前列腺癌的场效应分析方法和试剂盒的制作方法

专利名称：：前列腺癌的场效应分析方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉皿存在于肿瘤周围的区域，例如夕卜科手术的边缘的甲Sit^因的检查。冃尿坟不田野癌化(fieldcancerization)，也称为场安她(fieldeffect)，于1950年代首次被提出以用来解释多发的原发倒中瘤(primaiytumor)的发生和局部复发。，基于下列观察结果即癌症在多损伤区域中发展，且不正常组织环绕肿瘤周围，,明肿瘤细KI中瘤前的细胞，于肿瘤附吐的正常组织区域内。评估月中瘤扩散的标准技术是外科切除原发性肿瘤后用光学显微镜仔细检査夕卜禾好术的边,其鹏织。舰已有的辦，M31标准技术把临腿织船，并在光学显微镜下检查是否存在肿瘤细胞。准确的治疗分期(therapeuticstaging)倉嫩评估肿瘤局部扩散的范围以及在M^端，如淋巴结处的鄉区域的存在。组织病理学的评tt^帮助确定存活概率的，指标。基于视觉观察和在光学显微镜下对临近组织和淋巴结区域的形态学评价的标准组织病理学方法已知具有局限性。希望有这样的方法其倉g^更容易地在早期确定織的扩散，并且能够更准确地指示肿瘤转移到临近和周围组织的范围。本发明提供了这样的方法，所述方法基于检测样品中的甲基化标记物(markers)。在高等餓生物中，DNA仅在CpG二蹄酸中的相对于鸟嘌呤的5'胞嘧啶处甲基化。这一修饰在基因^h具有重要的调节效果，特别是当它涉及位于基因启动子区域的富含CpG的区域(CpG岛)时。正常的非甲皿CpG岛的异常甲基化是不断增殖和转化的细胞中的常见事件，并与特定肿瘤抑制基因或其他与特定人体癌症的好转有关的基因的转录失活相联系。当组织病理学信息不明确或者不是很有帮助的时候，或者其能增加组织滴理学信息的細时，检测诸如,的甲基化割牛倉^^诊断和减预后信息。
发明内容本发明的一个方面是用于表征前列腺癌的方法，所述方法基于对甲基化Marker的检测，该甲^fcMarker是在^标准的组织学技;m査时显示正常的组织馮理学外禾4^术纖(surgicalmargins)附近可险测的。本发明，一种方法，^M方法可用作细胞病理学的辅助手段、高feA群的和接受化，防或化学治疗的高危患者的监测。本发明的另一个方面是用于表征前列腺癌的试剂盒。F^试剂盒包括用于放大和检测甲基itMarkere的试剂并包含利用夕卜禾样术纖样品的用于前列腺癌患者的说明书。在发明的另一^^方面中，患者始终以这样的方，行治疗在该方式中根据肿瘤边缘(tumormargms)存在或不存在甲基化Markei^来治疗患有侵袭性(aggressive)前列腺癌^^和性(indolent)前列JM的患者。在本发明的又一个方面中，砂1^样术職样品中检测来自下列组的一个或多个基因的超甲基化APC、RASSF1A和RARP2。患者有关前列腺癌的情况基于皿检测征。超甲基化的检测，于该疾病的转移或侵袭性的不良预后的指标。所述,最连同其他指标一^^行。在本发明的另一个方面中，甲基化汰态iKi定量的实时PCR领啶。图1是显示具有场鹏的样品的M与距中央核(centralcore)的距离的函数关系的图示。对于每种marker,在特定距离展示出甲基化率(任何数量)的样品前列腺切除术的样品总数除，所述前列腺切除术的样品在中间的恶性核(C,)具有甲,率，在后续的核中没有癌症。图2是多种场效应的图示。标准化的甲基化百分率如下计算用相应的Co核(core)得到的甲,率除特定核得到的甲率，再乘以100。对于在例3中显示甲基化率的样品，其标准化的甲皿百分率作为距Q)的距离的函数被记录，其中包括APC(前排)、RARp2(第二、第三和第四排)和RASSF1A(最后两排)。本发明涉及一种方法，臓方法用于险测雜于原发魁中瘤外部的组织凍理学组织样品(如肿瘤边缘样本)中的突变,苷,列。该情况中的突变，^Markere序列的超甲基化。Bff^MarkereJ^f应其甲基化状态与前列I^S的状态相关联的基因的核酸。术语"肿瘤的"是指直接或间接涉剡中瘤，或引趟中瘤。术语"肿瘤纖"指的是位于可辨认的肿瘤的周围的组织。砂卜禾#术切除实体肿瘤的情况中，肿瘤纖是与可辨认的肿瘤一起被切离的组织，赃裸眼下通常看棘是正常的。更具体而言，"边缘"指的是肿瘤的雌、边界或分界。^ii^通常iWg发性肿瘤外延约lmm至约4mm，但根据原发实体瘤的大小可以延伸得^。核酸'相应"于雜的基因当縫因的甲基化状^W关前列鹏的信息时，M基因的甲基化状态代表性与前列腺癌的状态相联系，ff^列是该基因的编码部分或其互补体、该基因的，性部分互补体、该基因的启动子或调辦列或其互补体、録该基因存在的序列戯互补体、或该基因的全长序列或其互补体。这样的核酸在本说明书中称为Markers。Marker相应于下列基因HIN(SeqIDNo.58)、RASSF1A(SeqIDNo.69)、APC(Promoter=SeqIDNo.64，Gene=SeqroNo.65)、RARp2(SeqIDNo.62)。其Wf关注的序列包括可用作分析对照的组^M基因，如beto-肌动蛋白(S叫ID.No.60和61)和PTGS2(Promoter=Seq.ID.No.66，gene=Seq,ID.No.67)。GSTPl(Seq.ID.No.59)皿关注的基因。检测超甲基化的试验包蹄如MSP和限制性内切核酸酶分析難术。启动子区域是用于检测这样的超甲基化分析的特别值得注意的目标。本发明包括测定受试者的组织或其他生物学样品中的Markers的特定区域的甲基化状态，其中，与前列腺癌相关的DNA,增和检测。因为Marker相对应的(即，更少被转录)基因编码的蛋白的水平缩^31常是由定区域如启动子的超甲基化所致，所以希望判断皿区域是否被超甲基化。超甲基化区域是与正常组织相比在疾病组织(或被影响以致反映,预后的组织)的样品中被甲基化到统计学显l^更高的区域。iJJlMarkei^在肿瘤的,样品中检测到的超甲基化^在原发倒巾瘤的外面产生了肿瘤或可能的肿瘤。其也可以表示侵袭性更强的癌，以及可會^k^事实上的转移，更高的癌。因此，其标明哪些患者需要更为积极的治疗，哪些患者可以保守的治疗，例如采用观察等待。基于Marker序列的特定部分的S^核苷酸弓嫩对Miii^诸如PCR等S^扩增DNA特别有用。本发明的一些引物媒针或报道试剂用于检测Marker基因的表，制序列的甲m。这些是调节核,列的转录的核列，并在一些情况中调节核^m列的翻译。因此，表继制序列可以包括与启动子、增强子、转录终止子、起始密码子(即ATG)、内含子的剪離号、维持正确的读码框以许可mRNA恰当翻译和终止密码子有关的序列。本发明的一种方^括使包含Marker的耙细jWl与核酸结合的试剂,。