专利名称：：靶向wnt-1基因的RNA干涉质粒的构建方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学及医学基因治疗研究、应用
技术领域：
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背景技术：
：Wnt-l基因，wnt-l(wingless-typeMMTVintegrationsitefamilymember1)，最早来源于Int-l，1991年NusseA.第一次提出将Int-l命名为Wnt-l，因为lnt-l与wnt基因家族具有同源性。Wnt-l基因由805个腺嘌呤、1523个胞嘧啶、1320个鸟嘌呤、874个胸腺嘧啶组成。目前有些研究成果证明Wnt-1蛋白是控制细胞生长、增殖的关键分泌信号分子，可传递细胞间相互调控信息，该基因在干细胞分化，神经发育中起着重要作用。Wnt-l基因表达的的高低与大多数肿瘤的发生发展有密切关系。但是wnt-l基因的功能尚未完全清楚。为了清楚的了解该基因在细胞生物学当中的功能，可以为人类许多疾病的治疗开辟新的道路。2006年美国加利福尼亚大学YouL.等学者认为WNT-1信号是一个潜在的肿瘤治疗靶向基因。目前运用RNA干涉的方法研究基因功能逐渐成为基因功能研究的主流，但是针对wnt-l基因的RNA干涉研究不是很多。仅有的一些研究大多采用化学合成的siRNA片段转染细胞进行干涉，还有一部分采用针对wnt-l基因的RNA干涉质粒转染细胞进行研究，但是这些质粒缺少标记报告基因和抗性基因，对于转染效率的检测和筛选稳定干涉的细胞株带来不便。而我们采用的pGPU6/GFP/Neo载体既有还有绿色荧光蛋白的标记报告基因，可以同步检测质粒在细胞内表达效率，同时又有Kan/G418的耐受基因，可以方便的筛选稳定干涉的细胞株。因此我们插入靶向wnt-l的siRNA片段可以成为研究该基因一个有力的工具。
发明内容本发明目的在于构建一种可以用于靶向wnt-l、具用标记报告基因和抗性基因的耙向wnt-l基因的RNA干涉质粒的构建方法。本发明将靶向wnt-l基因的siRNA片段插入pGPU6/GFP/Neo载体中，构建成靶向wnt-l基因的RNA干涉质粒。本发明改善了目前针对wnt-l基因的RNA干涉质粒的没有标记、没有筛选基因的不足，使针对wnt-l基因进行RNA干涉的质粒同时具有上述两个标记，使得研究wnt-l基因的功能提供更加可靠和便捷的方法。将来为开发以针对wnt-l相关的基因治疗药物提供可能。本发明包括以下具体步骤1)将耙向wnt-l基因的siRNA片段反转录；2)将反转录的靶向wnt-l基因的siRNA片段与原靶向wnt-l基因的siRNA片段用loop结构TTCAAGAGA相连接，再连接转录终止序列采用T6结构形成正义链；3)将上述正义链反转录形成反义链；4)将正义链模板的5'端添加CACC片段，可与Bbsl酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5'端添加GATC片段，可与BamHI酶切后形成的粘端互补。5)将所述正义链和反义链的寡核苷酸溶液退火反应，形成shRNA模板；6)将shRNA模板插入线性的pGPU6/GFP/Neo载体构建成耙向wnt-l基因的RNA干涉质粒。为避免形成终止信号，shRNA模板中的loop结构选用TTCAAGAGA,shRNA的转录终止序列采用T6结构。所述耙向wnt-l基因的siRNA片段为wnt-l誦l:5-CCTGCTTACAGACTCCAAGAG-3。或wnt-1-2:5-ACGGCGTTTATCTTCGCTATC匿3。图1pGPU6/GFP/Neo的图谱图2重组载体的酶切鉴定图3重组载体的测序报告具体实施例方式1、根据人wnt基因的全序列选择两个siRNA片段制备shRNA寡核苷酸的合成-根据人wnt基因(Homosapienswingless-typeMMTVintegrationsitefamily,member1，NM—005430)的全序列选择两个siRNA片段,分别命名为wnt-l-l、wnt-1-2:wnt-1-1:5-CCTGCTTACAGACTCCAAGAG-3wnt-1-2:5-ACGGCGTTTATCTTCGCTATC-3(1)根据设计的wnt-l-l设计化学合成耙向wnt-1shRNA的wnt-l-l正义链和反义链先将wnt-l-l:5-CCTGCTTACAGACTCCAAGAG-3反转录；形成3國GGACGAATGTCTGAGGTTCTC-5。