专利名称：：一种高产胆固醇氧化酶的红色甾短杆菌的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种高产胆固醇氧化酶的红色甾短杆菌，属于微生物菌株
技术领域：
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背景技术：
：胆固醇是构成动物细胞膜的必需组分。在人体中它主要存在于血浆、肝、肾上腺以及细胞合成的脂质混合物中，它是动物脂质代谢过程中的重要物质，可调节消化道对脂肪的吸收，并且是胆汁酸、类固醇激素和维生素D生物合成的前体物质。血浆中胆固醇的水平是人体健康状况的重要生理指标，人体的心、脑、血疾病很多都与血液中的胆固醇含量有关，如动脉粥样硬化、冠心病、胆石症等。因此近二十年来，过量胆固醇可能危害人体健康已成为国际食品医学界的热门话题。胆固醇氧化酶(COD，EC1丄3.6)是胆固醇代谢途径第一步反应的关键酶，能专一性的催化胆固醇转化为胆甾-4-烯-3-酮(胆甾烯酮)和H202。胆固醇氧化酶在食品开发、医疗保健、临床检测、生物农药等方面具有极广泛的应用价值。例如在食品开发中，胆固醇氧化酶可以应用来转化、降低食品中的胆固醇含量。胆甾-4-烯-3-酮是一系列固醇类激素药物的前体，据报道其本身也具有抗肥胖以及治疗肝病的效果，同时囟为胆固醇氧化酶能特征性的与胆固醇反应，它还可以用来检测血清胆固醇含量，因而在临床检测方面也有很广泛的应用潜力。另外有研究报道胆固醇氧化酶可以抑制昆虫的生长发育，可以成为一种对环境无危害的生物农药。自从1948年TurfittG.E.首次发现灰暗诺卡氏菌产生胆固醇氧化酶以来，已经报道了有多种微生物能够产生胆固醇氧化酶。目前报道的能产胆固醇氧化酶的微生物有甾短杆菌Bre-vibacteriumsterolicum(日本)、马红球菌Rhodococcusequi.(加拿大)、球壳杆菌5acz'〃wsp-haericus(韩国)、库特氏菌《w"/n'aC-5(韩国)、节杆菌Arthrobacter-82(中国)、桔红诺卡氏菌7Vocm^arhodochrous(中国)、红球菌朋。(iococ，sp.(摩洛哥)、大肠杆菌Escherichia(乌克兰)。1998年，NoriyukiDoukyu通过假单胞杆菌sp.ST-200发酵制备胆固醇氧化酶，酶活15.2U/mg。2001年，M.TabatabaeiY等人利用链霉菌发酵，得到酶活23U/mg的纯酶。2003年，RitaVarma，SanjayNene，利用链霉菌NCIM2421发酵，得到1.42U/mg的胆固醇氧化酶。2002年，牛天贵，利用马红球菌4-2发酵胆固醇氧化酶，酶比活为:5.27U/mg。2006年广西大学王发合等，以类芽胞杆菌作为出发菌株，经过紫外+LiCl、紫外+光敏试剂(8-mop)物理化学诱变处理，最后得到一株突变株XUM-IO，并对其进行发酵条件的优化，最终酶活为221.20U/L。野生菌的产酶能力在300U/L(发酵液)左右，不能满足工业生产要求；另外，野生菌产生胆固醇氧化酶必需要由底物诱导，而胆固醇不溶于水，难以在水相培养基中均匀地、稳定地分散，也给胆固醇氧化酶的发酵、分离、应用都带来了困难。所以，学者们一直在对菌种进行改造并优化发酵条件，以提高菌种产酶活力、胆固醇氧化酶的分离纯化及应用。
发明内容本发明的目的是提供一种可以在以胆固醇为唯一碳源的发酵培养基中大量积累胆固醇氧化酶的红色甾短杆菌菌株。本发明的技术方案一种高产胆固醇氧化酶的红色甾短杆菌，其分类命名为短杆菌(SrevAactehwmsp.)DGCDC-82(choB)，该菌株巳保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M207182。所述的CCTCCNO:M207182菌株，特征为a.利用胆固醇作为唯一碳源生长；b.在整个生长周期菌体均为桔红色；c.在以胆固醇为唯一碳源的发酵培养基中大量积累胆固醇氧化酶。所述的CCTCCNO:M207182菌株，其是产胆固醇氧化酶的白色甾短杆菌的突变株。本发明的发明人以产胆固醇氧化酶的白色甾短杆菌作为出发菌株，采用诱变剂处理菌体细胞，获得了一株颜色突变株，对这株颜色突变株进行了发酵研究发现它同时是胆固醇氧化酶的高产突变株。作为出发菌株，本发明发明人采用了白色甾短杆菌野生菌株。对出发菌株的处理中，诱变剂采用了紫外线、亚硝基胍、6QCo、超声波等一系列物理、化学诱变剂。对出发菌株，按常规诱变法，用紫外线、亚硝基胍、6QCo处理，再用亚硝基胍结合超声波的方法进行处理，诱变完之后进行筛选，涂布于筛选培养基平板上。30"C培养36-48h，挑选透明圈较大的接种到发酵培养基中，37'C培养36h，检测其发酵酶活。从而得到了一株颜色和高产的突变株。用于诱变后突变株筛选的筛选培养基和发酵培养基分别为筛选培养基A(g/L):酵母膏0.6，NaCll，琼脂20，蒸馏水1L，pH7.5。