专利名称：二粒小麦lrr-受体蛋白激酶基因、该基因的克隆方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一种全长cDNA的分离、克隆及其应用。
背景技术：
蛋白激酶家族是酶中的大家族，参与信号传导途径并在调节细胞功能中起重要作用，其 中很多成员介导真核细胞对外界刺激的应答反应。类受体蛋白激酶(rec印tor-like protein kinases, RLKs)属于蛋白激酶的一个亚家族，其结构包含胞外结构域(extracellular domain)、单次跨膜域(signle-pass transmembran domain)禾口胞内激酶域(cytoplasmic protein kinase domain),它们通过胞外结构域与胞外信号分子，如离子、小分子或多肽等 的特异结合来激活胞内激酶域的自磷酸化和互磷酸化活性，完成跨膜传递信号的功能。因为 这类蛋白激酶的分子结构和功能酷似动物中发现的受体蛋白激酶(rec印tor protein kinase, RPK) (Hanks等1988; Yarden和Ullrich 1988; Ullrich和Schlessinger 1990)，但对其中的 绝大多数尚未鉴定出其配基，故称之为类受体蛋白激酶(Stone和Walker 1995)。依胞外结构 域的类型，RLK可分为S-结构域(S-domain)型、类表皮生长因子(印idermal growth factor-like)型、类肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor rec印torlike)型、富含亮 氨酸重复序列(leucine-richr印eat，LRR)型。目前，在植物中已鉴定的类受体激酶绝大多数 属于LRR型。
在小麦(7>i"ciMses"n//s)高分子量麦谷蛋白基因位点附近有一个编码LRR-类受体 蛋白激酶的基因位点(标记为化Za)，编码蛋白与水稻(6!r;^3幼"ra)抗病蛋白Xa21类似。 通过反转录PCR途径，从二粒小麦(rri"c腿^/r&o^ )的7aJa同源位点分离了 3个cDNA 克隆，ZS860 (GenBank査询号:EF394367), ZS2000 (GenBank査询号:EF394368)和ZS2001 (GenBank査询号EF394369)。 一个完整的TaXa蛋白包括N-端保守区、LRR结构域、 一个 跨膜区和位于c-端的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶功能域。在基因进化过程中，由于碱基代换、 缺失和插入导致了开放读码框的改变，使该位点基因的编码多肽縮短。rafe位点的祖先基因 可能编码1 028个氨基酸组成的多肽，但到目前为止，还未见从普通小麦中分离到编码约1 028 个氨基酸的完整、全长基因cDNA克隆的报告，限制了对这一同源位点基因功能的进一步研究。 本发明成功分离到l个&Ja位点基因的全长cDNA克隆，编码l 026个氨基酸组成的多肽， 构建了植物表达载体，这些将推动小麦属7sZ3基因功能的研究和利用
发明内容
发明目的
本发明成功分离到1个ra化位点基因的全长cDNA克隆，编码1 026个氨基酸组成的 多肽，构建了植物表达载体，将推动小麦属rafe基因功能的研究和利用。 本发明的技术方案是
一种二粒小麦LRR-受体蛋白激酶基因，其特征是WZ做-5T基茵游全长cZ 厕,身，其 核苷酸序列的碱基组成 '<formula>formula see original document page 4</formula>
^^^游r"必 -5TT基因编码的蛋白，其氨基酸序列为1026 Aa<formula>formula see original document page 4</formula>
