专利名称：：一种在大肠杆菌中表达瑞替普酶的方法
技术领域：
：本发明涉及一种在大肠杆菌中表达瑞替普酶的方法。
背景技术：
：瑞替普酶(reteplase，r-PA)是人组织型纤溶酶原激活剂(humantissuetypeplasminogenactivator,t-PA)的缺失突变体，是利用基因工程方法使t-PA的Kringlel、EGF和Finger三个结构域缺失，只保留其Kringle2区和丝氨酸蛋白酶区(P区)的一种药用蛋白质，从而保留了t-PA与纤维蛋白结合的能力和激活纤维蛋白酶原生物活性的能力。r-PA含有t-PA527个氨基酸中的355个(13和176527)，分子量39kD，单链、非糖基化蛋白，具有纤溶效果强、再通率高、起效迅速和副作用小等优点，是目前临床上应用最好的第三代溶栓药物之一。近年来已有许多关于表达t-PA及其突变体的报道，一般是在大肠杆菌中表达，也有在烟草、昆虫细胞、酵母、哺乳动物细胞、黑曲霉和转基因动物乳腺等中表达的报道，每种表达体系都有不同的特点。真核细胞表达系统表达量往往较低，因而生产成本较高，目前主要用来表达在原核细胞中难以表达的需要糖基化、分子结构复杂的蛋白。毕赤酵母表达系统的缺点是周期长、成本高以及具有过糖基化现象，而且它不是一种食品微生物，发酵时要添加甲醇，所以用它来生产药品或食品还没有被广泛接受。目前对r-PA的表达研究的最多的还是大肠杆菌表达系统。BoehringerMannheimGmbH用大肠杆菌表达t-PA的突变体BM06.022，建立了r-PA商品化的生产过程(德国)。但其表达量及得率均比较低，故而造成r-PA生产成本高，无法成为更多病人的福音。
发明内容本发明的目的是提供一种在大肠杆菌中表达瑞替普酶的方法。本发明所提供的在大肠杆菌中表达瑞替普酶的方法，是将瑞替普酶基因插入到原核表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体，再将该重组表达载体与质粒pREP4共转化大肠杆菌，得到重组大肠杆菌，培养该重组大肠杆菌，表达得到瑞替普酶。所述原核表达载体不含有"cl基因。所述原核表达载体可为质粒pRSETa。培养所述重组大肠杆菌的过程中需加入IPTG进行诱导表达。所述大肠杆菌可为大肠杆菌T0P10或大肠杆菌BL21(DE3)。所述大肠杆菌具体为大肠杆菌BL21(DE3)。当所述重组大肠杆菌达到对数生长期时，还可加入终浓度为0.1%_2%(质量百分含量)的葡萄糖，以降低重组大肠杆菌自身蛋白的本底表达，从而提高外源瑞替普酶的表达量。由于pREP4在大肠杆菌中持续高表达"cl，Zacl结合到重组表达载体的启动子序列上，使瑞替普酶以更高水平转录，提高了瑞替普酶在大肠杆菌中的表达量。本发明方法可以大大提高瑞替普酶在大肠杆菌中的表达量，用本发明方法培养上述重组大肠杆菌，瑞替普酶的表达量占总蛋白的48±5%。本发明方法简单易行，能降低生产成本，为瑞替普酶的普及和应用奠定坚实的基础，同时对大规模工业化生产重组外源蛋白具有重要的意义。图1为r-PA在大肠杆菌中的表达图2为westernblot的结果具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例l、瑞替普酶在大肠杆菌中的表达1、从人黑色素瘤细胞(上海麦莎生物有限公司，货号B01194)中提取mRNA，用引物(5'陽CCACCATGGATGCAATGAAGAG-3'和5'-CCTCGAGACCATGGGATCTTACCAAGTG-3')RT-PCR扩增得到t-PA片段。再以该t-PA片段设计突变引物(5，-CGGGATCCACATGTCTTACCAAGGAAACAGTGACTGCTACTTTG-3,禾口5，-CCCGAATTCTTATCACGGTCGCATGTTGTC-3'，引物划线部分分别为和fcoM酶切位点)PCR扩增得到r-PA序列，历'/2rf[n和y5bo皿双酶切后插入到质粒pET32a(丽AGEN，CatalogNo.69015-3)的和5c。jW位点间，得到重组质粒pET32-rPA。以pET32-rPA为模板，用引物K1和P2进行PCR扩增。引物Kl和P2，其序列分别是K1:GGGGGATCCTCTTACCAAGGAAACAGTGAC(划线部分为酶切位点feyz^/的碱基序列)，P2:GGGAAGCTTTTATCACGGTCGCATGTTG(划线部分为酶切位点历V^/iT的碱基序列)。