再将以上两片段用loop结构TTCAAGAGA连接，再连接转录终止序列采用T6结构形成wnt-l-l正义链GTAAGCAGGTTTTTTG-3经反转录，形成wnt-l-l反义链GAGTCTGTAAGCAGGC-3(2)根据设计的wnt-1-2设计化学合成靶向wnt-1shRNA的wnt-1-2正义链和反义链先将wnt-l-2:5-ACGGCGTTTATCTTCGCTATC-3反转录；形成3誦TGCCGCAAATAGAAGCGATAG隱5。再将以上两片段用loop结构TTCAAGAGA连接，再连接转录终止序列采用T6结构形成wnt-l-2正义链AACGCCGTTTTTTTG-3经反转录，形成wnt-l-2反义链AAGATAAACGCCGTC隱3并在两个正义链模板的5'端分别添加了CACC，与Bbsl酶切后形成的粘端互补；在反义链模板的5'端分别添加了GATC，与BamHI酶切后形成的粘端互补。(3)制备shRNA模板将DNA寡核苷酸单链分别用TE(pH8.0)溶解，浓度为100uM。取相应的正义链和反义链寡核苷酸溶液，按照如下配比配置退火反应体系。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>在PCR仪上按照如下程序进行退火处理95。C5min;85°C5min;75°C5min;70。C5min;4。C保存。退火处理后得到两组浓度为10uM的shRNA模板。将所得模板分别溶液稀释500倍，终浓度为20nM，用于连接反应。2、耙向wnt-l基因pGPU6/GFP/Neo-shRNA载体的构建(1)pGPU6/GFP/Neo载体的线性化如图1所示pGPU6/GFP/Neo的图谱取2ugpGPU6/GFP/Neo载体，按照如下体系进行酶切处理:<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>37。C酶切l小时，琼脂糖电泳，使用AgaroseGelDNAPurificationKitVer2.0(TaKaRa)回收，电泳检测估算浓度，稀释浓度至50ng/ul。(2)按照如下体系分别进行两个载体的连接反应:<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>22。C连接一个小时。(3)每个连接反应转化大肠杆菌DH5a的感受态细胞，涂布到Kanamycin抗性的LB培养基平板上，37摄氏度培养18小时，各挑取6个菌落，接种到含50ug/mlKanamycin的LB液体培养基中摇菌过夜。使用碱裂解法抽提质粒，所得质粒用BamHI,PstI分别酶切鉴定。阳性重组载体应该可以被BamHI切开，而不能被PstI切开。3、鉴定结果所有质粒用BamHI，PstI分别酶切鉴定。阳性重组载体应该可以被BamHI切开，而不能被PstI切开。酶切鉴定质粒均为阳性重组载体，每一种载体选择两个克隆进行测序鉴定(上海英骏生物技术有限公司)。经测序设计的靶向wnt-l基因的shRNA完整被插入pGPU6/GFP/Neo载体。如图2所示重组载体的酶切鉴定结果M:lamda/Eco1301，最左侧1-6为wnt-l-l(l-6)Pstl酶切结果，其右侧l-6为wnt-l-2(l-6)Pstl酶切结果，其右侧1-6为wnt-l-l(l-6)5謹HI酶切结果，最右侧1-6为wnt-l-2(l-6)S"附HI酶切结果。在Marker的左侧所有质粒清楚显示三条带，说明质粒没有被切开，而Marker的右侧所有质粒均被切开，出现一条明亮条带。如图3所示A为靴向wnt-l基因的质粒wnt-1-1的测序图，B为耙向wnt-1基因的质粒wnt-1-2的测序图。用通用引物T3PromotorPrimer测序，A图显示从268bp开始至330为完整插入的wnt-1-1正义链序列，A图显示从268bp开始至330为完整插入的wnt-1-2正义链序列。