所述的7^y 7 -S7基因所编码蛋白的特点该基因编码富亮氨酸区-丝氨酸/苏氨酸受体蛋 白激酶(LRR-S/T rec印tor protein kinase)。这个受体蛋白激酶包括N-端保守序列、富亮氨酸结构域(LRR)、中部跨膜结构域和C-端蛋白激酶结构域等几个部分。其结构与已经克隆 的水稻(ftT幼ssn'ra)抗白叶枯病蛋白Xa21类似(Song等1995; GanBank査询号U72728) 和大麦(AbiVe〃历raJgare)的一个受体激酶(GanBank查询号油| AAP31049. 11 )编码蛋白
高度相似。
TtLRR-STK (TtLRR)与大麦LRR-受体蛋白激酶(Hvprk， GanBank查询号gb|AAP31049. 11 ) 的氨基酸序列比较结果如图3所示。
TtLRR-STK (TtLRR)与大麦LRR-受体蛋白激酶的氨基酸序列比较图4所示。 所述r^y^-^7基因的克隆方法，包括以下步骤
(1) r"Ay -57F基因是从对小麦病害抗性程度高的二粒小麦中分离的。以二粒小麦的叶 片为材料提取总RNA (核糖核酸)，再进一步分离mRNA (信使核糖核酸)，通过反转录将mRNA 转录为cDNA (互补脱氧核糖核苷酸)，用该cDNA为模板进行基因克隆。
(2) 根据与植物抗病相关的LRR-类受体蛋白激酶基因序列设计了一对兼并性引物(序 列 为 5' - GTATTG(A/G)TTTTCTTTGCCTGG(A/C)C-3' ; 5' -CAAGC(A/C)GT(A/C)CGTCCAATC(T/A)AT-3')，通过反转录PCR (RT-PCR)技术从二粒小 麦cDNA中获得编码序列长度为3081 bp的cDNA片段，克隆于pUC18-T载体上，测序后通过 序列分析证明这个cDNA克隆编码富亮氨酸区-丝氨酸/苏^酸受体蛋白激酶(LRR-Serine/Threonine receptor protein kinase)。在GenBank中进斗亍相1以'性査i旬比较，i正明为 新的二粒小麦基因，暂命名为7M7 ASS7J基因。
具体克隆技术为
cDNA的合成用TRIzor试剂提取叶片总RNA。用Poly (A) Tract* mRNA分离系统III分 离出mRNA。用SMART RACE cDNA扩增试剂盒合成cDNA。
反转录PCR:用高保真DNA聚合酶进行扩增。扩增程序为先在94 ° C变性2分钟； 接30个循环的94 ° C变性30秒，55 ° C退火30秒，72 ° C延伸3分钟；最后在72 ° C
延伸7分钟。
产物回收和测序分析扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳分离。将含有目的DNA片段的 琼脂糖凝胶切割下来，用液氮反复冻融回收，等体积氯仿抽提纯化，2倍体积的酒精沉淀。 回收的DNA片段用超纯水溶解后，用T4-DNA连接酶将其与pUC18-T载体连接，4° C连接过 夜。用CaCl2热击法，在42° C热击90秒，将连接产物转化到大肠杆菌DH10B菌株中。用质 粒小量提取法提取质粒DNA。在大连宝生物公司用ABI377自动测序仪测序。测序结果用BLASTt 和BLASTp计算机辅助程序(Altschul等1997)在美国国家生物信息中心网站NCBI (http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov)和相关的连网站点进行同源序列査询比较。在NCBI网站用 Marchler-Bauer等(2003)的方法进行保守功能域数据分析。
所述的基因5T在小麦抗白粉病中的应用。
所述的基因r^y y -5T在转基因抗病育种中的应用。
所述的基因f"^ -5T在转基因抗病育种中的应用。
所述的基因7YZ^ -5T在设计合成新抗病相关基因中的应用。
所述基因r"vW-5T在基因芯片制作研究中的应用，
本发明的有益效果
