基内区域的B3引物。表2所示引物组l-8如下引物组l:SEQIDNo:l的FIP引物和SEQIDNo:3的BIP引物;引物组2:SEQIDNo:l的FIP引物和SEQIDNo:4的BIP引物;引物组3:SEQIDNo:l的FIP引物和SEQIDNo:5的BIP引物;引物组4:SEQIDNo:l的FIP引物和SEQIDNo:6的BIP引物;引物组5:SEQIDNo:l的FIP引物和SEQIDNo:7的BIP引物;引物组6:SEQIDNo:9的FIP引物和SEQIDNo:3的BIP引物;引物组7:SEQIDNo:9的FIP引物和SEQIDNo:4的BIP引物;引物组8:SEQIDNo:9的FIP引物和SEQIDNo:5的BIP引物。根据本发明的另一个方面，提供了用于检测MTHFR基因中单核苷酸多态性A1298C的基因型的LAMP扩增的核普酸引物组，引物组包括选自表3所示引物组1-5的FIP引物和BIP引物、结合至M香酸上距F2区5，末端60个g内区域的F3引物、以及结合至M苷酸上距B2c区3，末端60个碱基内区域的B3引物。表3所示引物组l-5如下引物组1:SEQIDNo:14的FIP引物和SEQIDNo:16的BIP引物；引物组2:SEQIDNo:14的FIP引物和SEQIDNo:17的BIP引物；引物组3:SEQIDNo:14的FIP引物和SEQIDNo:19的BIP引物；引物组4:SEQIDNo:14的FIP引物和SEQIDNo:20的BIP引物；引物组5:SEQIDNo:14的FIP引物和SEQIDNo:21的BIP引物。根据本发明的另一个方面，提供了检测MTHFR基因中单核苷酸多态性C677T或A1298C的基因型的方法，包括步骤通过使用核苷酸引物组扩增耙核苷酸得到扩增产物；和测定并比较扩增产物中所包含的野生型扩增产物和突变体扩增产物的量。本发明的另一个方面提供了用于检测通过使用核苷酸引物组扩增自苷酸所得到扩增产物的核苷酸探针。在一个方面，野生型核苷酸探针与野生型扩增产物互补并具有62-73匸的Tm值，而突变体核苷酸探针与突变体扩增产物互补并具有61-71X:的Tm值，并且单核苷酸多态性C677T位点位于距各个核苷酸探针末端3个或更多个碱基的内部。在另一个方面，野生型核苷酸探针与野生型扩增产物互补并具有64-72C的Tm值，而突变体核苷酸^:针与突变体扩增产物互补并具有63-73"C的Tm值，并且单核苷酸多态性A1298C位点位于距各个核苷酸探针末端3个或更多个碱基的内部。本发明的另一个方面提供了同时检测MTHFR基因的单核苷酸多态性C677T和A1298C的基因型的方法。本发明还提供了用于检测MTHFR基因的单核苷酸多态性基因型的核苷酸引物和检测探针。因此，可以容易且成本低廉ilM^测MTHFR基因的C677T和A1298C单核苷酸多态性。附图简述图1是LAMP方法的示意图；图2^!3兌明LAMP方法中中间产物以及内引物(FIP和BIP)退火位点的示意图；图3是"^兌明环引物位置的示意图；图4gj说明LAMP方法中中间产物以及环引物(LFc和LBc)退火位点的示意图；图5是说明扩增产物检测位置的示意图；图6是探针固定化支持物的一个实施方案的平面示意图；图7是说明探针固定化支持物的一个实施方案的平面示意图；图8显示FIP引物位置的示意图；图9显示通过^f吏用引物组得到的扩增产物的电泳图；图IO是显示非特异扩增产物的电泳图；图11显示了用于检测C677T的探针的试验结果1的图；图12显示了用于检测C677T的探针的试验结果2的图；图13A显示了用于检测C677T的探针的试验结果3(野生型)的图；图13B显示了用于检测C677T的探针的试验结果3(突变体)的图；图13C显示了用于检测C677T的探针的试验结果3(杂合子)的图；图14显示了用于检测A1298C的探针的试验结果1的图；图15显示了用于检测A1298C的探针的试验结果2的图；图16显示了同时检测C677T和A1298C的结果图。发明详述PCR方法经常用于检测单核苷酸多态性，但是PCR方法具有上述缺点。因此，在本发明中单核苷酸多态性通过替代PCR方法的环介导的等温扩增(LAMP)方法检测。在LAMP方法中，核苷酸在60-65"C等温条件下扩增。LAMP方法具有优点，即与PCR方法相比可以在更短的时间内得到更大量的扩增产物。还报道，反应受样品中杂质的影响较小。通过LAMP方法可以容易地扩增耙核苷酸。在本发明的一个实施方案中，通过LAMP方法扩增了耙核苷酸，并且分别测定了扩增产物中野生型扩增产物和突变体扩增产物的量。当存在许多野生型扩增产物时，可将所试验耙核苷酸的基因型判定为野生型纯合子。相反，当存在许多突变体扩增产物时，可将耙核苷酸的基因型判定为突变体纯合子。备选地，当野生型和突变体扩增产物的量几乎相等时，将M苷酸的基因型判定为杂合子。例如卩吏用核苷酸探针测定扩增产物的量。核苷酸探针包括与野生型扩增产物互补的探针和与突变体扩增产物互补的探针。允许扩增产物与各个核苷酸探针彼此杂交，并且测定结合至各个核普酸探针的扩增产物的量。通过比较结合至野生型核苷酸探针的扩增产物的量和结合至突变体核普酸探针的扩增产物的量可以确定把核苷酸的基因型。LAMP方法概述在下文将简要描述LAMP方法。在本说明书中，将进行单核苷酸多态性检测的核苷酸(包括基因组DNA等)将称作分析物核苷酸。通过LAMP方法扩增的MTHFR基因的区域被称作耙核苷酸。通过LAMP方法得到的产物将称作扩增产物。包含人基因组DNA的溶液将称作样品溶液。在LAMP方法中，将靼核苷酸设计成从5，末端依次具有F3区、F2区和Fl区并且从3，末端依次具有B3c区、B2c区和Blc区。使用图1所示的4种引物扩增M苷酸。Flc、F2c、F3c、Bl、B2、B3区是互补链上分别对应于F1、F2、F3、Blc、B2c和B3c区的区域。在LAMP方法中用于扩增核苷酸的4种引物是(l)在3，末端侧具有与F2区相同的序列并在5，末端侧具有与Fl区互补的序列的FIP引物；(2)具有与F3区相同的序列的F3引物；(3)在3'末端侧具有与B2c区互补的序列并在5，末端侧具有与Blc区相同的序列的BIP引物；和(4)具有与B3c区互补的序列的B3引物。通常，FIP和BIP引物称作内引物，而F3和B3引物称作外引物。使用4种引物进行LAMP扩增得到如图2所示具有哑铃结构的中间产物。