筛选培养基B(g/L):筛选培养基A灭菌后添加显色法胆固醇氧化酶检测液A液(4-氨基-安替比林lmmol/L;苯酚6mmol/L;叠氮钠0.2g/L;过氧化物酶5000U/L;磷酸钾缓冲液25mmol/L,pH7.5)40ml，pH7.5。筛选培养基C(g/L):筛选培养基A灭菌后添加溴百里酚蓝0.04%，pH7.5。发酵培养基(g/L):胆固醇3，酵母膏8，NaCll，CH3COONH42，K2HP040.2,MgS04*7H200.05,FeS04*7H200.01,CaCl20.1,吐温-803mL，蒸馏水1L，pH7.5。得到的突变株为桔红色，菌落边缘整齐，表面光滑、潮湿，发酵水平较出发菌株的0.5U/mL提高到1.21U/mL，提高了140%。为鉴定其突变类型，对出发菌株和突变株进行了16SrDNA同源性比较，测序结果表明两株菌的16SrDNA同源性为100%。为了进一步确定其突变型，选择了部分特征培养基进行生理生化鉴定，从表1中可以看出，与出发菌株相比，突变株的生理生化特征没有明显变化，目前可以确定其突变为产酶提高型和菌落颜色变化的形态突变型，该型产酶菌株目前没有见到公开报道，命名为短杆菌Bv/Z)flcto^wsp.DGCDC-82。表1突变株DGCDC-82生理生化鉴定<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>+为利用或阳性，-为不利用或阴性在发酵研究过程中发现，突变株菌落红色越深，发酵产酶越高。为了确定这种偶联关系，对突变株DGCDC-82进行了回复突变研究。用亚硝基胍联合超声波的方法对DGCDC-82进行诱变处理，诱变后，涂布于基本培养基上，以颜色为筛子筛选到两株回复突变株R1和R2。Rl为淡粉色，R2为白色。首先对这两株回复突变株进行了生理生化研究，发现其生理生化特征较DGCDC-82无明显变化。又对两株回复突变株进行发酵研究发现DGCDC-82发酵在约35h达到最高酶活1.24U/mL;Rl发酵在约24h达到最高酶活，为0.69U/mL;R2发酵在约24h达到最高酶活0.17U/mL。这就从反面证明了胆固醇氧化酶与红色素之间的正相关偶联关系，红色素的含量越多发酵酶活越高，红色素的含量越少发酵酶活也越低。这一特征可以作为高产菌种的筛选方法。对红色素粗提取后全波长扫描发现这种红色素在450nm处有最大吸收，利用这种特殊吸收，采用比色法研究了红色素含量和发酵产酶的关系，结论为两条曲线成正相关。胆甾_4-烯-3-酮是COD分解胆固醇的产物。红色素和产酶成正相关偶联，说明酶分解底物后的物质趋向于色素的合成，那么胆甾-4-烯-3-酮和色素应该成反比关系。用比色法验证了这一推论，证实了产酶与红色素正比的偶联关系。本发明的有益效果本发明提供了一种具有工业应用潜力的高产胆固醇氧化酶的优良菌株DGCDC-82。该菌株是在一株白色甾短杆菌的基础上，主要通过亚硝基胍结合超声波的方法诱变处理得到的。发酵研究发现该红色菌株的产胆固醇氧化酶(COD)活力达到1.21U/mL，比出发菌株提高了140%。又采用回复突变的方法研究了该菌株产酶和红色素的关系，发现菌株产酶和红色素的含量成正相关关系，菌体的红颜色越深，菌株发酵产酶活力也就越高。图l.不同诱变方法处理出发菌种致死率图2.出发菌株与DGCDC-82发酵产胆固醇氧化酶比较图3.回复突变株与DGCDC-82发酵酶活比较图4.红色素全波长扫描图5.DGCDC-82发酵不同时间酶活与红色素的关系图6.DGCDC-82发酵不同时间胆甾-4-烯-3-酮与红色素关系生物材料样品说明本发明菌株分类命名为短杆菌(SreW6acfen^msp.)DGCDC-82(choB)，该菌株巳保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2007年11月15日，保藏编号为CCTCCNO:M207182。具体实施例方式实施例l:复合诱变条件的确定超声波作为物理诱变剂，是辅助的诱变手段，化学诱变剂NTG为主要诱变手段，需要考察菌浓度，处理时间、温度相同的条件下，超声波、NTG、超声波辅助NTG对菌种致死率的影响。以逸择使致死率较强的诱变处理方案。(1)超声波诱变处理出发菌株取活化处理后的菌悬液30mL，平均分装于六只试管，一只作对照，另五只采用超声波(200w，50KHz)处理，每次超声照射5min，中间停lmin。间歇处理2、3、4、5、6次，处理后，稀释涂布于种子培养基中，3(TC、培养24h，计数，计算致死率。(2)NTG诱变处理出发菌株取活化处理后的菌悬液30mL，平均分装于六只试管，一只作对照，另五只采用NTG(lmg/mL)处理，在诱变处理10、15、20、25、30分钟时，分别取出一只试管，取0.5mL菌悬液，稀释100倍，终止诱变，再稀释至适当浓度后涂平板，30。C、24h培养，待形成明显菌落后计数，计算致死率。