l.本发明的基因7YZ必 -5T^议遂/滞基因抗病育种。该基因可以插入到不同类型的启动 子下游，构建成植物表达载体，通过基因工程技术进行植物抗病改良。启动子可以是组成型 表达的启动子，如花椰菜花叶病毒35S的启动子、玉米泛素启动子Ubi等。连接在组成型表 达启动子下游的基因将在转基因植物的任何组织和任何发育时期表达。启动子也可以是病原 菌诱导表达的启动子、或组织特异性表达的启动子。连接在这些启动子下的基因仅在病原菌 存在时、或在特定组织中表达，使该基因的表达受到更精确的控制。 .2.本发明的基因K^y -5T^议设计合成新抗病相关基因。植物LRR-蛋白激酶类多肽的羧基端丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能域高度保守，而胞外的LRR区在基因间差异很大，它决定 抗病基因作用对象的分子特异性(Kobe和Deisenhofer 1994)，这个区域的改变可以改变基 因的作用对象，因此，氨基端的LRR结构变化决定LRR-类蛋白激酶与其他蛋白的互作特异性。 通过定点突变、或基因序列重组等技术，可以人工合成很多具有新的特性的基因，通过基因 工程技术应用于植物抗病改良中。
3.本发明的基因n^KS5T^"以基因芯片制作。可将该基因的克隆用于小麦基因芯片制 作，应用于小麦抗病等研究中。根据7^ypy -57F基因cDNA序列设计PCR引物，在含本基因的 克隆中扩增rt^W-S7J基因的全长cDNA，或扩增编码N-端结构域的基因特异性强的区段，进 行基因芯片的制作。
4.本发明的TtLRR-STK基因在小麦抗白粉病反应中起重要作用。小麦在受到小麦白粉病菌 的攻击时，表达被激活，转录水平显著增强(参见附图5)。由图5可见，未接种白粉病菌的 对照(0小时)没有扩增产物，接种后12至24小时的表达量最高，直到接种后72小时仍有 较高的表达。rt^W-5TT的表达谱变化证明了其在小麦抗白粉病反应中起重要作用。
图1是LRR-受体蛋白激酶基因的核苷酸序列图； 图2是LRR-受体蛋白激酶基因的氨基酸序列图3是LRR-受体蛋白激酶基因编码的蛋白二级结构图，图中上数字为氨基酸残基的位置； C0G4886:与C0G4886类似的LRR功能域；TM:跨膜结构域；S-Tkc:丝氨酸/苏氨酸激酶功能域。
图4是TtLRR-STK (TtLRR)与大麦LRR-受体蛋白激酶的氨基酸序列比较图。
图5是通过RT-PCR技术分析r^A^-5TJ基因在小麦抗白粉病反应中的表达变化。图中M为分
子量标记，0、 1、 12、 24、 72等数字为小麦白粉病接种后的时间；^cti"为小麦肌动蛋白基
因，为稳定表达基因，作为基因表达变化的对照。结果可见，7M/^-^57J基因在白粉病菌接
种后表达被激活。
图6是表达载体质粒pC220-ZS2002结构图。T-Border (L): T-DNA左边界;T-border (R): T-DNA右边界；HYG:潮霉素抗性基因；GUS: 0-葡萄糖苷酸酶标记基因；LacZ: 0-牛乳糖 标记基因；ZS2002: 7z^A!/ -6TJ基因；Ubi-1:玉米泛素-l启动子；N0S:胭脂碱基因终止子。
具体实施例方式
实施例i. rt^ / -57J基因的克隆过程
7Y^V -5TJ基因是从对小麦病害抗性程度高的二粒小麦中分离的。以二粒小麦的叶片为 材料提取总脂A (核糖核酸)，再进一步分离mRNA (信使核糖核酸)，通过反转录将mRNA转录 为cDNA (互补脱氧核糖核苷酸)，用该cDNA为模板进行基因克隆。
根据与植物抗病相关的LRR-类受体蛋白激酶基因序列设计了一对兼并性引物(序列为 5' - GTATTG(A/G)TTTTCTTTGCCTGG(A/C)C-3' ;