FIP和BIP引物结合至单链环的F2c区和B2c区，并且延伸反应从每一引物的3，末端和中间产物自身的3，末端开始进行。细节见日本专利号3313358。通it^LAMP方法中任选地4吏用称作环引物的引物，可以缩短扩增时间段。在此情况下，如图3所示，在从F2区至F1区的区域内设计LF区并且在从B2c区至Blc区的区域内设计LBc区。这些区域称作环引物区。除了使用4种引物之外，还使用具有与LF区互补的序列的环引物LFc和具有与LBc区相同的序列的环引物LBc。细节见WO2002/024卯28。这些环引物LFc和LBc可同时使用，或者备选地，仅使用它们中的一个。如图4所示，环引物与环退火，与其退火的环与FIP和BIP引物所退火的环是不同的环。从而给出另外的合成起点并因此加速扩增。检测LAMP扩增产物；核苷酸探针为了检测单核苷酸多态性，如图5所示，待检测的多态性位点位于FP区或BPc区。如图5所示，从F2区至F1区的区域是在扩增产物中变成单链的部分。类似地，从B2c区至Blc区的区域也是在扩增产物中变成单链的部分。通过将待检测的多态性位点至于单链部分，使得通过核苷酸探针的检测更容易。将核苷酸探针设计成结合至包含多态性位点的FP区或BPc区。因此，核苷酸探针具有与在FP区或BPc区包含多态性位点的区域互补的序列。在扩增产物中还存在与FP区互补的FPc区以及与BPc区互补的BP区。因此，可以^f吏用FPc区和BP区用于检测。在本说明书中，包含与野生型扩增产物序列互补的序列的核苷酸探针称作野生型核苷酸探针，而包含与突变体扩增产物序列互补的序列的核苷酸探针称作突变体核苷酸探针。核普酸探针可以包括，但不限于，DNA、RNA、PNA、LNA、具有曱J^磷酸酯骨架的核苷酸或者合成的核普酸链。为了将其固定化于支持物上，其末端可以用活性官能团如氨基、羧基、羟基、巯基或磺酰基修饰。可在官能团和核苷酸之间导入间隔区。间隔区可以具有例如烷烃骨架、乙二醇骨架等。核苷酸探针固定化支持物核苷酸探针可以例如作为固定化于支持物上的探针使用。在已知的装置，如所谓的DNA芯片和DNA微点阵中可以使用核苦酸探针固定化支持物。探针固定化支持物的一个实施方案如图6所示。探针被固定化于支持物1的固定化区域2中。支持物l可以用硅基质制备，但不限于珪基质。探针可以通过已知方法固定化。可以将一种探针固定化于支持物上，或者将不同种类的探针固定化于支持物上，其位置和数量根据本领域技术人员的需要而变化。如将在下文所述，根据本发明的探针固定化支持物可用于探针的荧光检测。探针固定化支持物的另一个实施方案的示意图如图7所示。在本实施方案中，在支持物11上形成电极12。探针固定化在电极12上。每一电极12与提取电信息的垫(pad)13相连。支持物11可以从例如硅基质制备，但不限于珪基质。电极的产生和探针的固定化可通过任何已知方法开展。电极可由任何材料制成，包括但不限于单一金属如金、金合金、银、铂、汞、镍、钯、硅、锗、镓和钨、其合金、碳如石墨和玻璃碳、以及它们的氧化物或化合物。图7中所示的固定化支持物具有10个电极，但是在单一支持物上形成的电极的数量不限于此并且可以任选地改变。电极的位置模式也不限于图中所示的模式，其可以根据本领域技术人员的需要而改变。根据需要，可在支持物1上形成参比电极和反电极。如下文将描述，当探针被电化学方式检测时，可使用根据该实施方案的探针固定化支持物。核苷酸探针与扩增产物的杂交在适宜条件下，扩增产物杂交至核苷酸^针。适宜M^L据扩增产物的种类和结构、在待检测序列中包含的核苷酸的种类、以及核苷酸探针的种类而改变。具体而言，杂交在离子强度范围为0.01-5并且pH范围在5-10的緩冲溶液中开展。可向反应溶液中加入硫酸葡聚糖(一种杂交促进剂)、鲑精DNA、牛胸腺DNA、EDTA、表面活性剂等。反应温度例如在10-卯"C范围内，反应混合物可以搅拌或振荡以改善反应效率。反应之后，例如离子强度范围为0.01-5并且pH范围为5-10的緩沖溶液用于洗涤。检测方法固定化于支持物上的探针与扩增产物之间的杂交产生双链核苷酸。双链核苷酸可用电化学方式检测或荧光检测。(a)电流检测系统下面将描述双链核苷酸的电化学检测。方法使用识别双链的化合物，该化合物特异识别双链核苷酸。识别双链的化合物的实例包括但不限于Hoeches33258、吖咬橙、米帕林、柔红霉素、金属嵌入剂、双嵌入剂如双吖啶、三嵌入剂和多嵌入剂。这些物质可以用电化学活性金属^^物，如二茂铁或紫精修饰。识别双链的化合物的浓度会根据其种类而改变，但通常使用的浓度范围为1ng/mL至1mg/mL。在该情况下，优选使用离子强度范围为0.001-5并且pH范围为5-10的緩冲溶液。在杂交过程中或杂交后向反应溶液中加入识别双链的化合物。如果通过杂交形成了双链核苷酸，则识别双链的化合物结合至双链核苷酸。例如通过施加高于导致识别双链的化合物发生电化学反应的电位的电位可以测量从识别双链的化合物产生的反应电流。在该情况下，可以恒定速度施加电位，或者以脉冲形式施加或者以恒定电压施加。在测定过程中，通过4吏用装置如恒电位仪、数字多用表或函数发生器控制电流和电压。例如，优选使用在JP-A10-146183(KOKAI)中公开的已知的电化学检测方法。(b)荧光检测方法下面将描述通过荧光检测双链核苦酸的方法。先前用荧光活性物质标记引物。备选地，使用用荧光活性物质标记的二级探针检测。可使用带有多重标记的二级探针。荧光标记物质的实例包括但不限于荧光色料，例如FITC、Cy3、Cy5和罗丹明。荧光材料用例如荧光检测器检测。适宜标记种类的检测器用于检测标记的待检测序列或二级探针。核苷酸引物的选择图8是显示核苷酸引物的示意图，其中单核苷酸多态性C677T位于F2和F1之间的区域，即FP区。FIP引物具有与F2区序列相同的序列和与Fl区序列互补的序列。可以设计多种类型的引物，只要F2区和F1区200710188780.7说明书第9/33页的位置使得C677T位于它们之间即可。然而，本发明人的研究已经显示，通过LAMP方法的扩增效率根据引物的种类而改变。例如，使用图8内所示4种引物中的一个引物和常用的3个引物(BIP、F3和B3引物)开展扩增。结果，甚至在足够的时间段之后，例如2小时之后具有引物1的样品仍然没有扩增。具有引物2的样品在大约l小时之后扩增，但出现引物的非特异扩增。具有引物3的样品没有导致引物的非特异扩增，但是需要的扩增时间段为1.5-2小时。