专利名称：疟疾单管-套式/多重pcr基因诊断试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于医学检验领域，涉及一种传染病的诊断试剂一疟疾的基因诊 断试剂盒及其检测方法具体涉及运用多项创新设计方案优化的单管-套式/多重PCR技 术。背亲技术疟疾分为恶性疟、间円疟、三闩疟和卵形疟，分别由寄生在人体血液红血 球内的4种人疟原虫引起即恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间R疟原虫 (P.vivax)、三闩疟原虫(P.maiariae)和卵圆疟原虫(P.ovale);可由按蚊属 (An叩heles)的约30多种媒介按蚊叮咬吸血传播。发病常有寒战、高热、头痛和出汗 等全身症状呈间歇热周期性发作，在流行区居民由于反复感染可引起严重贫血、营养不 良、发育不良以及脾脏肿大，对婴幼儿童和孕妇胎儿的健康发育的损害尤为严重，如不 及时有效的抗疟治疗可引起脑型疟、、肿水肿、肾功能不全和肾功能衰竭等凶险发作乃 至死亡。是世界上危害最严重的三大传染病(艾滋病，结核和疟疾)之一。WHO已把控 制疟疾定为本世纪行动目标之一。由于4种疟原虫的生物学和免疫学特性，致病性，对 抗疟药的治疗效应，对媒介按蚊的敏感性以及它们在全球流行的区域分布各异；对各种 疟疾的及时正确治疗、防制措施与策略的制订，乃至抗疤药和疫苗研制均有赖于灵敏、 准确的诊断和鉴别诊断。目前，疟原虫对抗疟药和媒介按蚊对杀虫剂已产生广泛的抗药 性，使全球疟疾控制更加困难。据WHO估计全球每年约有2.75亿人感染疟疾，因患疟 疾死亡人数在100力'以上w。我国历史上疟疾曾经猖獗流行,每年发病人数以百万计,解 放后经过数十年积极防治，大面积流行已经控制,许多地区已逐步达到基本消灭疟疾,但 是由于我国幅员辽阔，边境线长，地区经济文化卫生条件发展不均衡，我国大部分农村 地区疟疾传播的环境条件依然存在，在许多省份局部地区流行不断发生，随着对外经济 文化交流和旅游业的发展，特别与非洲和东南亚等疟疾高度流行国家地区的人员交往曰 益增加，境外传染源输入的威胁倍增，根据2002 2006年疫情报告与漏报调査综合估计全国每年的疟疾实际发病人数仍在70万左右。疟疾依然是严重威胁我国人民健康和 生命的传染病和寄生虫病。疟疾诊断方法包括临床诊断、病原学诊断、血清学诊断和分子(基因)诊断。由于 疟疾的主要临床表现与其他传染病相似难于鉴别，单凭临床症状极易误诊。常用的血清 学方法如间接荧光抗体试验等，其阳性只反映近年曾感染疟疾，主要应用于疟疾血清流 行病学调査评价；ELISA等检测抗原的方法，因其敏感性和特异性不高，难于实际应用。 因此两者均不能作为疟疾病人的确诊依据。目前，已沿用50多年的显微镜病原学诊断 (镜检法)仍然是疟疾病人确诊的主要依据。镜检法虽然较简单经济，但费时费力，结 果判断主观性强，其灵敏性与准确性决定于镜检员的素质和经验；特别是检出低原虫血 症的敏感性差，WHO疟疾专家在《疟疾诊断的新展望》报告中指出有经验的镜检员可 能检出5 10个虫/pl低原虫血症，但是一般镜检员的实际检出低限仅为100~150个 虫/^1["。按目前常规血检，每张血片仅检査100-200个油镜视野，甚至达不到100个 视野(约占整个血膜的1/10-1/20)，低密度带虫者漏检是不可避免的。显然，基于上述 固有缺陷，镜检法已不能满足现代疟疾防治与研究中检出低原虫血症的需要，特别是不 适合流行病学调查监测、疫苗研制、抗疟药物试验和筛选献血员等大规模血样的检测。从上世纪七十年代起，研究较多的疟疾新诊断方法是吖啶橙染色荧光显微镜检査疟 原虫，其中比较成功的有我国的吖啶橙直接滴染法和国外的QBC法(毛细管定量血沉棕 黄层吖啶橙染色)，能提高工作效率，检出率可达到或超过普通镜检法的水平；但因虫 种鉴定困难、与镜检法同样需要熟练技术和经验、结果判断主观性、以及需使用价格昂 贵的荧光显微镜或适当的荧光激发光源等原因难于实际应用。上世纪末在WHO积极倡导和资助下发展起來的抗原捕获快速诊断试验(RDTs)即免 疫层析色谱试纸法，因简便、快速，且不须专业技术只要简单培训的基层人员可以操作； 已有若干评价报告，国外并有商品化生产，适用于基层医院特别是缺乏显微镜及镜检人员的农村诊所，以便快速诊断及时给病人抗疟治疗，具有现场应用价值。