(3)复合诱变处理出发菌株取6只试管，各分装己活化处理后的菌悬液5mL，诱变处理，诱变条件为冰水浴中，超声(200w，50KHz，每次5min，间歇lmin)辅助NTG(lmg/mL)诱变处理菌悬液，超声间歇处理1、2、3、4、5、6次。每次超声照射后，取l只试管诱变处理菌液，取0.5mL菌悬液，稀释100倍，终止诱变，再稀释至适当浓度后涂平板，对照按与处理菌相同稀释度涂布种子培养基中，30°C、24h培养，待形成明显菌落后计数，计算致死率。采用亚硝基胍和超声波联合处理，以致死率为考察指标，实验结果见图l。当亚硝基胍浓度为lmg/mL，超声处理35min时，致死率为90%。故确定复合诱变的条件为亚硝基胍lmg/mL，200W、50kHz超声强度处理35min。实施例2:胆固醇氧化酶活的测定胆固醇氧化酶酶活测定采用比色法，其原理是胆固醇在COD的催化下分解成一分子的胆甾-4-烯-3-酮和一分子的H202，H202在过氧化物酶的作用下分解，可使4-氨基-安替比林与苯酚形成亚醌类呈红色的化合物，它在500nm处有最大吸收峰，通过测量反应液在500nm处的吸光值，可定量测定胆固醇的氧化量，从而计算出胆固醇氧化酶的酶活单位。3mL溶液A(4-氨基-安替比林lmmol/L;苯酚6mmol/L;叠氮钠0.2g/L;过氧化物酶5000U/L;磷酸钾缓冲液25mmol/L，pH7.5)，150pL溶液B(胆固醇8.26mg/mL;TritonX-1004.26%;异丙醇为溶剂)，50pL酶液，37°C、反应5分钟，沸水浴3分钟，于500nm测吸光值。酶活(U/ml"1.6832xA，。实施例3:16srDNA菌种鉴定取指数生长期新鲜菌液，离心收集细菌，按文献方法提取基因组DNA。依据细菌16SrDNA中最保守的序列设计并合成引物，正向引物5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，；反向引物5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。PCR反应条件50)iL体系中含基因组DNAl|iig、20mmol/LTris-HCl(pH8.4)、5Ommol/LKC1、1.5mmol/L、MgCl2、200)imol/LdNTP、正反向引物各500pmol/L、2.5uTaq酶，97。C变性2min后进入循环，94。Clmin，55。Clmin，72TM0min，共35个循环，最后72'C延伸10min。扩增产物的纯化按上海华舜生物工程有限公司的小量胶回收PCR产物纯化试剂盒说明，测序由上海生工生物技术公司完成，测序引物为5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'。实施例4:突变株红色物质提取与全波长扫描分析取发酵液100mL，5000r/min离心10min取菌体，菌体悬浮于30mLpH7.0、0.05M磷酸钾缓冲液，超声处理(200w，50KHz，间歇处理，每次5min，其间停lmin)。超声4次后，8000r/min离心取上清，加入20mL甲醇振荡均匀，静置2h，8000r/min离心10min，取上清，水浴蒸干，溶解于50mL甲醇溶液，8000r/min离心10min，取上清。权利要求1.一种高产胆固醇氧化酶的红色甾短杆菌，其分类命名为短杆菌(Brevibacteriumsp.)DGCDC-82，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM207182。2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于a.利用胆固醇作为唯一碳源生长；b.在整个生长周期菌体均为桔红色；c.在以胆固醇为唯一碳源的发酵培养基中大量积累胆固醇氧化酶。3.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于其是产胆固醇氧化酶的白色甾短杆菌的突变株。全文摘要一种高产胆固醇氧化酶的红色甾短杆菌，属于微生物菌株
技术领域：
。本发明菌株分类命名为短杆菌(Brevibacteriumsp.)DGCDC-82(choB)，该菌株巳保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM207182。本发明的菌株是在一株白色甾短杆菌的基础上，主要通过亚硝基胍结合超声波的方法诱变处理得到的。发酵研究发现该红色菌株的产胆固醇氧化酶(COD)活力达到1.21U/mL，比出发菌株提高了140％。又采用回复突变的方法研究了该菌株产酶和红色素的关系，发现菌株产酶和红色素的含量成正相关关系，菌体的红颜色越深，菌株发酵产酶活力也就越高。文档编号C12N1/20GK101186897SQ20071030244公开日2008年5月28日申请日期2007年12月26日优先权日2007年12月26日发明者杨海麟,吉桑,武王,王龙刚,霍惠芝申请人:江南大学