0i^耙细胞组分是核酸，例如DNA^RNA。B^f^试剂可以包括探针和引物，例如PCR^MSP引物，或其鹏设置以扩增并检测目标序列的好。例如，臓试剂可以包括化合或键合至其自身的报道基因节段的启动序列(primings叫uences)，例如在Whitcombe等的美国专利6，326,145和6,270，967中描述的，称为Scorpion试剂或Scorpion报道基因的那些启动序列(&tbMJi引用的方式而全部引入)。尽管它们并不相同，但术语"引称，和"启动序列"在本说明书中可用于指启动核,列的扩增的分子或M部分。检测甲基化样品的一个灵敏的方法包括^使用甲基化敏感的,聚合酶敏反应(PCR)。在舰酶消ttJ)NA后，只有当DINA^被甲靴阻止时才通过切限制性酶切位点侧翼的弓嫩鄉行PCR扩增。本发明的方法还可以包括使含有核酸的样^修饰非甲基化的胞嘧啶的试剂;舰CpG特异的驗苷酸引物扩增样品中包饥pG的核酸；以及险测甲靴的核酸。雌的{射布是把非甲靴的胞嘧啶转换成另一个核苷酸，从而将非甲基化的胞嘧啶与甲基化的胞嘧啶区分开来。地，所述试剂^M硫酸氢钠，将非甲基化的胞嘧啶《,为尿嘧啶，然而，也可以舰其他的飾非甲基化的胞嘧啶而不是甲基ttJ胞嘧啶的试剂。最tt^3E硫自钠(NaHSQj)^t布，其易于与胞嘧啶的5，6-双,生m但与甲皿胞嘧啶的反应较差。胞嘧啶与亚硫t酸氢盐离子鹏以形舰脱氨基作用敏感的磺化胞嘧啶反应中间体，从而产生磺化尿嘧啶。磺酸盐(酯)基团可以在碱性斜牛除去，结果形皿嘧啶。尿嘧啶ffiaTaq聚合酶被识别为胸腺嘧啶，因雌行PCR时，最终产品仅在初始模板中出现5-甲基胞嘧啶的位置处包含胞嘧啶。按此方式进行处理，Scorpion报道基因和试剂以及其他的检测系统类^itk将经f,的样本与未经飾的样本区分开来。本发明中用于扩增样本中包含CpG的核酸的引被f,(例如舰亚硫體盐)后，倉,明确区分未处理的DNA、甲基化的DNA和非甲基化的DNA。在甲基化特异的PCR(MSPCR)中，用于非甲基ftoNA的引物鹏动序列ttit在3'CG对具前，从而将其与甲基化的DNA中保留的C相区别，互补微设计为反义引物。用于非甲^^JDNA的MSP引物^动序列(primingsequence)通m^ff列中包含相对很少的Cs或Gs，因为C魂TOiOC引物中缺失，而Gs在反向弓嫩中缺失(C被1ii布为U(尿嘧啶)，雜扩增产物中被扩增为T(胸腺嘧啶核邻。本发明的弓l物是具有足够长度和适当序列的鎌苷酸，从而1在多态性基因座(polymorphiclocus)的对于大量核酸的特异的聚合启动。当暴露于适当的探對-或报道基因时，被扩增的序列显示出甲皿状态，由皿示诊断信息。的弓l物由八个或更多个能够弓l发引物延伸产物合成的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,，其基本上与多态性基因座^S补。有助于合成的环境斜牛包括三磷酸核苷和聚合用试剂,例如DNA聚，的，，以皿当的&S和pH。所述弓1物的启动部分或启动序列是为具有最大扩增效率而单链化，不过也可以^X链的。如果为35(链，则皿引用恪延伸产物前首先被处理以分离其链。所述引物必须足够长以在，聚合用诱导试剂时启动延伸产物的合成。弓I物的精确长度取决TO如MS、缓冲剂和核苷離成等因素。寡核苷酸弓l物最tt^包含约1220个核苷酸，尽能们可以包含更多或更少的蹄酸优选按照公知的设计方针或规则。引物经设计以基本互补于将被扩增的基因组基因座的^^，并包，上所述的适当的G或C核苷酸。这意J^0M引物必须充分互补从而在允iWffl聚合用试剂的斜牛下与赂自的麟交。换言之，臓引物应当充分互补去5'和3'侧翼序列(s)，以进行杂交和容iW因组基因座扩增。引物用于扩增工艺。也就是说，相对^括的反应步骤的数目来说反应(优选,式反应)产生更大的,因座。在最优的实皿式中,^M^z按指数规律产生更媳的鹏因座。^S样的反应包括PCR鹏。通常，一个弓嫩互补于基因座的负(-)链，而另一个互补于正(+)链。核,性使引物退火然后ffiffl齢铷DNA聚合敏(Klenow)的;Ut段和核苷^a行扩增，结果得到新合成的包含+链和-链的,因座序列。赋反应的产物是不纖的核酸双链体，其末端>^应于^的1#异引物的0所述引物可以舰i顿樹可适当的方法制备,例如包括自动化方法的常规的磷酸三酯和磷酸二酯法。在一个这样的自动化的实施方式中，二乙基亚磷单体用作起始材料，并可以使用Beaucage等描述的方法合成(TetrahedronLetter^22:1859-1862，1981)。美国专利号4，458,066中描述了用于體像饰的载体上合成鎌苷酸的方法。樹可由夕卜科ii^样品获得的核酸样本(以纯磁非纯化的形式)均可用作本发明的起始核酸，只要其包含，離想其包含具有IGS因座(例如CpG)的特定的核,列。因此，所述;^法可以使用例如，DNA^RNA，包括信ffiRNA。^DNA或RNA可以是单链的，也可以是双链的。^NA用f^fe的^f牛中，可以使用将模^it转录为DNA的最佳的柳减餅。另外，可以舰DNA-RNA杂交体，其中包含各一。还可以OT核酸的混^吻，或者也可以OT皿利用相同或不同的引物在本文中前述的扩增反应中生产的核酸。将被扩增的特定的核,列，即IGS因座，可能是更大分子的1分，或在开始时显现为不连续的分子从而使特定序列构成全部核酸。包含核酸的样本可利用各种技术提取，例如由Maniatis等描述的技7^(MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,N.Y.,第280页，281页，1982)。如m取的样品不纯，贝陀可以在扩增之前舰一定量的试剂进行处理，所述试剂f,效地打开样品的细胞、液体、组t喊动物细鹏，并會滩暴露和/或分离核酸的链。用于暴露并分离链的该溶胞和核酸变性步骤将允wr增更容易舰行。样品的耙核,列包含两错时，其用f锁fe^前必须分离核酸的链。链分离可以作为的步骤鄉，也可以与弓嫩延伸/^的合成同时进行。这样的链分离可以515iOT各种适当的，条件，包理的、化学的或酶的方法完成。一种分离核,的物理方^a括加热核MM其变性。典型的热变性包括在纟ij8or105匸的温度范围内加热不少于io分钟。链的分离也可以aai来自被称作解螺旋酶的麟的酶或SlRecA诱导，臓敏ecA具有解螺旋酶活性，并在存在riboATP时己知倉^KDNA变性。适于iliiiM解螺旋酶分离核,的反应^f牛由KuhnHoffmann-BerIing描述(CSH-QuaiititativeBiology,43:63,1978)。在C.Radding中对舰RecA的技术进行了评敏Ann.Rev.Genetics^16:405-437，1982)。这^^术的细节现在也是M周知的。