但其敏感性和特异性较差且费用较高；有报告指出三种RDT (ParaSight-F: OptiMal; ICT尸//外)均 显示很髙的假阳性和假阴性(假阳性髙达29.2%) w，特别是治疗后55%的病例在10-17 天内仍存在可检出的抗原，而镜检法和PCR均阴性，表明误诊、漏诊较多。因此RDT不 能满足疟疾防治研究中要求精确诊断的需要，特别是不适用于要求检出低原虫血症的药 物和疫苗研究、防治方案的考核评价和流行病学监测等""。近十多年分子诊断技术的研究和应用发展很快，PCR为基础的诊断试验已公认是 最有前途的新疟疾诊断方法。现已证明套式PCR在检出低原虫血症和混合感染的敏感性 超过镜检法及现有其他实验诊断方法，有很好的可重复性和较少主观性["'9':套式PCR 已广泛应用于疟疾流行病学、抗疟药物试验、疫苗研究、献血员的筛选以及有条件的临 床实验室用于疟疾的确诊和鉴别诊断；Johnston等(美国CDC 2006)提出应当考虑在 参考实验室和一切具有分子实验基本条件的实验室采用套式PCR作为疟疾的确诊手段[10]近年报告的套式PCR疟疾诊断试验m-'"多数仍参照Snounou, G. S.等(1993， 1996) 报告的方法["—':']，以小亚单位核糖体RNA (SSUrRNA)基因作为靶基因，通常设计l对属特 异引物和2-4对种特异引物；检出2种或2种以上人疟原虫的第一 轮PCR(使用属特异引物) 扩增的产物需移入2-4个新试管作为模板，分别用2-4对种特异引物作第二轮扩增， 一份 血样需要做3-5次扩增同时有2-4份扩增产物需做电泳才能得出结果，且操作步骤多易造 成污染。如简单地将2-4对种特异引物放在同一管内作第2轮多重PCR，将产生严重的非 特异扩增，其检出低原虫密度的敏感性和检出混合感染的能力也明显地降低['°]。因此要 获得较好的结果，目前用于疟疾诊断的套式/多重PCR仍需分为多管2轮扩增。复杂的试 剂、繁重的试验操作、严重的非特异扩增以及费用较高等问题，限制了高灵敏的套式PCR 疟疾诊断试验在我国疟疾防治研究领域的实际应用。近年我们在提高套式/多重PCR的特异性和稳定性，简化试剂和操作步骤的研究中，主要通过创新标签引物设计等多项优化 措施，实现了在简化试剂、操作步骤和降低成本的同时保持套式/多重PCR高度敏感性、 特异性和稳定性；研制出简单、灵敏、准确而又价廉的套式/多重PCR疟疾诊断试剂盒， 为套式/多重PCR疟疾诊断试验应用于一切有条件的实验室，为疟疾临床、流行病学调査 研究、疟疾监测以及抗疟药和疫苗研制试验等领域提供一个常规诊断、确诊与鉴别诊断 的可靠工具[14' 15〕。 发明内容-为克服上述现行套式/多重PCR疟疾诊断试验的缺陷，本发明创新了包括模板制备， 引物设计以及反应程序等多项优化措施，研制出一种可同时检出恶性疟原虫和/或间R 疟原虫的单管-套式/多重PCR疟疾基因诊断试剂盒及其检测方法。本试剂盒选用多拷贝的线粒体基因组细胞色素氧化酶基因(co;ri)作靶基因，每个原 虫含有多个线粒体，因而增加了模板分子数量有利于提高敏感性。在co;^基因保守区设计疟原虫属特异套式PCR外侧引物1对 Um-1882 5' -CCCTTCTCGCCATTTGA-3' Um-2817 5' -CGAACCTTCTTACCGTTAT-3'同时运用创新的标签引物设计原理[一，设计合成与人和疟原虫基因无错配的公共标 签引物一个；在cor/基因疟原虫种特异位点设计恶性疟原虫特异和间R疟原虫特异的 套式PCR内侧引物各一对，每条引物5'端添加标签引物序列；最后在这些引物的5' 端再添加与引物3'互补的适当序列(通常6-12个bp)使形成发夹的熔点(Tm)在70~ 80'C。经过梯度PCR和矩阵试验反复测试筛选确定引物序列及其最佳反应程序。它们的序列如下T-zk2-3.65'－TAGATAGTCGTCGCCGGTCGTCTATCTA-3'Fmt誦19955'-AGTCTGGTCGTCGCCGGTCGTCTATCTAAGAACTCTATAAATAACCAGACT-3'Fmt-26055'-GATAGATAACATCGTCGCCGGTCGTCTATCTAACTTCTGGTATGTTATCTATC-3'Vmt-23615'-ACGTGCATCGTCGCCGGTCGTCTATCTACATGCTGTCATACATGATGCACGT-3'Vmt-26155'-TCCTGATACTCGTCGCCGGTCGTCTATCTATTTTCATCATTAGTATCAGGA-3'8这种新型结构的原虫种特异标签引物和公共标签引物的反应温度限制在设定的较 髙温度范围，低于其退火温度时它们形成自身封闭的二级结构，有效地防止引物之间或 引物与其他非靶序列核酸链之间退火。