将扩增得到的PCR产物进行W琼脂糖凝胶电泳，结果在llOObp处有很亮的目的条带。切下目的条带，纯化回收后用;fe/z^/和历7^iT/进行双酶切，即得到r-PA基因片段。将该r-PA基因片段进行序列测定，具体序列如序列表中的序列l。2、用&y^iSl历/^/i7双酶切具有氨卞青霉素抗性的原核表达载体pRSETa(Invitrogen公司，CatalogNo.V351-20)，回收2860bp的载体大片段。3、将^ay/M和历72oai1双酶切后的r-PA基因片段和用同样酶切后的载体大片段混合，T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将上述大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞涂布在含有100ug/ml氨卞青霉素的LB培养基平板上，培养12小时后挑取单克隆，提取质粒用Aa历M和历'^/[II酶切验证，琼脂糖凝胶电泳检测，将获得的2.86kb的载体片段和的l.lkbr-PA基因片段的重组质粒命名为pRSET-rPA。对pRSET-rPA进行测序鉴定，结果表明pRSET-rPA中，在^历M和历v^rn位点间的插入片段的核苷酸序列与序列表中序列i相同。4、用氯化钙转化法，将质粒pRSET-rPA和质粒pREP4(QIAGEN，CatalogNo.32149)各lul共转化大肠杆菌BL21(DE3)，同时将质粒pRSETa和质粒pREP4各lul共转化大肠杆菌BL21(DE3)作为对照，将质粒pRSETalul转化大肠杆菌BL21(DE3)作为对照，按照下述方法进行转化和诱导表达。5、将转化有质粒pRSET-rPA和质粒pREP4的重组大肠杆菌BL21(DE3)命名为pRSET-rPA/pREP4/BL21(DE3)，将转化有质粒pRSETa和质粒pREP4的重组大肠杆菌BL21(DE3)命名为pRSETa/pREP4/BL21(DE3)，将转化有质粒pRSETa的重组大肠杆菌BL21(DE3)命名为pRSETa/BL21(DE3)。将这三种重组大肠杆菌分别接种到10毫升含有终浓度分别为100ug/ml的氨卞青霉素和25ug/ml的卡那霉素的LB液体培养基中，37°C，220rpm培养过夜。6、将步骤5中的过夜培养物分别按1%的体积比转接到200ml含有终浓度分别为100ug/ml的氨卞青霉素和25ug/ml的卡那霉素的LB液体培养基中，37°C，220rpm培养至其OD600为0.6时加入IPTG，使IPTG的终浓度为lmmol/ml，同时加入葡萄糖，葡萄糖的终浓度为0.1%2%(质量百分含量)。7、上述三种重组大肠杆菌诱导表达5个小时后，分别收集菌液，12000rpra离心5分钟，取上清液，进行SDS-PAGE电泳。电泳结果如图l所示。其中，l为pRSET-rPA/pREP4/BL21(DE3)表达产物的电泳检测结果，2为pRSETa/pREP4/BL21(DE3)表达产物的电泳检测结果，3为pRSETa/BL21(DE3)表达产物的电泳检测结果。结果表明只有重组大肠杆菌pRSET-rPA/pREP4/BL21(DE3)有r-PA蛋白(39kDa)的表达。将电泳结果拍照后用电脑自带的软件Gel-proAnalyzer扫描分析，实验共设三次重复。结果表明r-PA的表达量占总蛋白的48士5X。具体的表达量如表1所示，表1为三次重复实验的平均值。表1中，泳道1为pRSET-rPA/pREP4/BL21(DE3)表达产物的结果，2为pRSETa/pREP4/BL21(DE3)表达产物的结果，3为pRSETa/BL21(DE3)表达产物的结果。其中，r3条带为r-PA。表l:Gel-proAnalyzer对表达结果的分析数据<table>complextableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>8、对上述表达得到的r-PA蛋白进行westernblot检测，以证明表达的蛋白是瑞替普酶。以t-PA抗体(t-PA(C-16):goatpolyclonalantibody,SantaCruzBiotechnology,Inc.CatalogNo.Sc5239)为一抗，上述三种重组大肠杆菌表达的蛋白进行westernblot检测，结果如图2所示。