当核酸的互补微分离时，不管核m^来是单链还^x链，分离的链将可以用作合成其他核,的模板。该合允许引物杂交到模板的条件下进行。合繊常发生在水性缓M液中，^ilkpH働7-9，最^8。具有多余摩尔量(对于基因核酸，通常为引物:微约108:1)的两种寡核苷酸引tftt^被添加到包含分离的微链的缓冲液中。如果本发明的方法用于诊断应用，则互补链的量可以不知道，因此相对于互补链的量的引物的量不一定能准确地确定。然而，当将被扩增的序列包含在复杂的长链核,的混^tl中时，引物的实际添加SM常与互补链(模板)的M相比过量(摩尔量)。33较多的摩尔量以改善^^方法的效率。将足够量的脱氧核糖核苷三磷酸dATP、dC!P、dGTP和dTTPWK与引物一起添加至合成混^t/，所,液加热到大约9(rcioox:最多io5Ht,皿l到4，。在该加热阶段后，使溶涨冷却至室温，就于弓嫩杂交^m的。向冷却的混合物中加入用于产生引物延伸产物的适宜试剂("聚合用试靴')，并使反1^在本领域公知的^#下发生。聚合用试剂也可以与其他试剂一同加入，只要聚合用试剂具有热稳定性即可。该合成(或扩增)反应可以在室^M聚合用试剂不再起作用的M下进行。聚合用试剂可以是ffi可倉綑于完成弓l物延伸产物的合成的化激縣统，优选酶。用于该目的的适宜的,括，例如，E.coilDNA聚合胸、E.coUDNA聚合酶l的克列诺片段、T4DNA聚合酶、其他的可利用的DNA聚合酶、聚，突变体、反转录酶、和其他酶，包括热稳定的酶(例如，经受充，高直至导致变性的aSig进行引物延伸的那些酶)。tt^试剂是Taq聚合酶。适宜的SI^通舰当的方式促进核苷酸的结合，从而形成与絲因座核^te:补的引物延伸产物。通常，合^lt在各弓嫩W3'端开始，并沿^l^被5'方向进行，；SS合成结束，以得到不同长度的好。然而，也可以舰这样的聚合用试抓利用与，方法相同的方法，合5'端开始，并沿另一个方向进行。最tt^，扩增方法利用PCR。也可以OT替代性的扩增方法，只要使用本发明的引物、ffliiPCR扩增的甲基化和非甲基化的基因座倉嫩fflil^^f戈性手段被相iiT增即可。扩增产物使用产物特异性的探针或报道基因被tt^鉴别为甲基化或非甲基化，如授予MulHs等的美国专利4，683,195所描述的，此^iM弓照而鄉引入。用于检测多核苷酸的探针和报道基因的领域的进展为本领域的技术人员所熟知。可选地，核酸的甲皿模式可以ilii其他技术确认，例如限制性内切酶酶解和DNA印迹分析。可用于险测5'CpG甲皿的甲皿敏感的限制性核酸内切酶的例賴撤mal、SacII、Eagl、Mspl、HpaII、BstUI和BssHlI。在本发明的另一个方面中，^顿甲靴率(methylationratio)。i!5i确定所得到的Marker的扩增的甲基化种类的数量与扩增的参考标记物或扩增的非甲^Marker区域的f[fi之间的比例可以得到甲基化率。当PCR是实时定iPCR时其m乓最多信息。比率^3i确定的或预定的临皿(cutoffvalue)或阈值时被认为是超甲基化的，并且与没有趣过临界值的比率相比其指示更差的复发预后。临im按照已知的方、法确定，其中所^^方法用于至少两组样品具有已知的所关注的条件的样品(复发或侵袭性)和具有己知的正常割牛的样品。本发明的参考标记物还可以用作内部对照。所^#考^^物,是在样品细胞中以^M皿的基因，如Beta肌动蛋白。已确定的或预定的数值(临界值或阈值)也可以在不使用比率的本发明的方法中被确定并使用。在这种情况下，临界值由相对于某^值，例如正常样品或临床无意义的肿瘤样品(已知不会发展为临床相应的状态或是非錢性的)中的甲基化的数量或程度的甲基化的数量或程度来建立。这些临界值按照公知的方法建立，正如其，于基于甲皿率方法中的情况一样。本发明的方法和试剂盒可包括用于多路复用(multiplexing)的步骤和试剂。也就是说，一个以上的Marker可以同HtM测定。有趣的是，GSTP1，对于肿瘤评定来说可能是最有用的Marker，却微现不能用作用于本发明的目的的外科手术皿feiB物。也就是说，甚至在具有侵袭性或转鹏的患者的肿瘤雌样品中也没有发现该+疏物。在各鄉例中提及的GSTP1弓l物和探针如下SEQIDNO,19(GSTP1蝎(SCORPION):CGCACGGCGAACTCCCGCCGACGTGCGBHQ-HEG-TGTAGCGGTCGTCGGGGTTGSEQIDNO.20(GSTP1蝎反义引物):GCCCCAATACTAAATCACGACG据发现可用于本发明的方法和试剂盒中的示例性的Marker^APC、RARp2^ASSF1A。可用于检测这些区域的甲靴的探针在这样的诊断或预测方法中也是有用的。用于检测Markere的tti^分子如下^f^。Marke遂因的简称连同舰的检测系统的鄉写显示在括号中。反向仅指引物的方向，臓引物经指定而相关于与其f^的，的另一成员的启动序列。不必相对于基因MDNA反义。SEQDNO.30(RASSF1A蝎)GCCGCGGTTTCGTTCGGTTCGCGGC-BHQ-HEG-CCCGTACTTCGCTAACTTTAAACGSEQIDNO.31(RASSF1A蝎反义引物)GCGTTGAAGTCGGGGTTCSEQIDNO.32(RA腦蝎)CGGCGCCCGACGATACCCAAAGCGCCG-BHQ-HEG-AACGCGAGCGATTCGAGTAGSEQIDNO.33(RARB2蝎反义引物)CTTACAAAAAACCTTCCGAATACGSEQIDNO.34(APC蝎.)GCCGGCGGGTTTTCGACGGGCCGGC-BHQ-HEG'-CGAACCAAAACGCTCCCCASEQ13)NO.35(APC蝎反义引物)GTCGGTTACGTGCGTTTATATTTAGSEQIDNO.36(肌动蛋白蝎)GCGCCCAACCGCACAAGGGCGC-BHQ-HEG-GGGTATATTTTCGAGGGGTACGSEQIDNO.37(肌动蛋白蝎反义引物)CGACCCGCACTCCGCAATSEQIDNO.38(fL动蛋白蝎)SEQIDNO.39(肌动蛋白蝎反义引物)AACACACAATAACAAACACAAATTCACSEQIDNO.40(肌动蛋白蝎)CCCGGCTAAACCCACCATCCAGCCGGG-BHQ-HEG-GGGAGGGTAGTTTAGTTG'TGGTTSEQIDNO.41(肌动蛋白蝎反义引物)CAAAACAAAAAAACTAAATCTACACAACCSEQIDN0.42(肌动蛋白蝎')CCGCGGAACATTCAACTCAACCGCGG-BHQ-HEG-GGAGGAGGAAGGTAGGmTTSEQIDNO.43(肌动蛋白蝎反义引物)ACATACAACAATCAATAACATAAAACCACSEQIDNO.54(HIN曙l蝎')CGGCGCCCGAACCTCGAAAGCGCCG-BHQ-HEG-GGTTTTAGCGTTTGTTAAGAGSEQl:DNO.55(HIN-1竭反义引物)AACTTCCTACT八CGACCGAC■BHQ=BlackHoleQuencher(BioSearchTechnologies,SanFransisco,CA)HEG-六乙二醇(Hexaethyleneglycol)在本发明的一个雌^"式中，J^VIarkere和方法与组织信息学齢使用。