疟原虫线粒体基因组仅为约6 kb的线状DNA， 在反应程序中可使用较低的解链温度，使细胞核染色体DNA处于不解链(或不充分解 链)状态，避免了特异引物与人基因组DNA的错配，从而保证了引物的高度特异性。 检出恶性疟和间闩疟原虫的低限都达到1个虫/每jil血，而检测健康人血样时不出现任 何非特异扩增条带。滤纸血样用1 X PCR缓冲液或1 X模板制备缓冲液(pH7.6 7.9)浸泡洗脱血 红蛋白，95"/5-10min直接热裂解法制备DNA模板采用亚微量反应容积，其反应总 量15nl仅为常规套式PCR的1/3 1/7，从而大大简化了试验歩骤又降低了成本。本发明提供的单管-套式/多重PCR疟疾基因诊断试剂盒包括如下组件1 IOX滤纸血模板缓冲液(pH7.6-7.9) 1.0 ml X 1支(可供制配20份血样)2 Dl试剂16(Hil X l支(检测20份血样，每人份8nl )。组成在1 X PCR缓 冲系统(10鹏ol/L Tris-HC1 pH 8.0， 50 mmol/L KC1, 1.5 mmol/L MgCl， 0. 05% NP-40, 0. 05% Tween-20， 4 dNTP各200 umol/L)中，含1对疟原虫属 特异引物Umf-1882 (60 nmol/L)和Umr-2817 (40陽L/L)。3 D2试剂60 ul X 1支(检测20份血样，每人份3 ul)。组成在1 X PCR缓 冲系统中，含种特异引物Fmft-1995和Fmrt-2605(各14nmol/L)， Vmft-2361 和Vmrt-2615 (各17.5 nmol/L)。标签引物T-zk2-3. 6 (3.5 umol/L)。4 自备试剂纯水，石蜡油，Taq酶 本发明同时提供应用本发明的试剂盒诊断疟疾的检测方法1血样采集本试剂盒适用于检测滤纸血样，用滤纸法采集血液样本既简便经济 又方便保存和运输。2采用缓冲液热裂解法制备滤纸血样DNA模板2.1 1 pi滤纸血样DNA制备方法 1/4滤纸血样圆片(约含l Jil全血)，放入O. 2 ml PCR反应管，加入l X模板制备缓冲液(BF) 100 W,溶血离心洗脱血红 蛋白后，重新加入缓冲液5jil , 95'C加热5 min即可用作PCR模板，直接加入 试剂即可进行PCR扩增反应。2.2 4 ti 1滤纸血样DNA制备方法 取6 mm直径滤纸血样l片(约含4 u l全血) 放入0.5 ml锥型管，加入l X模板制备缓冲液400 W，溶血离心洗脱血红 蛋白后，重新加入l X BF 20 J4， 95 "加热5 10 min，旋涡振荡，离心l min，吸出上清作为PCR扩增模板，4 1C冰箱保存备用。3 UT-PCR试验第一反应每管加入D1试剂7.5 nl ，模板DNA提取液5 jil ， Taq酶l. 0 U和 石蜡油1滴，按下列设定程序反应21个循环，第一反应结束，每管添加D2试剂 2. 5 pl ， Taq酶l. 0 U，同上简短离心后进行第二反应49个循环；共计70个循环 反应程序如下。第l-2循环(94/90s) (86"/ 45s: 48"/40s; 72XV90s) X2 第3-20循环(84XV30s: 49XV40s: 72"/60s) X 18 第21循环(72"/3， ； 4.0"/3， ) X 1第22-25循环(84XV45s;61. 5/40s; 72"C/90s; 84"C/30s; 661C/40; 72 1C/05s: 61.51C/40s; 72"/90s) X 4 第26-29循环(841C/30s: 70XV30s: 72XV60s) X 4 第30-69循环(84TC/30s: 74XV30s: 721C/60s) X40 第70循环结束程序(72XV3， 分析仪上观察和摄像.恶性疟原虫呈现611 bp带，间R疟原虫呈现255 bp带。
图1:应用单管-套式/多重PCR疟疾基因诊断试剂盒检测系列稀释恶性疟和间FI疟 原虫感染血样的电泳图谱。 1 6: 1 X PCR缓冲液(pH 7. 6 7. 9)热裂解法制备4 pl滤纸血样DNA模 板，1 3: 为100， 10， l个恶性疟原虫/nl血，4 6:为100， 10， l个间闩 症原虫All血；M: DNA标志；7 12: 5%Chelex —100离子交换法制备4^1滤纸血样DNA模板，7 9为100 10， 1个个恶性疟原虫AU血，10 12为100， 10, l个间闩疟原虫/jil血。 13， 14为健康人滤纸血样模板(阴性对照) 恶性疟原虫特异带611 bp 间闩疟原虫特异带255 bp