结果表明只有重组大肠杆菌pRSET-rPA/pREP4/BL21(DE3)表达产物用t-PA抗体可以结合得到分子量为39KDa的r-PA蛋白。图2中，l为pRSET-rPA/pREP4/BL21(DE3)表达产物的检测结果，2为pRSETa/pREP4/BL21(DE3)表达产物的检测结果，3为pRSETa/BL21(DE3)表达产物的电泳结果。序列表〈160>1<210>1〈211〉1068〈212〉DNA〈213>人工序列〈400〉1tcttacc肌gg3犯cagtg3ctgctactttgggaatgggtcsgcctsccgtggceicgcac60agcctcaccgagtcgggtgcctcctgcctcccgtggaattccatgatcctgataggcaag120gtttacacagcacagaaccccagtgcccaggcactgggcctgggcaaacataattactgc180cggaatcctgatggggatgccaagccctggtgccacgtgctgaagaaccgcaggctgacg240tgggagtactgtgatgtgccctcctgctccacctgcggcctgagacagtacagcceigcct300cagtttcgcatcaaaggagggctcttcgccgacatcgcctcccacccctggcaggctgcc360atctttgccaagcacaggaggtcgcccggagagcggttcctgtgcgggggcatactcatc420agctcctgctggattctctctgccgcccactgcttccaggagaggtttccgccccaccac480ctgacggtgatcttgggcagaacataccgggtggtccctggcgaggaggagcagaaattt540gaagtcgaaaaatacattgtccataaggaattcgatgatgacacttacgacaatgacatt600<sequence>complexsequenceseeoriginaldocumentpage8</sequence>权利要求1、一种在大肠杆菌中表达瑞替普酶的方法，是将瑞替普酶基因插入到原核表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体，再将该重组表达载体与质粒pREP4共转化大肠杆菌，得到重组大肠杆菌，培养该重组大肠杆菌，表达得到瑞替普酶。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述原核表达载体不含有基因。3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述原核表达载体为pRSETa。4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述表达用IPTG进行诱导。5、根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌T0P10。6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述表达在含有终浓度为0.1%一2%的葡萄糖的培养基中进行；所述百分含量为质量百分含量。8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述瑞替普酶基因的核苷酸序列如序列表中序列1。全文摘要本发明公开了一种在大肠杆菌中表达瑞替普酶的方法。本发明所提供的在大肠杆菌中表达瑞替普酶的方法是将瑞替普酶基因插入到原核表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体，再将该重组表达载体与质粒pREP4共转化大肠杆菌，得到重组大肠杆菌，培养该重组大肠杆菌，表达得到瑞替普酶。本发明方法可以大大提高瑞替普酶在大肠杆菌中的表达量，用本发明方法培养上述重组大肠杆菌，每升培养基中瑞替普酶的表达量占总蛋白的48±5％。本发明方法简单易行，能降低生产成本，为瑞替普酶的普及和应用奠定坚实的基础，同时对大规模工业化生产重组外源蛋白具有重要的意义。文档编号C12N15/09GK101195824SQ20071030376公开日2008年6月11日申请日期2007年12月21日优先权日2007年12月21日发明者孙石静,张春娥,蔡国平申请人:清华大学深圳研究生院