当两者结合时，组织学的假阴性率略有下降。也就是说，当组织学与本发明的方法和Markere指出患者具W^M的预后或侵袭性的赫时，则情况如此的概率非常高。当仅有组织学未指出患者可能经历疾病的复发、转移或侵袭,展时，Markers的超甲基化的阳鹏果则il^a织学的结果是不M的。本发明的试剂盒可以Kg有各种构^件，只要它们都^^含至少一个引物或探针或检测分刊例如Scorpion报道基因)即可。在一个^式中，臓试剂盒包括用于扩增和检魏甲^fcMarker片段的试剂。可舰，^M试剂盒包括样品制备试剂和/皿样品中提取核酸的制品(例如，管)。在雌的试剂盒中，包括单管(one^tube)MSP所必需的试剂，例如，相应的PCR引物组、热稳定的DNA聚合酶(如Taq聚合酶)和适当的1t领!H^剂，如水解探针或分子信标(molecularbeacon)。在可选的^i^试剂盒中，检测试剂是Scorpion报道基因或试剂。还可以舰对双敬NA特异的顿的她引物或荧光染料，如溴化乙锭。引物雌是能产生高浓度的量。试剂盒中的其他材料可包括适宜的aSZ管或瓶、隔离成分，通常为,(waxbead)，可选的包括镁；必需的缓冲液和试剂如dNTP;对照核酸和/或ft^J用于MSP反应的另外的缓冲剂、化合物、辅因子、离子组分、蛋白质和酶、聚，等。可选地，臓试剂盒包括核酸提取试剂和材料。在本发明最雌的试剂盒中，还包娜明书，臓说明书规定测定衫卜科手术ii^样品，行，并指出相对于肿瘤核心最适合获得,样品的位置。在本发明的另一賴剂盒中，臓说明书规定进行测定的外禾样术纖样品是组织病理学显示正常的样品。说明书还指出应当对甲基化阳性结^^t，别的治疗，，例如积极的或延长的治疗。在本发明的测定中OT的材料理想ife^f^备试剂盒。,的试剂盒可以包括载体工具，所述载体工具被分隔以密闭地容纳一个或多个容器，例如小瓶、管等，#^容1^括一个将^^法中]1的隔离元件。例如，^^鄉中的一个可包含杂魏针，0针被丰祝或可以被可检测地标记。第二容器可以包含细胞溶解缓冲液。试剂盒还可具有容纳用于扩增耙核酸序列的核苷酸的容器和/或包含与^I基因分子(如酶、荧光^1"性核素丰示记)结合的报道工具，例如生物素结合蛋白(如抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素)的^^器。鄉例各实施例描述了使用来自37例前列腺切除术的样品对48个损伤的研究和分析。离皿组织样品也由此产生，各样品均从核心向外延伸，并按线性排列以相距大约一，分离。第一个核心活检样品被证实对于癌为组织学阳性。随后的,织检査SBII—个为l4mm，被证实为组织学阴性。测^Markers的甲基化率以说明场效应的大小和空间依赖。^jl例l(样品采集)离,检核心取自回顾性收集的根治性前列腺切除术组织的石蜡块，Bffm织沬自于^￡5年内接^±手术的患者。微的核心活检样品(corebiopsy)取自癌损伤的中央，34个离條心由从中鹏损伤增加1mm的距离处的看起来为正常的前列腺Pf逝的组织收集。将直径1.5111加、厚3-4mm的各活检核心水平地再次包埋在石蜡块中。切出切片(5xl0ji)用于甲基化分析，对各核心制备支，&E玻片并謝fM织学评价。例2:样品制备、DNA分离和亚硫maikf,。为提I50)NA，将来自各核心块的50n组织(5xl0n切片)在二甲苯中脱石斷10^m),随后舰100'K乙^fe涤2次(每次5，)。乙麟涤后，将體在50-55。C的炉中培辨敞口)以蒸发倒可残留的乙醇。脱去石蜡的组织在以500rpm摇动的加热块中在56。C的40nl的提取缓冲液(10mMTris^pH8.0;150mMNaCI,2mMEDTA和0.5"/。SDS)和IOnl蛋白酶K(Qiagen)中培养。次日早晨将样品在7(TC下加热失活10分沖，并在16000xg下旋转5分钟。使50nl的组织溶胞物(或500ng整体甲基似非甲基化基因组对照DNA)进行DNA的亚硫酸氢钠修饰，使用EZDNA甲M:试剂盒(ZymoResearch)按照制造者的^t行下列培养时间和温度的修饰。将样品在以UOOrpm摇动的加热块中在70"下培养3小时。妇5^1M^缓冲液中对频硫MMb理的DNA进行最后的洗脱。样品在-80t:储存。修饰的DNA用作定量甲基化特异的PCR的模板。鄉例3:甲靴特异的PCR(MSP)So)rpion探针和引物经设计以扩增所关注的基因的启动子区域中的甲基化的CpG岛。选择甲^无关区域以用家(housekeeping)基因P-肌动蛋白的扩增。舰DNAmfoWgj^模拟Scorpion微折叠(probefolding)和扩增子探测。Scorpion探针和引物由ScandinavianGeneSynthesisAB获，针在5'位置^独特的荧光染料(FAM、Cy5、Cy3和TexasRed)进行fei3。通过使用甲基化特异的引物对来自亚硫酸氢盐转换的细胞系DNA(MCF-7、LNCaP和HCT-116)的針基因的所关注的启动子序列进行扩增来校准控制縫因。扩增的PCR,在,之后舰标准鹏在TOPOTA克ltM:剂盒(Invitrogeii)中克隆，并转4fcA;^M杆菌。质御NA被分离、线性化并以2xl07拷贝/5^1的储#度(stockdilution)在-80。C储存。对于所有的PCR反应，购自Oiemicon的整体甲基化和非甲基化的基因组DNA(CpG-M和CpG-U)分别用作阳1W照和阴',照。鹏martCyclerII(Cephdd，SunnyvaleCA)进行荧光多重定量MSP测定，其能够aa^ffi每种基因独特标记的特异探针而同时检测一个^^虫样品内的4个目标(使用4个荧光通道)。对两管中的各样品和对照DNA进行4基因(GSTP1、APC、RARB2、Beta-肌动蛋白)和2基因(RASSF1A、Beta-肌动蛋白)多^MSP。所淑CR反应混^S含500nM的用于皿因的每"^引物和探针、与快速启新aq聚^SI(Roche)偶联的5U抗体、1.25mM的缓冲混，(67.0mMTris，pH8.8、6.7mMMgCl2、16.6mM(NH02SO4、lOmM-巯基乙斷中的dATP、dCTP、dGTP和dTTP中的每一个、以及5fil的在最终^R25jU中的亚硫,謝,的DNA^。