具体实施例方式1. 用滤纸法采集血液样本，常规消毒耳垂或指端刺血均可，滤纸片中央直接接触 血滴，使血液渗透滤纸达2 4cm直径，自然风干后用白纸间隔放入薄膜袋内， 室温或4X:保存；或用活页纸打孔器，打出6mm直径小圆片(约含4 5pl全血)， 置0. 5 1. 5 ml锥型管内4"保存。2. 滤纸血样模板DNA的制备2.1 1 ii 1滤纸血样DNA制备方法剪取6 mm直径滤纸血样圆片的]/4 (约7 ram2 含1J4全血)，放入0.2mlPCR反应管，加入l X PCR缓冲液(BF)pH 7.6~7. 9或 PH 7.6 7.9纯水100 J4,室温溶血10 min， 18 000Xg离心2 min，吸去上清，仅 留滤纸和管底沉淀，重新加入l X BF 5 W， 95 'C加热5 min，直接加入试剂即 可进行PCR扩增反应。2.2 4 ix 1滤纸血样DNA制备方法取6mm直径滤纸血样l片(约含4 u l全血)放入0.5 ml锥型管，加入l X PCR缓冲液400 J4,室温溶血IO min， 18 OOOXg 离心2 min,吸去上清，仅留滤纸和管底沉淀，重新加入1XBF 20 4, 95 T加 热5-10 min，其间旋涡振荡30 s， 18 OOOXg离心l min，吸出上清作为PCR扩增 模板，4 r冰箱保存备用。 3， UT-PCR试验操作反应歩骤每次试验除待检样本外，另设阳性(恶性疟、间闩 疟病人血样)和阴性(健康人血样)对照各一管。每管加入D1试剂7.5 ii 1，上 述制备的滤纸血样模板DNA提取液5 Ul ， Taq酶l.O U和石蜡油l滴，简短离心 后启动PCR仪,待升温至94'C,放入反应管，按下列程序开始第一反应 第1-2循环(94/90s) (861C/ 45s: 48TC/40s: 72TC/90s) X 2 第3-20循环(84XV30s: 49XV40s: 721C/60s) X 18 第21循环(72TC/3' ; 4.0TC/3， ) X 1 .第一反应结束，取出反应管,在4.0r条件下,每管添加D2试剂2.5 lil，Taq酶1.0 U，同上简短离心后继续进行第二反应 第22-25循环(84XV45s;61.5/40s; 721C/90s; 84"/30s; 661C/40; 72"/05s; 61.5"C/40s; 72"C/90s) X 4 第26-29循环(841C/30s: 70r/30s: 72"/60s) X 4 第30-69循环(84tl/30s: 74"/30s: 72t:/60s) X 40 第70循环结束程序(72"C/3' ; 4.0XV3' ) X 1 4，电泳鉴定取PCR第二反应最终产物10yl作2%琼脂糖凝胶电泳,248 um紫外透射分析仪上观察和摄像.恶性疟原虫呈现611 bp带，间H疟原虫呈现255 bp带。参考文献[1] WHO Report on infectious diseases cause 90% of infectious diseases deathsRemoving Obstacles to Health Development 1999， 6-8 [2]盛慧锋，周水森，顾政诚，等.2002年全国疟疾形势中国寄生虫学与寄生虫病杂志2003， 21 (4): 193-196 [3] A Joint WHO/USAID informal consultation .New Perspectives MalariaDiagnosis[J] WHO/MAL/2000.1091 [4] Rubio JM， et al. ， Limited level of accuracy provided by available rapid diagnosis tests for malaria enhances the need for PCR-based reference laboratories. J. Clin. Microbiol, July 2001, p. 2736-2737. [5] Metzger WG， Vivas-Martinez S, Rodriguez I， et al.,Malaria diagnosis underfield conditions in the Venezuelan Amazon. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2007Oct 3;[6] Tham， J. M., Lee, S. H., Tan, T- M C., et al. ， Detection and species determination of malaria parasites by PCR: comparison with microscopy and with paraSight-F and ICT malaria Pf tests in a clinical environment. Journal of Clinical Microbiology. 1999 37:1269-1273.[7] Zaman S, Tan L， Chen HH， et al. ， The detection of /7aaz70cY咖/a/c/paraw and 尸.FJ'raAT in DNA-extracted blood samples using polymerase chain reaction[J]-Trans R Soc Trop Med Hyg. 2001 95:391-397.[8] Singh B， Bobogare A， Cox-Singh J， Snounou G， Abdullah MS, Rahman HA. A genus-and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 1999 Apr;60 (4) :687-92.[9] Stephanie P, Johnston, Norman J\ Pieniazek, Maniphet V. Xayavong， Susan B. Slemenda, Patricia P. Wilkins， and Alexandre J. da Silva PCR as aMicrobiology, Mar. 2006， p. 1087 - 1089. [1.0] Russell E Coleman*, Jetsumon Sattabongkot， Sommai Promstaporm， et al.， Comparison of PCR and microscopy for the detection of asymptomatic malaria in a /Vs柳0(y/咖/aJci; ar"/K/i/iraA" endemicarea in Thailand胞Jarj,s /o"r朋J 2006，5:121[11] Ndao M， Bandyayera E， Kokoskin E,. et al. ， Comparison of blood smear, antigen detection, and nested-PCR methods for screening refugees from regions where malaria is endemic after a malaria outbreak in Quebec, Canada. J Clin Microbiol. 2004 Jun; 42 (6) :2694-700.〔12] Snounou G. ， et al. ， High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and Biochemical Parasitology, 1996 61， 315-320.[13] Snounou G., et al. ， Suganya Viriyakosol, William J"arra， et al.， Identification of the four human malaria parasite species in field samples by the polymerase chain reaction and detection of a high prevalence of mixed infections. Molecular and Biochemical Parasitology, 1993a 58:283—292.