5' -CAAGC(A/C)GT(A/C)CGTCCAATC(T/A)AT-3')，通过反转录PCR (RT-PCR)技术从二粒小 麦cDNA中获得编码序列长度为3081 bp的cDNA片段，克隆于pUC18-T载体上，测序后通过 序列分析证明这个cDNA克隆编码富亮氨酸区-丝氨酸/苏^酸受体蛋白激酶(LRR-Serine/Threonine rec印tor protein kinase)。在GenBank中进行相似性査询比较，证明为 新的二粒小麦基因，暂命名为W^y -5TJ基因。(目前在普通小麦及一粒小麦、二粒小麦的同 源位点上还没有编码1026个氨基酸的完整cDNA克隆被报告)
具体克隆技术
cDNA的合成用TRIzor试剂提取叶片总RNA。用Poly (A)Tract" mRNA分离系统III分 离出mRNA。用SMART RACE cDNA扩增试剂盒合成cDNA。反转录PCR:用高保真DNA聚合酶进行扩增。扩增程序为先在94 ° C变性2分钟； 接30个循环的94 ° C变性30秒，55 ° C退火30秒，72 ° C延伸3分钟；最后在72 ° C
延伸7分钟。
产物回收和测序分析扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳分离。将含有目的DNA片段的 琼脂糖凝胶切割下来，用液氮反复冻融回收，等体积氯仿抽提纯化，2倍体积的酒精沉淀。 回收的DNA片段用超纯水溶解后，用T4-DNA连接酶将其与pUC18-T载体连接，4° C连接过 夜。用CaCl2热击法，在42° C热击90秒，将连接产物转化到大肠杆菌DH10B菌株中。用质 粒小量提取法提取质粒DNA。在大连宝生物公司用ABI377自动测序仪测序。测序结果用BLASTt 和BLASTp计算机辅助程序(Altschul等1997)在美国国家生物信息中心网站NCBI (hUp:〃丽w. ncbi. nlm. nih. gov)和相关的连网站点进行同源序列査询比较。在NCBI网站用 Marchler-Bauer等(2003)的方法进行保守功能域数据分析。 ' 该基因所编码蛋白的特点
该基因编码富亮氨酸区-丝氨酸/苏氨酸受体蛋白激酶(LRR-S/T rec印tor protein kinase)。这个受体蛋白激酶包括N-端保守序列、富亮氨酸结构域(lrr)、中部跨膜结构域和 C-端蛋白激酶结构域等几个部分。其结构与已经克隆的水稻(6!ry幼^tira)抗白叶枯病蛋 白Xa21类似(Song等1995; GanBank査询号U72728)和大麦(他rofe腿n/J卵re)的一个受 体激酶(GanBank查询号gbIAAP31049. 1 i)编码蛋白高度相似。其比较结果参见附图3.
TtLRR-STK(TtLRR)与大麦LRR-受体蛋白激酶(Hvprk， GanBank查询号gb IAAP31049.11) 的氨基酸序列比较。
<image>image see original document page 7</image>Hvprk 655 TtLRR 659Hvprk 715 TtLRR 719LQI簡TAfe6/ IHI龜趣l 跨膜结构域■ARC|VNKSB 國虚IK驛I闘DISag,iNI針:MTORIS， l:UISA'l 1)SI:SE P 1A1S，A1::LIIL'\ l'DSFSV丄ILUVKVl,muKU(;ATKSI: I SI:('\AI,iai 1 RH服l .VK\||!j達.i TAAYKVi .m'g叫(;Ai s卜:(i川服lvkv丝氨te苏&K」力能械-714 718774 778Hvprk TtLRR775 779irVCi^BM^NWK ^iit|)\(;Sl,l)KM .1ii 'ST卜:)l'H;TI'Nil .、M、'l .、 1 Al .l)VAl':AI丄:、 IWCDSLDHSGSQI'KALVLEF 11'N(;SU)KWI ,1 ll)S'iT':(;l: WJPSLV1QRIA1 A1,1)VAI':A1上Y834 838Hvprk TtLRR835 839L錢D歸PPr,' 1 l(T)VKi 'S\ 11丄)I)隨.A11L(、'I)R;1 ..