具有引物4的样品没有导致引物的非特异扩增并且在1小时内完成扩增。在该情况下，优选用于扩增的引物是引物3和引物4，并且最佳引物是引物4。因此它是优越的引物，扩增效率更高，允许在短时间内扩增并且未导致非特异性扩为了用核普酸探针检测扩增产物，扩增产物优选地用核苷酸探针以高效率杂交。因此，在评估引物时还可考虑扩增产物的杂交效率。至于不具有单核苷酸多态性位点的其它内引物，其被优选地设计成从F2至B2的区域长度优选450bp或更少、更有选350bp或更少。单链区，即从F2至Fl的区域或者从B2c至Blc的区域的长度优选100bp或更少、更有选地70bp或更少。引物间的非特异性扩增是LAMP反应中常见的现象。包含Flc区和F2区的引物FIP常常是长链核苷酸。同样，包含Blc区和B2区的BIP引物常常是长链核苷酸。因此，在FIP引物当中、在BIP引物当中或者FIP和BIP引物彼此纠缠在一起，常常允许以引物为模板进行扩增。与PCR反应相比，LAMP反应中的非特异性反应的可能性较高，因为反应溶液包含F3和B3引物，并且在一些情况下还额外包含LFc和LBc引物。此类非特异性反应导致通过使用分析物核苷酸作为模板得到的目的LAMP产物的量降低。如果在未加入分析物核苷酸的阴性对照反应溶液中出现非特异性反应，则不能确定随着扩增的进行释放的焦磷酸和Mg的白色沉淀是由非特异扩增导致的还是由污染导致的。因此，排除可能导致非特异扩增的引物是重要的。因此，本发明人已经开展试验，以选择最适合扩增MTHFR基因的单物。[试验l:用于C677T的引物通过使用在FP区包含MTHFRC677T多态性位点的14种核苷酸引物组，于63C开展扩增1小时或2小时。反应溶液成分如表l所示。使用的^^板DNA是人基因组。为了检查污染和非特异性扩增存在与否，在所有组中准备了用灭菌超纯7jC代替人基因组的阴性对照。在扩增反应之后，扩增产物通过3%琼脂糖电泳鉴定。所使用的核苷酸引物组示于表2。表lLAMP反应组成<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表2设计在FP和FPc区具有C677T的引物组<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(接下页)表2设计在FP和FPc区具有C677T的引物组<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>在所有引物組中，SEQIDNo.lO的核苷酸用作F3引物。在引物组l、6、9和11中，SEQIDNo.11的核苷酸用作B3引物；在引物组2、3、4、5、7、8、12和13中，SEQIDNo.12的核苷酸用作B3引物；并且在引物组10和14中，SEQIDNo.13的核苷酸用作B3引物。试验1:结果I将用引物组l、2和9扩增1小时或2小时后的反应产物进行电泳。结果总结于图9中。使用引物组9甚至在扩增2小时后仍然没有得到扩增产物。使用引物组1反应1小时后没有得到扩增产物。在反应2小时后得到了足够量的扩增产物。使用引物组2在反应1小时后得到足够量的扩增产物。使用其它引物组开展了相似试验。结果，在反应1小时后得到足够量扩增产物的引物组是引物组2、3、4、5、7、8、12和13。在反应2小时后得到足够量扩增产物的引物组是引物组l、2、3、4、5、6、7、8、12和13。4吏用引物组9、10、11和14得到了相似量的扩增产物或者没有得到扩增产物。各个引物组的阴性对照也进行了电泳。结果，使用引物组12和13未观察到非特异性扩增。代表性的实例示于图10。上面的结果表明，引物组l、2、3、4、5、6、7和8是优选的，并且引物组2、3、4、5、7和8是最优选的。结果总结于表2。[试验2:用于A1298C的引物通过使用在FP区包含MTHFRA1298C多态性位点的9种核苷酸引物组，于63X:开展扩增1小时或2小时。反应溶液成分如表l所示。使用的模板DNA是人基因组。为了检查污染和非特异性扩增存在与否，在所有组中准备了用灭菌超纯7jC代替人基因组的阴性对照。在扩增反应之后，扩增产物通过3%琼脂糖电泳鉴定。所使用的核苷酸引物组示于表3。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>在所有引物组中，SEQIDNo.24的核苷酸用作F3引物。在引物组l、2、6、7、8和9中，SEQIDNo.25的核苷酸用作B3引物；并且在引物组4和5中，SEQIDNo.26的核苷酸用作B3引物。[试验2:结果结果，在反应1小时后得到足够量扩增产物的引物组是引物组l、2、4、5、8和9。在反应2小时后得到足够量扩增产物的引物组是引物组1、2、3、4、5、8和9。使用引物组6或7没有观察到扩增产物。使用引物组8和9观察到了非特异性扩增产物。上面的结果表明，引物组l、2、3、4和5是优选的，并且引物组l、2、4和5是最优选的。结果总结于表3。通过上面的结果确定了本发明所提供的优选的内引物。对于本领域的技术人员而言显而易见地是，LAMP反应中最重要的引物是内引物。虽然内引物是扩增反应所必需的，但是夕卜引物和环引物不是必需的。向扩增反应溶液中添加外引物和环引物会导致扩增效率提高，但是与内引物相比其位置的改变对扩增效率的影响较小。因此，外引物(F3和B3引物)可以任选i殳计。例如，其优选位于距F2区5，末端60个>5^范围内的区域内或者距B2c区的3，末端60个g内的区域内。因此，具有与F3引物相同的序列的F3区优选位于距F2区5，末端60个>5^范围内的区域内，并且具有与B3引物互补的序列的B3c区优选位于距B2c区3，末端60个g范围内的区域内。优选将环引物设计成结合至不同于内引物所结合环的环，并且环引物不位于内引物区。内引物、外引物和环引物优选地不位于可能存在突变的位点。如果内51物不得不设计在突变位置，则优选向此位置51入混合碱基或通用碱基，如脱氧肌苷。核普酸探针的选择核苷酸探针链既不能太长也不能太短。通常，链长度增加导致结合力增加，但根据g种类会存在一些差异。核苷酸探针的链长度过短导致降低核苷酸探针与扩增产物之间的杂交效率。相反，核苷酸探针的链长度过长导致野生型核苷酸探针与突变体核苷酸探针间的单碱基差异降低。结果，苷酸探针之间的非特异性结合增加。