[14] Huang TY, Wang SH , Li XM， et al. Tag Primer-Nested/Multiplex PCR for Detection of尸/352 0 //咖faZc!.; ar咖and /Vas啦cZ/咖w'va;r[J]. Chin J Parasitol Dis,2005， 23,140-142. (in Chinese)(黄天谊，王世海，黎学铭，等.标签引物-套式/多重PCR检测恶性疟原虫和间FI疟原虫 的研究[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2005， 23: 140-142.) [15]GU0 Chuan-kun, U Xue-raing， LI J"in-hui，et al., Primary Study on the Sensibility, Specificity and Stability of Tag-primer Nested/multiplex PCR for Malaria Diagnosis. Chin J Parasitol Dis, 2007, 25，140-142. (in Chinese)(郭传坤，黎学铭，李锦辉，毛玮，林珍，杜进发，黄天谊，等.套式/多重PCR诊断疟疾的 敏感性、特异性和稳定性初探[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2007， 25: 140-142.)。
权利要求
1，疟疾单管-套式/多重PCR(UT-PCR)基因诊断试剂盒，其特征在于选用多拷贝的线粒体基因组细胞色素氧化酶基因(coxl)作靶基因，在coxl基因保守区设计疟原虫属特异套式PCR外侧引物1对，它们的序列是Umf-1882 5′-CCCTTCTCGCCATTTGA-3′Umr-2817 5′-CGAACCTTCTTACCGTTAT-3′
2,根据权利要求1所述的疟疾UT-PCR基因诊断试剂盒，其特征在于运用创新的标签引物设计原理，]，设计合成与人和疟原虫基因无错配的公共标签引物一个；在COW基因疟原虫种特异位点设计恶性疟原虫特异和间FI疟原虫特异的套式PCR内侧引物各一对，每条引物5'端添加标签引物序列；最后在这些引物的5'端再添加与引物3'端互补的适当序列(通常6-12个bp)使形成发夹的熔点(Tm)在70-80'C。经过反复测试筛选确定的引物序列如下 T-zk2-3.6 5' -TAGATAGTCGTCGCCGGTCGTCTATCTA-3'Fmt-1995 5' -AGTCTGGTCGTCGCCGGTCGTCTATCTAAGAACTCTATAAATAACCAGACT-3' Fmt-2605 5' -GATAGATAACATCGTCGCCGGTCGTCTATCTAACTTCTGGTATGTTATCTATC-3 Vmt-2361 5' -ACGTGCATCGTCGCCGGTCGTCTATCTACATGCTGTCATACATGATGCACGT-3 Vmt隱2615 5' -TCCTGATACTCGTCGCCGGTCGTCTATCTATTTTCATCATTAGTATCAGGA-3'
3，根据权利要求1所述的疟疾UT-PCR基因诊断试剂盒，其特征在于采用滤纸法采集 血样，滤纸血样用1 X模板制备缓冲液(pH7.6-7.9)浸泡洗脱血红蛋白，95'C/5-I0 min直接热裂解法制备DNA模板。
4，根据权利要求1所述的疟疾UT-PCR基因诊断试剂盒，其特征在于采用亚微量反应 容积，其反应总量15 fil仅为常规套式PCR的1/3~1/7，从而大大降低成本。
5，根据权利要求1所述的疟疾UT-PCR基因诊断试剂盒，其特征在于包括下列组件 ①10 X滤纸血模板制备缓冲液(pH 7.6-7.9) 1.0 ml X l支，临用时用纯水或双 蒸水稀释10倍(可供制备20份血样模板DNA);② Dl试剂160 ul X l支(检测20份血样，每人份8 ul)。③ D2试剂60 ul X 1支(检测20份血样，每人份3 ul)。
PF阳性对照模板DNA 20 ul X 1支 PV阳性对照模板DNA 20 ul X 1支
6,根据权利要求5所述的疟疾UT-PCR基因诊断试剂盒，其特征在于所述D1试剂的 组成为在1 X PCR缓冲系统(10 mmol/L Tris-HCl pH 8. 0, 50 mmol/L KC1， 1. 5 鹏ol/L MgCl， 0.05% NP-40， 0.05% Tween-20, 4 dNTP各200腦ol/L)中，含1 对疟原虫属特异引物IM-1882 (60 nmol/L)和Umr-2817 (40,1/L)。所述D2 试剂的组成为在1 X PCR缓冲系统中，含恶性疟原虫种特异引物Fmft-1995和 Fmrt-2605 (各14 nraol/L)，间R症原虫种特异引物Vmft-2361和Vmrt-2615 (各 17.5 nraol/L)和公共标签引物T-zk2-3. 6 (0.35 umol/L)。