热循环^f牛如下赵5。Cl，，随皿fi^5。C持续30秒和59"持续30秒的循环40次，并在72。C延伸5分钟。为了形成^h基因的拷贝数(copy加mber)标准曲线，M31在管中等^^混^^用于旨基因的校准储液(2xl()7拷贝/5Ml)以鹏!)备校准混，。S/K中对该混^tl进行10倍连,释(2xl()62xl02)，并在J^PCR員中复制。用于4个基因中的每一个的Cts(循环阈值)被换算为各样品中的甲基化基因的拷贝数。齡样品的数据以甲基化率([基因的甲基化拷贝^/p-肌动蛋白的拷贝数lxl000)表示。分别形^f于4基因和2基因多路复用的标准曲线。通过用中央的恶性核心的甲基化率除各距离处的甲基化率来计#^准甲基化％。用于这些多路飾的Markeis相应于下列基因Multiplex1:GSTP1(Seq.ID.No59)，B-肌动蛋白(S叫ID,No.60/61),APC(Seq，ID，No，64/65)，RA邓2(Seq.瓜No.62)Mutliplex2:RASSF1A(Seq.ID.No,69)，B-肌动蛋白(Seq.ID.No.60/61)Multiplex3:Hin-1(Seq.ID.No.58)，B-肌动蛋白(Seq.ID.No.60/61)用于BfM测试的引物和探针GSTP1:探针Seq.IDNo.19;引物Seq.IDNo.20页B-肌动蛋白探针Seq.IDNo.38;引物Seq.IDNo.39APC:探针Seq.IDNo.34;引物Seq.IDNo.35KASSF1A:探针Seq.IDNo.30;引物Seq.IDNo.31Hin-h探针Seq.IDNo.54;引物Seq.IDNo.55下面的表1显示出用5个基因中的每一个在远端核心中观察到的场鹏。M显示为皿因的甲基化率。结合核心与周围区域的精确的组织病理学以限定用于场效应的样品，OT下述标准证鄉伤是否^"场鹏"l.癌损伤(CO)具有对于基因的阳性甲基化率。2.鄉辐射状的核心(C1-C4)和周围的组织不具有癌症或高等敬IN的组织学证据。表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>从以上,可知，对于MarkersAPC、RAR卩2、和RASSF1A和HIN-1可以观察到场效应。顿离恶性核心2mm，且在大多数瞎况下距离杨。、最多3mm处可以观察到场效应。通3i^测甲皿的Marker产生的信号的强Sa常作为样品距核心的距离的函数而改变，但不呈线性方式(图1和2)。这可能是由于癌割牛，多个病灶所致。令人惊i她是，对TCSTP1没有观察到场效应。序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><400〉1ccccgaacgtcgaccgctcggggcgatttcggggat.tttagggcgt46<210>2<211〉21<212〉DNA<213>人工<220〉<223〉GSTP1蝎子反义引物<400>2aaaatcccgcgaactcccgcc21<210〉3<211>46<212>DNA<213〉人工<220><223>GSTP1蝎子<220><221〉modified—base<222>(23)..(23)<223>-BHQ-HEG-<400>3cccgaacgtcgaccgctttcgggcgatttcggggattttagggcgt46<210〉4《211〉21<212>腿<213>人工〈220〉<223>GSTP1蝎子反义引物<400〉4aaaatcccgcgaactcccgcc21<210>5<211>44<212>DNA<213>人工<220><223>GSTP1蝎子<220><221>modified—base<222〉(22)..(22)<223>-BHQ-HEG-<400>5cggcgggagttcgcgggcgccgactaaatcacgacgccgaccgc44<210>6<211〉22<212>DNA<213〉人工<220><223〉GSTP1蝎子反义引物<400〉6cggtt.agttgcgcggcgatttc22<210〉7<211>41<212>腿<213>人工<220><223>GSTP1蝎子<220><221>modified—base<222>(19)..(19)<223〉-BHQ-HEG-<220><221>modified—base<222>(25)..(25)<223>-BHQ-HEG-<400>7cgggagttcgcgggtcccgactaaatcacgacgccgaccgc41<210>8<211>22<212>DNA<213>人工<220〉<223〉GSTP1蝎子反义引物<400>8cggttagttgcgcggcgatttc22<210〉9<211>50<212>DNA<213>人工〈220〉<223〉GSTP1蝎子<220><221>modified—base<222〉(27)..(27)<223〉-BHQ-HEG-<400>9gtggttgatgtttggggtatcaaccacaat.cccacaaactcccaccaacc50<210〉10<211>27<212>DNA<213〉人工<220><223〉GSTP1蝎子反义引物<400〉10gtggtgattttggggattttagggtgt27<210>11<211>47<212〉DNA<213>人工<220〉<223>GSTP1蝎子<220〉<221〉modifiedbase<222>(24)..(24)<223〉-BHQ-HEG-<400〉11accccagtggttgatgtttggggtaatcccacaaactcccaccaacc47<210〉12<211>27<212>DNA<213>人工<220〉<223>GSTP1蝎子<400>12gtggtgatt,ttggggattttagggtgt27<210〉13<211>56<212>腿<213〉人工<220><223>GSTP1蝎子<220〉<221>modified—base<222>(28)..(28)<223>-BHQ-HEG-<400>13ccccacaggttggtgggagtttgtggggcccaatactaaatcacaacaccaaccac56<210>14<211>27<212>腿〈213>人工<220><223〉GSTP1蝎子反义引物<400〉14tggttagttgtgtggtgattttgggga2了<210>15<211>46<212>DNA<213>人工<220〉<223>GSTP1蝎子<220><221>modified—base<222>(23)..