因此，优选使用具有适当链长度，如10-35个碱基的核苷酸探针来检测单核苷酸多态性。结合力可通过双链核普酸解离的温度，即Tm来表示。Tm值可通过例如近邻法、Wallance法或GC°/。法计算。在本发明中，使用的是近邻法(Breslauer等，1986;Freier等，1986;Schildkraut等，1965)。在本发明中，于50mM的Na+浓度和0.5pM的核苷酸探针(寡核苷酸)浓度条件下计算Tm值。在下文，将描述用于选择适用于检测根据本发明所得到扩增产物的核普酸探针的试验。[试验3-1:用于检测C677T的探针通过使用经PCR-RFLP分析确定为杂合子的人基因组作为模板，并且使用用于检测C677T的引物组2，于63"C开展LAMP扩增1小时。用于检测C677T的引物组2是经上述试验1确定为最佳的引物组。所得到的扩增产物在电流检测DNA芯片上检测。核苷酸探针所试验的核普酸探针的核苷酸序列示于表4。所使用的核苷酸探针是负链。核苷酸探针的3，末端经巯基修饰，以便固定化在电极上。阴性对照探针是其序列与MTHFR基因序列完全无关的核苷酸。表4在检测使用检测C677T的引物组2所扩增的产物中使用的核脊酸探针<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>用于核苷酸探针固定化的支持物在DNA芯片上制成金电极，并且在其上固定核苷酸^针。通过使用巯基与金之间的强结合力进行固定化。将包含具有巯基修饰末端的核苷酸探针的探针溶液点在金电极上，l小时后，将支持物浸在lmM巯基己醇溶液中，然后用0.2xSSC溶液洗涤。同一探针点在两个电极上。洗涤之后，用超纯水洗涤支持物，空气干燥，得到探针固定化支持物。分别在下列电极上固定核苷酸探针电极1-2:阴性探针(SEQIDNo.29)电极3-4:野生型核苷酸探针15mer(SEQIDNo.30)电极5-6:野生型核苷酸探针17mer(SEQIDNo.31)电极7-8:野生型核苷酸探针18mer(SEQIDNo.32)电极9-10:野生型核苦酸探针19mer(SEQIDNo.33)电极11-12:野生型核苷酸探针21mer(SEQIDNo.34)电极13-14:突变体核苷酸探4十17mer(SEQIDNo.35)电极15-16:突变体核苷酸探针19mer(SEQIDNo.36)电极17-18:突变体核苷酸探针20mer(SEQIDNo.37)电极19-20:突变体核苷酸探针24mer(SEQIDNo.38)。扩增产物与核苷酸探针间的杂交及其检测向通过扩增得到的扩增产物中加入终浓度为2xSSC的盐，然后允许混合物与电极上固定的核苷酸探针杂交。反应温度为35、45、50、55和60r并且反应时间段为60分钟。然后，用超纯水温和洗涤DNA芯片。将DNA芯片浸入含50/tM嵌入剂Hoechst33258的磷酸緩冲溶液中10分钟并洗涤，然后测定Hoechst33258分子的氧化电流反应。[试验3-l:结果结果总结于图11。随着反应温度的提高，信号增加了，W明反应温度的提高导致杂交效率的提高。于55和60C反应温度的试验得到几乎相同的结果。[试验3-2:用于检测C677T的探针I然后，以与试验3-l相似的方式开展杂交，不同的是反应温度为55"C并且反应时间为10、20、40、60和120分钟。试验3-2:结果结果总结于图12。反应时间为10和120分钟的试验得到几乎相同的结果，表明在10分钟后，杂交反应已经处于饱和状态。链长度相对较短的野生型核苷酸探针(15C:SEQIDNo.30和17C:SEQIDNo.31)和突变体核苷酸探针(17T:SEQIDNo.35)得到强度相对较低的信号。野生型核苷酸探针(18C:SEQIDNo.32,19C:SEQIDNo.33和21C:SEQIDNo.34)和突变体核苷酸探针(19T:SEQIDNo.36，20T:SEQIDNo.37和24T:SEQIDNo.38)得到强度几乎相等的信号。试验3-3:用于检测C677T的探针然后，以与试验3-l相似的方式开展杂交，不同的U应温度为55"C并且反应时间为20分钟。然后，将核苷酸探针固定化支持物浸入40、45或50X:的0.2xSSC洗涤緩沖液中20分钟。在本试验中用于扩增的分析物核苷酸是经PCR-聚合酶链式反应-限制性片段长度多肽性(RFLP)分析分别确定为野生型纯合子、突变体纯合子和杂合子的3种人基因组。试验3-3:结果结果总结于图13A-13C。当不洗涤DNA芯片时(仅用超纯水温和洗涤)，:探针检测到^突变体扩增产物，表明存在非特异性杂i:洗涤温度为40x:的结果几乎与不洗涤的结果相同。洗涤温度为45X:时，通过野生型核苷酸探针(18C和19C)可以高信号强度检测到野生型扩增产物，但是通过突变体核苷酸探针(19T和20T)几乎检测不到信号。同样，通过突变体核苷酸探针(19T和20T)可以高信号强度检测到突变体扩增产物，但是通过野生型核苷酸^4f(18C和19C)几乎检测不到信号，表明通过45X:洗涤打破了通过非特异性杂交所形成的键。杂合子扩增产物可^皮野生型核苷酸探针(18C和19C)和突变体核苷酸探针(19T和20T)以较高的信号强度检测到。在50"C洗涤后，检测到的电流较低，表明通过洗涤将扩增产物从核苷酸探针上分离下来。在50X:洗涤后，通过野生型核苷酸探针(21C)检测到的野生型扩增产物的信号降低，但是通过野生型核苷酸探针检测到的突变体扩增产物的信号仍然高，表明仍然存在非特异性结合。同样，通过突变体核苷酸探针(24T)检测到的突变体扩增产物的信号降低，而通过突变体核苷酸探针检测到的野生型扩增产物的信号仍然高。结果表明，野生型核苷酸探针(18C和19C)和突变体核苷酸探针(19T和20T)给出了理想的检测模式。因此，根据本发明最优选使用的核苷酸探4十是野生型核苷酸^^4f(18C:SEQIDNo.32和19C:SEQIDNo.33)和突变体核苷酸探针(19T:SEQIDNo.36和20T:SEQIDNo.37)。在试验中使用的核苷酸探针的Tm值也总结于表4。从表4中显而易见，在本发明中优选使用的核苷酸探针是Tm值为62-73"C、优选68-71*€的野生型核苷酸探针和Tm值为61-71匸、优选66-69r的突变体核普酸探针。[试验4-1:用于检测A1298C的探针l通过使用经序列分析确定为杂合子的人基因组作为模板，并且使用用于检测A1298C的引物组5,于63"C开展LAMP扩增1小时。