7，疟疾UT-PCR基因诊断试剂盒诊断疟疾的检测方法包括如下步骤① 用滤纸法采集血液样本② 制备滤纸血样DNA模板:提供2种方法可任选一种1 ii 1滤纸血样DNA制备方法或 4 ul滤纸血样DNA制备方法，我们推荐使用后者。③ UT-PCR试验反应步骤己高度简化，全程反应都在一个管内完成，反应分为2步，第一 反应20个循环，由1对属特异引物引导作基础扩增，以提高模板分子的数量和质 量；第21循环结束于4C取出反应管，添加D2试剂(含2对原虫种特异引物和. 1个公共标签引物)即继续反应。第二反应44个循环，由原虫种特异引物引导4 个循环种特异片段扩增；其后40个循环由单一公共标签引物引导特异片段的增量 扩增。 电泳鉴定取PCR第二反应最终产物10 ul作2%琼脂糖凝胶电泳，248 um紫外透射分析仪上观察和摄像.恶性疟原虫呈现611 bp带，间闩疟原虫呈现255 bp带。
8，根据权利要求7所述的疟疾UT-PCR基因诊断试剂盒的检测方法，其特征在于所述 的4 u 1 (或114)滤纸血样DNA制备方法为 取6 mm直径滤纸血样1片约含 4 ul全血(或l/4片约含l[il全血)放入0.5ml (或200W)锥型管，加入1XPCR 缓冲液400 Ml，(或100W)室温溶血10 min， 18 000Xg离心2 min，吸去上清， 仅留滤纸和管底沉淀，重新加入1XBF 20 (或5W)， 95卩加热5-10min，其间 旋涡振荡30 s， 18 OOOXg离心l min，吸出上清作为PCR扩增模板，4 "C冰箱保 存备用。
9，根据权利要求7所述的疟疾UT-PCR基因诊断试剂盒的检测方法，其特征在于第一反 应每管加入D1试剂7. 5 ul，上述制备的滤纸血样模板DNA提取液5 ul ， Taq酶l. 0 U和石蜡油l滴，简短离心后启动PCR仪，待升温至94X:，放入反应管，按下列程序开 始第l-2循环(94/90s) (86"/ 45s: 48TC/40s; 72XV90s) X 2 第3-20循环(84XV30s: 49"/40s: 72"C/60s) X 18 第21循环(72"/3， ； 4.0XV3， ) X 1 . 10，根据权利要求7所述的疟疾UT-PCR基因诊断试剂盒的检测方法，其特征在于步骤 ③所述的第二反应为第一反应结束,取出反应管，在4. OX:条件下，每管添加D2试剂 2.5 ul,Taq酶l.O U，同上简短离心后按下列程序继续进行第二反应 第22—25循环(84XV45s;61.5/40s; 721C/90s; 84t!/30s; 66TC/40; 72XV05s; 61. 5"C/40s; 721C/90s) X 4 第26-29循环(841C/30s: 70"C/30s; 72"C/60s) X 4 第30-69循环(841C/30s: 74"C/30s: 72"/60s) X 40 第70循环结束程序(72X73， 4.0TC/3' ) X 1 。
全文摘要
本发明公开了一种疟疾单管-套式/多重PCR基因诊断试剂盒及其检测方法。该发明根据4种人疟原虫线粒体细胞色素氧化酶(cox1)基因序列，运用创新的引物设计理念，设计合成疟原虫属特异引物、疟原虫种特异标签引物和公共标签引物等多项优化措施，使传统试剂复杂操作繁重的套式/多重PCR简化为仅用4ul滤纸血样，单管2步反应即可同时检出恶性疟与间日疟原虫，其敏感性与特异性均超过显微镜检查法，达到可检出1个虫/每ul血的水平。不仅可检出疟疾现症病人，也可检出低原虫血症的慢性病人和无症状带虫者；可作为各级医院疟疾确诊和鉴别诊断的可靠手段，也为疟疾防治监测，抗疟药物试验和疟疾疫苗研究以及献血员筛选提供一个简易、经济、灵敏、准确的疟疾诊断工具。
文档编号C12Q1/68GK101240337SQ20071030351
公开日2008年8月13日 申请日期2007年12月29日 优先权日2007年12月29日
发明者李锦辉, 杜进发, 珍 林, 玮 毛, 郭传坤, 黄天谊, 黎学铭 申请人:广西壮族自治区疾病预防控制中心