\K] 1 RA:KS,」D0S〔'SV(' 1 K()T 1 SfflH!DPPIVHCDVKiJS\ 1 l丄l)IAMVAlll.('l)r('LAK1 k'Al-:liSSQSU'(;QSSSV'(; [KG'I' 1894 898Hvprk TtLRR895 899df viMfiTG:i svh( tI)vysy(; vi .i丄i':Mi ,'i r'Ki們'm)i'Fsi)'i 'ai ,pky v'i':vi八(:p(;M丄r: GYLi*S S￡IS\,i:(;l)VYSY(;VLU,l:.\lLTWWr )l'T\inT\LPKYVBl.'\t:l>G\Ll,l':954 958Hvprk TtLRR955 959t蒙NlR^fc駒4vpLMM^ si化(;l'uti";sai《ok i k i(;i)vvki':i .(;aku i i maso、' iMWfCNQEPKiTULPiy '.\Ki,(;L\('(、K(;r'.\RwnAisDYVKnL(;;aK'm..i\iAS(A1014 1018Hvprk TtLRR1015 1019YASWV服LY 1023 S輔,Q 1026实施例2.本发明的W^y -57J基因在转基因抗病育种上的应用。将7t^y -5TJ基因从pUC18-T载体上酶切下来，或用高保真化^DNA聚合酶和基因特异性 引物扩增下来。用T4-丽A连接酶将r^^/ -57J连接在玉米泛素高效启动子Ubi(Ubiquitin-1) 的下游，再插入到pCAMBIA-Bar植物表达载体中，从而构建成pCAMBIA-Ubi-7&^S57J表达 载体质粒。'将该表达载体转化到大肠杆菌DH10B菌株中繁殖，提取该载体的质粒，即可进行 转基因抗病育种。通过基因枪(如伯乐公司的高压氦气基因枪，PDS-1000/He)将 pCAMBIA-Ubi-rt^^-57J表达载体质粒转化到高产、优质，但抗病性差的小麦品种的幼胚愈 伤组织中。利用表达载体上的筛选标记基因——抗除草剂基因Bar，在加有除草剂PPT的MS 固体培养基中筛选，获得抗PPT的转基因愈伤组织。再将筛选获得的转基因愈伤组织转到新 的诱导组织分化的分化培养基(含3mg/L的PPT; 1 mg/L的Zeatin，和1 mg/L的IAA， 1/2 的MS固体培养基)中培养，诱导产生新的再生植株。这样就获得了转基因小麦。用基因特异 性引物通过PCR技术对转基因植株的后代进行检测，选择基因纯合，抗病性好的理想转基因 品系，即可进行大田种植、推广。下图是将7^^!/ -5TJ基因(ZS2002)插入在玉米泛素高效 启动子下游构建成的单子叶植物表达载体结构示意图(图6)。实施例3.本发明的7YZ^P-6TJ基因在设计合成新抗病相关基因。现代dna合成技术已经可以合成全长基因。因此，根据已经克隆研究的植物LRR-蛋白激 酶类抗病基因的特征，设计合成需要的编码特异LRR结构域的序列，与TtLRR-STK的编码约 第600氨基酸以后的序列相连接，就可合成全新LRR-丝氨酸/苏氨酸受体蛋白激酶基因。然 后，通过测序验证合成基因的编码框(ORF)是否正确。通过验证的基因即可进一步构建到植' 物表达载体中，通过转基因技术对合成基因的抗病性进行检测。具有良好抗病性的合成基因 可以用于转基因抗病小麦新品种的培育(植物表达载体的构建和转基因的具体操作如(1)中 示例玩述)。实施例4.本发明的7yz^ -5tj基因在基因芯片制作中的应用。以5TJ基因cDNA克隆为模板，用基因特异性引物或pUC18-T载体上的M13通用引 物通过PCR扩增获得DNA产物。对产物进行纯化，'溶解后，按照基因芯片制作程序制作小麦 基因芯片，用于抗病等相关研究。如可以用英国的BioRobotics自动点膜仪将标本点在8X 12厘米的尼龙膜上。每个样品点2个点，每个点的DNA量为几纳克，同时点上看家基因(如 18sRNA和Actin基因)作为稳定表达基因对照。试验研究材料的mRNA提取后用同位素(如833P)标记作为探针，与基因芯片进行杂交。用记录仪分析杂交信号。根据杂交信号的强弱分析不同实验条件下r^z A7基因的表达变化。研究rs^aw基因与抗病等反应的关系。