用于检测A1298C的引物组5是经上述试验1确定为最佳的引物组。所得到的扩增产物在电流检测DNA芯片上检测。核苷酸探针所试验的核苷酸探针的核苷酸序列示于表5。所使用的核苷酸探针是负链。核苷酸探针的3，末端经巯基^^，以便固定化在电极上。阴性对照探针是其序列与MTHFR基因序列完全无关的核苷酸。表5在检测使用检测A1298C的引物组5所扩增的产物中使用的核苷酸探针<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>用于核苷酸探针固定化的支持物以与试验3-l相似的方式制备核苷酸探针固定化支持物。分别在下列电极上固定核苷酸探针电极1-2:阴性探针(SEQIDNo.29)电极3-4:野生型核苷酸探针25mer(SEQIDNo.39)电极5-6:野生型核苷酸探针27mer(SEQIDNo.40)电极7-8:野生型核苷酸探针29mer(SEQIDNo.41)电极9-10:野生型核普酸探针32mer(SEQIDNo.42)电极11-12:突变体核苷酸探针22mer(SEQIDNo.43)电极13-14:突变体核苷酸探针24mer(SEQIDNo.44)电极15-16:突变体核苷酸探针25mer(SEQIDNo.45)电极17-18:突变体核苷酸探针26mer(SEQIDNo.46)电极19-20:突变体核苷酸探针29mer(SEQIDNo.47)扩增产物与核苷酸探针间的杂交及其检测向通过扩增得到的扩增产物中加入终浓度为2xSSC的盐，然后允许混合物与电极上固定的核苷酸探针杂交。反应温度为35、45、50、55和60匸并且反应时间段为60分钟。然后，用超纯水温和洗涤DNA芯片。将DNA芯片浸入含50/tM嵌入剂Hoechst33258的磷酸缓沖溶液中10分钟并洗涤，然后测定Hoechst33258分子的氧化电流反应。[试验4-l:结果结果总结于图14。随着反应温度的提高，信号增加了，U明反应温度的提高导致杂交效率的提高。于55和60t:反应温度的试验得到几乎相同的结果。[试验4-2:用于检测A1298C的探针J然后，以与试验4-l相似的方式开展杂交，不同的A^应温度为55匸并且反应时间为20分钟。然后，将核苷酸探针固定化支持物浸入45n的0.2xSSC洗涤緩冲液中20分钟。在本试验中用于扩增的分析物核苷酸是经序列分析分别确定为野生型纯合子、突变体纯合子和杂合子的3种人基因组。[试验4-2:结果结果总结于图15。通过野生型核苷酸探针(27A和29A)可以高信号强;l检测到野生型扩增产物，但是通过突变体核苷酸探针(24C、25C和26C)几乎检测不到信号。同样，通过突变体核苷酸探针(24C、25C和26C)可以高信号强度检测到突变体扩增产物，但是通过野生型核苷酸探针(27A和29A)几乎检测不到信号。杂合子扩增产物可被野生型核普酸探针(27A和29A)和突变体核苷酸探针(24C、25C和26C)以较高的信号强度检测到。结果表明，野生型核苷酸^4t(27A和29A)和突变体核苷酸探针(24C、25C和26C)给出了理想的检测模式。因此，根据本发明最优选使用的核苷酸探针是野生型核苷酸探针(27A:SEQIDNo.40和29A:SEQIDNo.41)和突变体核苷酸探4十(24C:SEQIDNo.44，25C:SEQIDNo.45和26C:SEQIDNo.46)。在试验中使用的核苷酸探针的Tm值也总结于表5。45中显而易见，在本发明中优选使用的核苷酸探针是Tm值为64-72"C、优选67-68X:的野生型核苷酸探针和Tm值为63-73匸、优选67-70t:的突变体核香酸探针。分析物样品在本发明中使用的分析物样品并无特别限制，例如可使用人血液、血清、白细胞、毛根或口腔粘膜。从分析物样品中提取核苷酸成分，得到样品溶液用于试验以便检测乾核苷酸。提取方法并无特别限制，例如可使用商业上可获得的核苷酸提取工具，例如QIAamp(QIAGEN制造)或Sumaitest(SumitomoMetalIndustriesLtd.制造)。试剂盒本发明的另一方面提供试剂盒，其包含用于根据本发明检测方法中LAMP法的上述引物组。试剂盒还任选包含例如链替换性DNA聚合酶、合成底物和緩冲溶液。在另一方面，本发明提供用于检测根据本发明引物组所扩增的扩增产物的核苷酸探针。本发明还提供在其上固定有本发明核苷酸探针的核苷酸探针固定化支持物。探针固定化支持物优选作为DNA芯片或DNA微点阵提供。物，在另一方面，本发明提供同时检测MTHFR的单核普酸多态性C677T和A1298C的方法。在该方面，如上所述分别扩增C677T和A1298C，然后将扩增产物混合制备成液体混合物。如上所i^t液体混合物进行检测。在该方面，可以同时检测基因型C677T和A1298C。实施例通过引入环引物缩短扩增时间分别以40pmol的量向25|il反应溶液中的用于检测C677T的核苷酸引物组2中添加LBc环引物SEQIDNo.27(见表2)，或向25jLil反应溶液中的用于检测A1298C的核苷酸引物组5中添加LBc环引物SEQIDNo.28(见表3)，然后扩增。结果饱和扩增阶段从60分钟缩短为约30分钟。同时检测C677T和A1298C开展了同时检测C677T和A1298C的试验。分别使用用于检测C677T基因组样品1小时。人基因组是经PCR-RFLP分析或序列分析分别确定为野生型纯合子、突变体纯合子和杂合子的3种人基因组。扩增反应后，将分别来自C677T和A1298C的两种扩增产物混合，制备混合的反应溶液。核苷酸探针的反应溶液。核苷酸探针如下C677T:野生型核苷酸探针(SEQIDNo.32)突变体核苷酸探针(SEQIDNo.37)A1298C:野生型核苷酸探针(SEQIDNo.40)突变体核苷酸探针(SEQIDNo.45)。所有的核苷酸探针均为负链，并且核苷酸探针的3，末端被巯基修饰。核苷酸探针固定化的电极的制备以与上面试验3-1中描述方法相似的方式制名^核苷酸探针固定化的电极。分别在下列电极上固定核苷酸探针电极1-2:阴性探针(SEQIDNo.29)电极3-4:C677T野生型核苷酸探针26mer(SEQIDNo.32)电极5-6:C677T突变体核苷酸探针27mer(SEQIDNo.37)电极7-8:A1298C野生型核香酸探针23mer(SEQIDNo.40)电极9-10:A1298C突变体核苷酸探针26mer(SEQIDNo.45)。