<110>扬州大学<120>靶向wnt-l基因的RNA干涉质粒的构建方法<160>9<210>1<211〉21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人wnt基因的全序列产siRNA片段wnt-l-l<400>1cctgcttacagactccaagag<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人wnt基因的全序列产siRNA片段wnt-l-l的反转录<400>2ggacgaatgtctgaggttctc<210>3<211>9<212>DNA<213>人工序列<220><223>loop结构<400>3<210〉4<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>wnt-l-l正义链<400>4caccgcctgcttacagactccaagagttcaagagactcttggagtctgtaagcaggtttt60ttg<210>5<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>wnt-l-l反义链<400>5gatccaaaaaacctgcttacagactccaagagtctcttgaactcttggagtctgtaagca60ggc<210〉6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223〉人wnt基因的全序列产siRNA片段wnt-l-2<400>6acggcgtttatcttcgctatc<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人wnt基因的全序列产siRNA片段wnt-l-2的反转录<400>7tgccgca犯t3g肌gcg3teg<210>8<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>wnt-l-2正义链<400>8caccgacggcgtttatcttcgctatcttcaagagagatagcgaagataaacgccgttttt60ttg<210>9<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>wnt-l-2反义链<400>9gatccaaaaaaacggcgtttatcttcgctatctctcttgaagatagcgaagataaacgcc60gtc权利要求1.靶向wnt-1基因的RNA干涉质粒的构建方法，其特征在于将靶向wnt-1基因的siRNA片段插入pGPU6/GFP/Neo载体中，构建成靶向wnt-1基因的RNA干涉质粒。2、根据权利要求1所述靶向wnt-l基因的RNA干涉质粒的构建方法，其特征在于包括以下步骤1)将靶向wnt-l基因的siRNA片段反转录；2)将反转录的靶向wnt-l基因的siRNA片段与原靶向wnt-l基因的siRNA片段用loop结构TTCAAGAGA相连接形成正义链；3)将上述正义链反转录形成反义链；4)将所述正义链和反义链的寡核苷酸溶液退火反应，形成shRNA模板；5)将shRNA模板插入线性的pGPU6/GFP/Neo载体构建成耙向wnt-l基因的RNA干涉质粒。3、根据权利要求2所述靶向wnt-l基因的RNA干涉质粒的构建方法，其特征在于正义链模板的5'端添加CACC片段；反义链模板的5'端添加GATC片段。4、根据权利要求3所述靶向wnt-l基因的RNA干涉质粒的构建方法，其特征在于shRNA的转录终止序列采用T6结构。5、根据权利要求1所述靶向wnt-l基因的RNA干涉质粒的构建方法，其特征在于所述耙向wnt-l基因的siRNA片段为wnt-1-1:5-CCTGCTTACAGACTCCAAGAG-3。6、根据权利要求1所述靶向wnt-l基因的RNA干涉质粒的构建方法，其特征在于所述耙向wnt-l基因的siRNA片段为wnt-1-2:5-ACGGCGTTTATCTTCGCTATC-3。全文摘要靶向wnt-1基因的RNA干涉质粒的构建方法，属于分子生物学及医学基因治疗研究、应用
技术领域：
。将靶向wnt-1基因的siRNA片段插入pGPU6/GFP/Neo载体中，构建成靶向wnt-1基因的RNA干涉质粒。本发明改善了目前针对wnt-1基因的RNA干涉质粒的没有标记、没有筛选基因的不足，使针对wnt-1基因进行RNA干涉的质粒同时具有上述两个标记，使得研究wnt-1基因的功能提供更加可靠和便捷的方法。将来为开发以针对wnt-1相关的基因治疗药物提供可能。文档编号C12N15/65GK101368186SQ200710302590公开日2009年2月18日申请日期2007年12月27日优先权日2007年12月27日发明者武永康,段晓春,伦董申请人:扬州大学