(23)<223>-BHQ-HEG-<400>15ccccgaacgtcgaccgctcggggcgatttcggggattttagggcgt46<210>16<211>21<212>DNA<213〉人工<220〉〈223〉GSTP1蝎子反义引物〈400〉16aaaatcccgcgaactcccgcc21<210>17<211>53<212〉DNA<213>人工<220><223〉GSTP1蝎子<220><221>modified—base<222>(30)..(30)<223>-BHQ-HEG-<400〉17cgcacgccgaacgtcgaccgcaaacgtgcgcgatttcggggattttagggcgt53<210〉18<211〉21<212〉DNA<213>人工<220><223>GSTP1蝎子反义引物<400〉18aaaatcccgcgaactcccgcc21<210>19<211>47<212〉DNA<213〉人工<220><223〉GSTP1蝎子<220〉<221>modified_base<222>(27)..(27)<223>-BHQ-HEG-<400>19cgcacggcgaactcccgccgacgtgcgtgtagcggtcgtcggggttg47<210>20<211>22<212>腿<213>人工<220〉<223〉GSTP1蝎子反义引物<400>20gccccaatactaaatcacgacg22<210>21<211>55<212>DNA<213>人工<220><223〉GSTP1蝎子<220〉<221>modified—base〈222〉(35)..(35)<223>-BHQ—HEG—<400〉21ccgacgcacaaaaaaacaccctaaaatccgtcggggttagttgtgtggtgatttt55<210>22<211>20<212〉薩<213>人工<220><223>GSTP1蝎子反义引物<400>22cacaacaccaaccactcttc20<210>23<211>29〈212〉DNA<213>人工<220〉<223〉GSTPlTaqman引物<400>23cgtgatttagtattggggcggagcggggc29<210>24<211>25<212>DNA〈213〉人工<220><223〉GSTPlTaqman引物<400〉24atccccgaaaaacgaaccgcgcgta25<210>25<211>26<212>DNA<213〉人工<220〉<223〉GSTPlTaqman探针<400>25tcggaggtcgcgaggttttcgttgga26<210>26<211>48<212〉DNA<213>人工<220><221>misc_feature<223〉GSTP1蝎子<220〉<221>inodified_base<222〉(27)..(27)<223>-BHQ-HEG-<400>26cggccctaaaaccgctacgagggccggaagcgggtgtgtaagtttcgg48<210>27<211>26<212〉DNA<213>人工<220><221>misc—feature<223>GSTP1蝎子反义引物<400>27acgaaatatacgcaacgaactaacgc26<210>28<211〉44<212〉DNA<213〉人工<220〉<223〉GSTP1蝎子<220><221〉misc—feature<223〉GSTPI蝎子<220><221〉modified—base<222>(24)..(24)<223>-BHQ-HEG-<400>28ccggtcgcgaggttttcgaccggccgaaaaacgaaccgcgcgta44<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agagatcactgaaatcgggctgcaaggggcccaggaccgagggtttcctgtctcttta1560caggctcgggaccaggtttgccacttt.gtcaccatgtgtatctt.cacctgcaccggccaa1620cacgcctctgtgcacctgggccagctggactggtactcttgggtgcctaatgcaccctgc1680acgatgcggctgcccccgccaaccaccaaggatgcaacgctggagacagtgatggcgaca1740ctgcccaacttccaccaggcttctctccagatgtccatcacttggcagctgggcagacgc1800cagcccgttatggtggctgtgggccagcatgaggaggagtatttttcgggccct,gagcct1860aaggctgtgctgaagaagtt,cagggaggagctggctgccctggataaggaaat.tgagatc1920cggaatgcaaagctggacatgccctacgagtacctgcggcccagcgtggt,ggaaaacagt1980gtggccatctaagcgtcgccaccctttggtt.atttcagcccccatcacccaagccacaag2040ctgacccctt.cgtggttatagccctgccct,cccaagtcccaccctcttcccatgtcccac2100cctccctagaggggcaccttttcatggtctctgcacccagtgaacacattttactctaga2160ggcatcacctgggaccttactcctctttccttccttcctcctttcctatcttccttcctc2220tctctcttcctctttcttcattcagatctatatggcaaatagccacaattatataaatca2280tttcaagactagaatagggggatataatacatattactccacacct.tttatgaatcaaat2340atgatttttttgttgttgttaagacagagtctcactttgacacccaggctggagtgcagt2400ggtgccatcaccacggctcactgcagcctcagcgtcctgggctcaaatgatcctcccacc2460t,cagcctcctgagtagctgggactacaggctcatgccatcatgcccagctaatatttttt2520t.attttcgtggagacggggcctcact,atgttgcctaggctggaaataggattttgaaccc2580aaattgagtttaacaataataaaaagttgttttacgctaaagatggaaaagaactaggac2640tgaactattttaaataaaatattggcaaaag2671〈210〉57〈211〉1193〈212〉腿〈213〉人类<220〉<221〉miscfeature<223〉CDH1〉giI5096041gb|L34545.11HUMECADN人E-f丐粘蛋白基因，5,i山'顺启动子区域和<400〉57tctagaaaaattttttaaaaaattaggccgctcgagcgagagtgcagt.ggctcacgcctg60t.aatccaacacttcaggaggctga.agagggtggatcacctgaggtcaggagtt.ccagacc120agcctggccaacatggtgaaa.ccccgt.ctt.gtactaaaaatacaaaat.tagccggtgtgg180tggcacacgcctgtagtcccagctactcaataggctgagacaggagagtctcttgaaccc240ggcaggcggaggttgcagtgagccgagatcgtgccactgcactccagcctgggcaagaca300gagcgagactccgtctcaaaaaatacaaacaaaacaaacaaacaaaaaattaggctgcta360gctcagtggctcatggctcacacctgaaatcctagcactttgggaggccaaggcaggagg420atcgcttcagcccaggagttcgagaccaggctgggcaatacagggagacacagcgccccc480actgcccctgtccgccccgacttgtctctctacaaaaaggcaaaagaaaaaaaaaattag540cctggcgtggtggtgtgcacctgtactcccagctactagagaggctggggccagaggacc600gcttgagcccaggagtt'cgaggctgcagtgagctgtgatcgcaccactgcactccagctt660gggtgaaagagtgagccccatctccaaaacgaacaaacaaaaaatcccaaaaaacaaaag720aactcagccaagtgtaaaagccctttctgatcccaggtcttagtgagccaccggcggggc780tgggat,tcgaacccagtggaatcagaaccgtgcaggtcccataacccacctagaccctag840caactccaggctagagggtcaccgcgtctatgcgaggccgggtgggcgggccgtcagctc900cgccctggggaggggtccgcgctgctgattggctgtggccggcaggtgaaccctcagcca%0atcagcggtacggggggcggtgctccggggctcacctggctgcagccacgcaccccctct1020cagtggcgtcggaactgcaaagcacctgtgagcttgcggaagtcagttcagactccagcc1080cgctccagcccggcccgacccgaccgcacccggcgcctgccctcgctcggcgtccccggc1140cagccatgggcccttggagccgcagcctctcggcgctgctgctgctgctgcag1193〈210〉58<211〉2635〈212〉DNA<213〉人类<220>〈221〉misc—feature<223〉染色体5(另一个名称(SCGB3A1))上的Hin-l区域〈220〉<221>misc—feature<223〉这个基因可以在染色体上的179，949，712-179，951，146位置找到所述基因的起始位置在重叠群AC122714.2.1.190024.〉染色体NCBI35:5:179949112:179951746:-l<400〉58atctgtcatacttctgcaggtgacagacgagtgaggacatttagagaaactcaggaacaa60accaggcccatccactggcgtcgaggctagtttcgaagacagaaaaacgccccacttctg120tttgcactgtggctgcctgtggcccggccggggaggcggccgggagtgaggcctgatcgt180ccctggcgcctccacctccccaggcgcagaaggcgcccacgaggacccccagtgcccgac240gttgccacggtctgggatcagaggcagggaccagggagccaggaactgcgccgcccccgc300ccctgccctggcgcgagggaagctcccctcacccgggcccagccctgcaggggggcgcgt360ggggtcagaccgcaaagcgaaggtgcgggccggggtgggcctcgcggagacaaaggccgg420gcctgcctgctctcagagggccccagcgcct,gccaagaggaagtcctcgaggcccgggca480gggaagggggcacgggcttcccagggcccgccggccgcagcaggaagttggccagggcac540ggccgtgagcggagcgggcagggctttctcaggagcgcgggcgaggccggcgctgg鄉g600gcgaggaccgggtataagaagcctcgtggccttgcccgggcagccgcaggttccccgcgc660gccccgagcccccgcgccat.gaagctcgccgccctcctggggct.ctgcgt.ggccctgtcc720tgcagctccggtgagcgccccgggctcctggcgcgcacggtggggcctgaggcctcggcg780cccgctgcgcccccgccgctgcctgcgccgatcgtggatcccaggtccttccagcctcgc840ccggcgcccagagggctccgccaccccggggccccgcgcctgcagcccgcggcctccccc900tctcagggctgtct.ccagcctcgtgccgggatggaggccgcccctggcctggggacaccc960gtctgccccccgtctggagaccggctcctcatcctgcaaggcgcagcgcgagtgtcccct1020cccttgggggcctgtcccggaccctgcacagagttcaccggtcct,tccgccaccctcagg1080ccactccggtgaccctgcagcgtctcctggcggggccgcctccccagacccgcctgt,gtc1140ccgggggctcgcacctggcaggcctcggcgcaggagggaggggcggtcggggagccgggc1200agggcgcgacggttcctgggcgcctcccgcgggggcgcgtcctggacctgccttctgggg1260accccggcgcgcaggcggtgacccctccctgttcgcttgcagctgctgctttcttagtgg1320gctcggccaagcctgtggcccagcctgtcgctgcgctggagtcggcggcggaggccgggg1380ccgggaccctggccaaccccctcggcaccctcaacccgctgaagctcctgctgagcagcc1440tgggcatccccgtgaaccacctcatagagggctcccagaagtgtgtggctgagctgggtc1500cccaggccgtgggggccgtgaaggccctgaaggccctgctggtaaagtgggca,ccccggg1560tgcccttcctgcgcgggcatcccttcccggcca.gcctcaaaactgcaccagaggtgtccc1620ggccctacgtcagggctgtttcccgtcct,gcccctccaagccctgtccctgggagaagcc1680cgggtctccgggtgggaactgggtggggcgcatccgagctgcaggggcggggaaggcgga1740gatggccccgcgcgggtgcgcgtcccccggagacgccagcggaaccgccccgctcccgct1800ccccacagagccggccgctgccgcgcccccgcct,gagttcttggtggcagggct.gggggc1860actcaagctcggcttctgctttccagggggccctgacagtgtttggctgagccgagactg1920gagcatctacacctgaggacaagacgctgcccacccgcgagggctgaaaaccccgccgcg1980gggaggaccgtccatcccct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actgggccttagtggg1380ccagggctgccctgagaagctgctccaggcctgcagcaggagtggtgcagacagaagtct1440cctcaatttt.tgt'ctcagaagtgaaaatct.tgga,gaccctgcaaacagaacagggtcatg1500t.ttgcaggggtgacggccctca.tctatgaggaaaggt.tttggatcttgaatgtggt.ctca1560ggatat,cctta,tcagagctaagggtgggt.gctcagaataaggcaggcattgaggaagagt1620cttggtttctctctacagtgccaactcctcacacaccctgaggtcagggagtgctggctc1680acagtacagcatgtgccttaatgcttcatatgaggaggatgtccctgggccagggtctgt1740gtgaatgtgggcactggcccaggttcataccttatttgctaatcaaagccagggtctctc1800cctcaggtgttttttatgaagtgcgtgaatgtatgtaatgtgtggtggcctcagctgaat1860gcctcctgtggggaaaggggttggggtgacagtcatcatcagggcctggggcctgagaga1920attggctcaataaagatttcaagatcctca1968权利要求1、一种用于表征患者前列腺癌的方法，所述方法包括取得原发性前列腺肿瘤外部的组织样品，其中，所述样品没有显示出肿瘤病理学的形态特征；在所述样品中确定Marker的存在或数量；以及如果所述Marker的数量或存在超过了预定值，则评定所述癌为侵袭性的。2、如权利要求l臓的方法，其中，如果mMarker的数量蹄在没有超过预定働鹏^M鉴定为温和性的。3、如权利要求l臓的t法，其中，^Marke魂自由APC、RASSF1A、R卿2和fflN-l舰的组。4、一种用行表征前列腺癌的分析的试剂盒，0f^试剂盒包括Marker试剂。5、如权利要求4所述的试剂盒，其中，所^Marker是用于选自由APC、RASSF1A、RARJ32和HTN-1组成的组的基因。6、如权利要求4臓的试剂盒，其中，^^试剂包括由S叫IDNo.34和35组成的组的成员。7、如权利要求6臓的试剂盒，其中PCR启动试齐谨本上由S叫IDNo.34和35构成。8、如权利要求4臓的试剂盒，其中，ff^试布泡括由Seq.IDNo.30和31组成的组的成员。9、如权利要救臓的试剂盒，其中，PCR启动试齐JS本上由Seq.IDNo.30抑1构成。10、如权利要求4臓的试剂盒，其中，ff^试剂包括由S叫K)No.32和33组成的组的成员。11、如权利要求10職的试剂盒，其中，PCR启动试剂基本上由Seq.IDNo.32和33构成。12、如权利要求4臓的试剂盒，其中，0^试剂包括由8叫101\0.54和55组成的组的成员。13、如权利要求12臓的试剂盒，其中，PCR启动试剂基本上由S叫IDNo.54和55构成。14、如权利要求4臓的试剂盒，0f^试剂盒还包括用于扩增和检测组鹏^ii基因之存在的^C剂。15、女嫩利要求im的方法，0M方法还包括确定甲皿率辩I漸是否所述甲基化率^il临界值。16、女trfe利要求i皿的方法，用于治疗监测。17、如权利要求4臓的试剂盒，其中，^Markers基本上由用于RASSF1A和，型^iS因的Markere构成。18、女败利要求17臓的试剂盒，其中，臓^M^ii基因是B-肌动蛋白。19、如权利要求4臓的试剂盒，其中，fft&Markei^本上由用于Hin-l和^M敬基因的Marker构成。全文摘要本发明涉及前列腺癌的场效应分析方法和试剂盒。本发明一方面提供了一种用于表征患者前列腺癌的方法，所述方法包括取得原发性前列腺肿瘤外部的组织样品，其中，所述样品没有显示出肿瘤病理学的形态特征；在所述样品中确定Marker的存在或数量；以及如果所述Marker的数量或存在超过了预定值，则评定所述癌为侵袭性的。本发明另一方面提供了一种用于进行表征前列腺癌的分析的试剂盒，所述试剂盒包括Marker试剂。文档编号C12Q1/68GK101270388SQ20071030615公开日2008年9月24日申请日期2007年10月31日优先权日2006年10月31日发明者A·马祖姆达,J·梅罗特拉,J·瓦戈,K·格雷,S·瓦德申请人:维里德克斯有限责任公司