扩增产物与核苷酸探针之间的杂交及其检测以与试验3-2相似的方式开展试验。[结果l结果总结于图16。对于C677T和A1298C观察到了理想的检测模式。结果表明，使用根据本发明的DNA芯片可同时检测C677T和A1298C。对于本领域技术人员而言，可以容易想到额外的优点和修改。因此，较宽方面的本发明并不限于本文所示和所述的特定细节和代表性实施方案。因此，在不脱离如后附权利要求及其等效物所定义的总体发明概念的精神和范围的情况下，可以进行多种修改。序列表〈110〉株式会社东芝(KabushikiKaishaToshiba)〈120〉用于鉴定亚甲基四氢叶酸还原酶基因型的核酸引物组和探针〈130>07S0619〈140><141>〈150〉JP2007-084288〈151〉2007-03-28〈160〉47〈170>Patentlnversion3.1<210〉1<211>38<212〉腿<213>C677T引物FIP-1<400〉1tcagcctc犯agaaaagctgaggctgacctgaagcact38<210〉2〈211>41〈212>腿〈213〉C677T引物BIP-1<400〉2cttccgctttgtgaaggcatgcccctcacctggatgggaaa41〈210〉3<211>43<212>腿〈213〉C677T引物BIP-2<400〉3cacattcttccgctttgtgaaggcccctcacctggatgggaaa43〈210>4〈211〉40〈212>DNA<213〉C677T引物BIP-3〈400〉4caggagagcccataagctcccttcagcactccacccagag40<210〉5〈211〉40〈212>DNA<213〉C677T引物BIP-4<400〉5gagagcccataagctccctccatcagcactccacccagag40<210>6〈211〉40<212>DNA〈213〉C677T引物BIP-5〈400〉6gagagcccataagctccctccaactcagcactccacccag40<210〉7〈211〉39〈212〉DNA〈213〉C677T引物BIP-6〈400>7agcccataagctccctccaccactcagcactccacccag39〈210〉8〈211〉34<212〉隱〈213〉C677T引物BIP-7<400〉8ccatcgtccccgggaggagcttatgggctctcct34<210>9〈211〉42<212〉腿<213>C677T引物FIP-2〈400〉9gcctcaaagaaaagctgcgtgtgaagcacttgaaggagaagg42〈210〉10〈211〉18〈212〉腿<213>C677T引物F3〈400〉10gttaccccaaaggccacc18<210>11<211>19〈212〉腿〈213〉C677T引物B3—1〈400〉11ggagcttatgggctctcct19〈210〉12<211>19〈212〉<213〉C677T引物B3-2<400>12tctgggaagaactcagcga19<210>13〈211〉18<212〉腿〈213〉C677T引物B3-3<400〉13tcagcactccacccagag18〈210〉14〈211〉39<212>腿〈213〉A1298C引物FIP-1〈400〉14cggtttggttctcccgagagggctgaagatgtgggggga39<210>15〈211〉44〈212〉DNA〈213>A1298C引物BIP-1〈400〉15gtcacaaagtgagtgatgctggagtacaggatggggaagtcaca44<210>16〈211〉40<212〉腿<213>A1298C引物BIP-2〈400〉16gtcacaaagtgagtgatgctggagtagctggggtcaggcc40<210〉17<211〉35〈212>腿<213〉A1298C引物BIP-3〈400>17gtgagtgatgctggagtgggagctggggtcaggcc35〈210〉18<211>33〈212〉〈213>腿A1298C引物BIP-4〈400>18gtgagtgatgctggagtgggccgcagcctggcc〈210〉19〈211〉31<212>廳〈213〉A1298C引物BIP-5〈400〉19ccctggttcatcccctgcccgcagcctggcc31〈210〉20<211>34〈212〉腿<213>A1298C引物BIP-6〈400〉20ccctggttcatcccctgcggaagtcacagccccg34<210>21〈211〉33〈212〉DNA〈213〉A1298C引物BIP-7〈400〉21agctgcaggccaggctgatggaggggagggcac33<210>22〈211〉42〈212〉腿〈213>A1298C引物FIP-2〈400〉22tggttxtcccgagaggtaaagaacgctgaagatgtgggggga42〈210〉23〈211〉42<212>DNA〈213>A1298C引物FIP-3<400>23tggUctcccgagaggtaaagaacgctgaagatgtgggggga42<210〉24<211〉26〈212〉DNA<213〉A1298C引物F3〈400〉24gctgaaggactactacctcttctacc26〈210〉25<211〉18<212〉DNA〈213〉A1298C引物B3-1〈400〉25gcacagg3tggggaagtc18<210>26〈211〉18〈212〉DNA〈213〉A1298C引物B3-2〈400〉26ctttgccatgtccacagc18〈210〉27〈211〉21〈212〉腿<213〉C677T引物LBc<400〉27ccgcaccgtcctcgcacaggc21<210>28<211>16〈212>腿<213>A1298C引物LBc<400〉28cggggctgtgacttcc16〈210〉29<211>14〈212〉DNA〈213〉阴性对照探针〈400>29gtgctgcaggtgcg14<210〉30<211>15