权利要求
1.二粒小麦LRR-受体蛋白激酶基因，其特征是其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2. 根据权利要求1所述的基因，其特征在于该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.二根据权利要求1所述的基因，其特征在于该基因编码的蛋白二级结构图如SEQ ID N0:3所示。
4. 如权利要求l所述基因的克隆方法，包括以下步骤(1) 以二粒小麦的叶片为材料提取总RNA(核糖核酸)，再进一步分离mRNA(信使核糖核酸)， 通过反转录将mRNA转录为cDNA (互补脱氧核糖核苷酸)，用该cDNA为模板进行基因克隆。(2) 根据与植物抗病相关的LRR-类受体蛋白激酶基因序列设计了一对兼并性引物(序列为 5' - GTATTG(A/G)TTTTCTTTGCCTGG(A/C)C-3' ; 5' -CAAGC(A/C)GT(A/C)CGTCCAATC(T/A)AT-3')，通过反转录PCR (RT-PCR)技术从二粒小 麦cDNA中获得编码序列长度为3081 bp的cDNA片段，克隆于pUC18-T载体上，测序后通过 序列分析证明这个cDNA克隆编码富亮氨酸区-丝氨酸/苏氨酸受体蛋白激酶。
5. 根据权利要求4所述基因的克隆方法，其特征在于cDNA的合成方法包括用TRIzor试剂提取叶片总RNA，用Poly (A) Tract* mRNA分离系统III 分离出mRNA，用SMART RACE cDNA扩增试剂盒合成cDNA;反转录PCR合成方法包括用高保真DNA聚合酶进行扩增，扩增程序为先在94° C变性2 分钟，接30个循环的94 ° C变性30秒，55 ° C退火30秒，72 ° C延伸3分钟，最后在 72 ° C延伸7分钟；产物回收和测序分析扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳分离。将含有目的DNA片段的琼脂 糖凝胶切割下来，用液氮反复冻融回收，等体积氯仿抽提纯化，2倍体积的酒精沉淀。回收 的DNA片段用超纯水溶解后，用T4-DNA连接酶将其与pUC18-T载体连接，4 ° C连接过夜， 用CaCl2热击法，在42° C热击90秒，将连接产物转化到大肠杆菌DH10B菌株中，用质粒小 量提取法提取质粒DNA，测序仪测序，测序结果进行保守功能域数据分析。
6.根据权利要求l所述的基因在小麦抗白粉病中的应用。
7. 根据权利要求1所述的基因在转基因抗病育种中的应用。
8. 根据权利要求l所述的基因在转基因抗病育种中的应用。
9. 根据权利要求l所述的基因在设计合成新抗病相关基因中的应用。 ，
10. 根据权利要求1所述基因在基因芯片制作研究中的应用，
全文摘要
本发明涉及植物基因工程技术领域，特别是涉及一种全长cDNA为3081bp基因TtLRR-STK的分离、克隆及其应用。本发明TtLRR-STK基因是从对小麦病害抗性程度高的二粒小麦中分离的，该基因编码富亮氨酸区-丝氨酸/苏氨酸受体蛋白激酶，所述的受体蛋白激酶包括N-端保守序列、富亮氨酸结构域(LRR)、中部跨膜结构域和C-端蛋白激酶结构域等几个部分。其结构与已经克隆的水稻抗白叶枯病蛋白Xa21类似和大麦的一个受体激酶编码蛋白高度相似。本发明的基因TtLRR-STK可以插入到不同类型的启动子下游，构建成植物表达载体，通过基因工程技术进行植物抗病改良，也可将该基因的克隆用于小麦基因芯片制作，应用于小麦抗病等研究中。
文档编号C12N15/82GK101407814SQ20071018971
公开日2009年4月15日 申请日期2007年10月10日 优先权日2007年10月10日
发明者瑞 刘, 牛吉山, 磊 郑 申请人:河南农业大学