<212>DNA<213〉C677T野生型探针〈400〉30tgaaatcggctcccg15<210>31〈211〉〈212〉〈213〉17DNAC677T野生型探针〈400〉31atgaaatcggctcccgc<210〉32〈211〉18<212〉DNA〈213>C677T野生型探针〈400〉32gatgaaatcggctcccgc18〈210〉33〈211〉19<212〉腿〈213〉C677T野生型探针〈400〉33gatgaaatcggctcccgca19<210>34〈211〉21〈212〉腿〈213〉C677T野生型探针〈400〉34tgatgaaatcggctcccgcag21〈210〉35〈211〉17〈212〉DNA〈213〉C677T突变型探针<400>35atgaaatcgactcccgc17〈210〉36〈211〉19〈212〉DNA<213>C677T突变型探针<400>36gatgaaatcgactcccgca19<210>37<211>20<212>DNA<213>C677T突变型探针<400>37tgatgaaatcgactcccgca20<210〉38<211>24<212>DNA<213〉C677T突变型探针〈400〉38atgatgaaatcgactcccgcagac24<210〉39<211>25〈212〉腿〈213〉A1298C野生型探针〈400>39ttcaaagacactttcttcactggtc25<210>40〈211>27<212〉DNA〈213>A1298C野生型探针<400>40cttcaaagacactttcttcactggtca27<210〉41<211>29<212>DNA<213>A1298C野生型探针〈400>41acttcaaagacactttcttcactggtcag29<210〉42〈211〉32<212>DNA〈213〉A1298C野生型探针<400>42gacttcaaagacactttcttcactggtcagct32〈210>43<211〉22<212〉DNA<213>A1298C突变型探针<400〉43caaagacacttgcttcactggt〈210〉44<211>24〈212〉廳〈213〉A1298C突变型探针<400>44tcaaagacacttgcttcactggtc24〈210〉45〈211〉25〈212〉腿〈213>A1298C突变型探针〈400〉45ttcaaagacacttgcttcactggtc25〈210〉46<211〉26<212>DNA〈213〉A1298C突变型探针<400〉46ttcaaagacacttgcttcactggtca26<210>47<211〉29〈212〉DNA<213〉A1298C突变型探针〈400〉47cttcaaagacacttgcttcactggtcagc权利要求1.用于检测MTHFR基因中单核苷酸多态性C677T的基因型的LAMP扩增的核苷酸引物组，其特征在于当靶核苷酸从5’末端依次具有F3区、F2区和F1区并且从3’末端依次具有B3c区、B2c区和B1c区时，并且当引物组包括在3’末端侧具有与F2区相同的序列并在5’末端侧具有与F1区互补的序列的FIP引物、具有与F3区相同的序列的F3引物、在3’末端侧具有与B2c区互补的序列并在5’末端侧具有与B1c区相同的序列的BIP引物、以及具有与B3c区互补的序列的B3引物时，引物组包括选自表2所示引物组1-8的FIP引物和BIP引物、结合至靶核苷酸上距F2区5’末端60个碱基内区域的F3引物、以及结合至靶核苷酸上距B2c区3’末端60个碱基内区域的B3引物。2.根据权利要求1的核苷酸引物组，其特征在于FIP引物和BIP引物选自表2所示的引物组2、3、4、5、7和8。3.根据权利要求1的核苷酸引物组，其特征在于FIP引物和BIP引物是表2所示引物组2的引物。4.用于检测MTHFR基因中单核苦酸多态性C677T的基因型的试剂盒，其特征在于包含根据权利要求l的核普酸引物组。5.检测MTHFR基因中单核苷酸多态性C677T的基因型的方法，其特征在于包括步骤通过使用根据权利要求1的核苷酸引物组扩增把核苷酸得到扩增产物；和6.权利要求5的方法，其特征在于通过固定化于支持物上的核苷酸探针与扩增产物杂交，然后确定结合至核苷酸探针上的扩增产物的量，来实现扩增产物的测定；以及体扩增产物互补的突变体核苷酸引物。7.根据权利要求6的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有62-73r的Tm值，突变体核苷酸探针具有61-71"C的Tm值，并且单核苷酸多态性C677T位点位于距各个核苷酸探针末端3个或更多个碱基的内部。8.根据权利要求7的方法，其特征在于野生型核普酸探针具有68-71"C的Tm值，并且突变体核苷酸探针具有66-69X:的Tm值。9.根据权利要求6的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有SEQIDNo.32或33的序列或者其互补序列，并且突变体核苷酸探针具有SEQIDNo.36或37的序列或者其互补序列。10.根据权利要求9的方法，其特征在于野生型核普酸探针具有SEQIDNo.32的序列或者其互补序列，并且突变体核苷酸探针具有SEQIDNo.37的序列或者其互补序列。11.用于检测MTHFR基因中单核苷酸多态性C677T的基因型的野生型和突变体核苷酸探针，其用于检测通过使用核苷酸引物组所得到扩增产物，其特征在于当乾核苷酸从5，末端依次具有F3区、F2区和Fl区并且从3，末端依次具有B3c区、B2c区和Blc区时，并且当引物组包括在3，末端侧具有与F2区相同的序列并在5，末端侧具有与Fl区互补的序列的FIP引物、具有与F3区相同的序列的F3引物、在3，末端侧具有与B2c区互补的序列并在5，末端侧具有与Blc区相同的序列的BIP引物、以及具有与B3c区互补的序列的B3引物时，引物组包括选自表2所示引物组1-8的FIP引物和BIP引物、结合至乾核苷酸上距F2区5，末端60个g内区域的F3引物、以及结合至M苷酸上距B2c区3，末端60个碱基内区域的B3引物，野生型核苷i^探针与野生型扩增产物互补并具有62-73"C的Tm值，并且单核苷酸多态性C677T位点位于距末端3个或更多个碱基的内部，突变体核苷酸探针与突变体扩增产物互补并具有61-71"C的Tm值，并且单核苷酸多态性C677T位点位于距末端3个或更多个碱基的内部。12.根据权利要求11的野生型和突变体核苷酸探针，其特征在于野生型核苷酸探针具有SEQIDNo.32或33的序列或者其互补序列，并且突变体核苷酸探针具有SEQIDNo.36或37的序列或者其互补序列。13.核苷酸探针固定化支持物，其特征在于根据权利要求11的野生型核苷酸探针和突变体核苷酸探针被固定化于支持物上。14.用于检测MTHFR基因中单核苷酸多态性A1298C的基因型的LAMP扩增的核苦酸引物组，其特征在于当乾核苷酸从5，末端依次具有F3区、F2区和F1区并且从3，末端依次具有B3c区、B2c区和Blc区时，并且当引物组包括在3，末端侧具有与F2区相同的序列并在5，末端侧具有与Fl区互补的序列的FIP引物、具有与F3区相同的序列的F3引物、在3，末端侧具有与B2c区互补的序列并在5，末端侧具有与Blc区相同的序列的BIP引物、以及具有与B3c区互补的序列的B3引物时，引物组包括选自表3所示引物组1-5的FIP引物和BIP引物、结合至乾核苷酸上距F2区5，末端60个碱基内区域的F3引物、以及结合至M苷酸上距B2c区3，末端60个碱基内区域的B3引物。15.根据权利要求14的核普酸引物组，其特征在于FIP引物和BIP引物选自表3所示的引物组1、2、4和5。16.根据权利要求14的核普酸引物组，其特征在于FIP引物和BIP引物是表3所示引物組5的引物。17.用于检测MTHFR基因中单核苷酸多态性A1298C的基因型的试剂盒，其特征在于包含根据权利要求14的核苷酸引物组。18.检测MTHFR基因中单核苷酸多态性A1298C的基因型的方法，其特征在于包括步骤通过使用根据权利要求14的核苷酸引物组扩增把核苷酸得到扩增产物5和19.权利要求18的方法，其特征在于通过固定化于支持物上的核苷酸探针与扩增产物杂交，然后确定结合至核苷酸探针上的扩增产物的量，来实现扩增产物的测定；以及核苷酸探针包括与野生型扩增产物互补的野生型核苷酸探针和与突变体扩增产物互补的突变体核苷酸引物。20.根据权利要求19的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有64-72匸的Tm值，突变体核苷酸探针具有63-73n的Tm值，并且单核苷酸多态性A1298C位点位于距各个核苷酸探针末端3个或更多个碱基的内部。21.根据权利要求20的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有67-68"C的Tm值，并且突变体核苷酸探针具有67-70n的Tm值。22.根据权利要求21的方法，其特征在于野生型核苷酸^针具有SEQIDNo.40或41的序列或者其互补序列，并且突变体核苷酸探针具有SEQIDNo.44或45的序列或者其互补序列。23.根据权利要求22的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有SEQIDNo.训的序列或者其互补序列，并且突变体核苷酸探针具有SEQIDNo.45的序列或者其互补序列。24.用于检测MTHFR基因中单核苷酸多态性A1298C的基因型的野生型和突变体核苷酸探针，其用于检测通过使用核苷酸引物组所得到扩增产物，其特征在于当乾核苷酸从5，末端依次具有F3区、F2区和Fl区并且从3，末端依次具有B3c区、B2c区和Blc区时，并且当引物组包括在3，末端侧具有与F2区相同的序列并在5，末端侧具有与F1区互补的序列的FIP引物、具有与F3区相同的序列的F3引物、在3，末端侧具有与B2c区互补的序列并在5，末端侧具有与Blc区相同的序列的BIP引物、以及具有与B3c区互补的序列的B3引物时，引物组包括选自表3所示引物组1-5的FIP引物和BIP引物、结合至耙核苷酸上距F2区5，末端60个碱基内区域的F3引物、以及结合至M苷酸上距B2c区3，末端60个碱基内区域的B3引物，野生型核苷酸探针与野生型扩增产物互补并具有64-72*€的Tm值，并且单核苷酸多态性A1298C位点位于距末端3个或更多个碱基的内部，突变体核苷酸探针与突变体扩增产物互补并具有63-73匸的Tm值，并且单核苷酸多态性A1298C位点位于距末端3个或更多个碱基的内部。25.根据权利要求24的野生型和突变体核苷酸探针，其特征在于野生型核苷酸^针具有SEQIDNo.40或41的序列或者其互补序列，并且突变体核苷酸探针具有SEQIDNo.44或45的序列或者其互补序列。26.核苷酸探针固定化支持物，其特征在于根据权利要求24的野生型核苷酸探针和突变体核苷酸探针被固定化于支持物上。27.同时检测MTHFR中单核苷酸多态性C677T和A1298C的基因型的方法，其特征在于包括步骤通过使用表2所示的引物组2扩增靼核苷酸得到扩增产物；通过使用表3所示的引物组5扩增靶核苷酸得到扩增产物；通过混合扩增产物制备液体混合物；酸探针杂交，其中支持物上携带有固定于其上的用于C677T的具有序列SEQIDNo.32或其互补序列的野生型核苷酸探针、用于C677T的具有序列SEQIDNo.37或其互补序列的突变体核苷酸探针、用于A1298C的具有序列SEQIDNo.40或其互补序列的野生型核苷酸探针、和用于A1298C的具有序列SEQIDNo.45或其互补序列的突变体核苷酸探针；测量结合至各个核苷酸探针的扩增产物的量；比较结合至用于C677T的野生型核苷酸探针和用于C677T的突变体核普酸探针的扩增产物的量；比较结合至用于A1298C的野生型核苷酸探针和用于A1298C的突变体核普酸探针的扩增产物的量。全文摘要本发明提供了用于检测MTHFR基因中单核苷酸多态性C677T和A1298C的基因型的LAMP扩增的核苷酸引物组。本发明还提供了用于检测通过本发明引物组所扩增的扩增产物的核苷酸探针。本发明还提供了通过使用本发明的引物组检测MTHFR基因中单核苷酸多肽性C677T和A1298C的基因型的方法。文档编号C12N15/11GK101275165SQ200710188780公开日2008年10月1日申请日期2007年11月20日优先权日2007年3月28日发明者中村奈绪子,伊藤桂子,桥本幸二,源间信弘,高桥匡庆申请人:株式会社东芝