专利名称：一种抗沙门菌单链抗体与跨膜蛋白融合蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于制备抗沙门菌单链抗体和跨膜蛋白的融合蛋白的方法。本发明还涉 及包含所述融合基因的表达型重组体、包含所述表达型重组体的工程菌、由此工程菌表达和 分离纯化的目的融合蛋白scFvLH-pVIII (和scFvHL-pVIII)以及此融合蛋白用于沙门菌属的 临床检验诊断以及食品卫生诊断。
背景技术：
伤寒沙门菌作为引起食物中毒和肠道腹泻的主要病原菌之一，由其引起的伤寒病己被我 国《传染病防治法》规定列入乙类传染病之一。目前伤寒沙门菌的实验室诊断现仍以检出病 原菌为主要依据，其检测程序包括标本采集接种、分离培养、生化鉴定，血清学分型等多个 环节。最快也要一到二天才能作出最终检验诊断。而近年来报道的一些快速检验诊断方法， 如PCR、 ELISA、免疫荧光球法、SPA法，以及利用基因芯片技术等进行伤寒沙门菌的快速 检测，大多需要数小时才能得到结果，并且对伤寒沙门菌有量的要求，还需配备专门人员， 一定的仪器设备。故非常不适用于现场的快速检验、早期排査和诊断。
聚丁二炔脂质体纳米囊泡(或LB膜)已被证明在外界的轻微揉动下，会发生从蓝色向 红色的色变现象，色变迅速，在2-5分钟内可以完成反应，研究表明色变的程度与外界揉动 程度成正相关。单克隆抗体(单抗)具有高度特异性，可以专一地与特定的抗原结合。将单 克隆抗体应用于临床检验诊断，可以提高诊断的特异性，有效减少假阳性率，有助于提高临 床诊断的准确性。在抗沙门菌的单克隆抗体尾端利用DNA重组技术修饰上跨膜蛋白，人工 添加疏水尾端，可以使其通过疏水相互作用插入到类生物膜聚丁二炔脂质体纳米囊泡(或LB 膜)中，制成沙门菌快速检测传感器，可用于沙门菌的检验检疫及临床诊断。
发明内容
本发明的目的是提供一种与沙门菌属0抗原结合，并能插入类生物膜聚丁二炔纳米囊泡中的scFvHL-pVIII双功能融合蛋白，为提供一种快速检测沙门菌的方法。
本发明还提供了包含scFv-pVIII融和基因重组体的构建，以及含该基因的表达型重组体 的工程菌的发酵培养，更重要的是还提供了重组scFv-pVIII融合蛋白的大规模制备、纯化的 技术路线。本发明的重组scFv-pVIII融合蛋白可在大肠杆菌中发酵生产，通过Ni-琼脂糖凝胶 亲和层析、凝胶过滤层析两步法，可以非常简单，低成本的，快速大规模的得到目的蛋白。 本发明的技术方案可以通过下述方法和步骤实现
1. 抗沙门菌属O抗原单链抗体scFv轻链VL、重链VH以及M13丝状噬菌体主要衣壳蛋白 pVIII的克隆
利用化学合成的方法合成抗沙门菌属O抗原单链抗体的轻链VLcDNA和重链VHcDNA 以及M13丝状噬菌体主要衣壳蛋白的成熟肽编码DNA，并将其分别克隆到pMD18-T载体中， 分别记为pMD 18-T-VL 、 pMD 18-T-VH和pMD 18-T- pVIII 。
2. 构建scFv-pVIII (包括scFvLH-pVin禾卩scFvHL-pVIII)融和基因
通过Swiss-Model同源建模进行scFv的三维结构预测，综合M13丝状噬菌体pVIII蛋白 的X-射线衍射晶体图，在scFv和pVIII加入一段GGGGS连接肽，以使两部分的空间构像不 至于相互影响。设计引物，用一段编码(GGGGS) 3的linker序列，经重叠延伸拼接PCR的 方法将抗体VH、 VL cDNA拼接成5， -VL-Linker-VH-3，片段，艮卩scFv LH，亦可拼接成 5' -VH-Linker-VL-3'片段，即scFvLH。同样用一段编码(GGGGS) 3的linker序列，经重 叠延伸拼接PCR的方法构建scFv- pVin融合基因，并将scFv-pVIII融和基因克隆至pMD18-T 中，构建pFUS-scFv-pVin质粒(记为pFUS)。
3. 构建包含scFv-pVIII融合基因的重组体
分别设计上下游引物扩增scFv-pVIII融合基因，经双酶切回收产物片段后插入到经相同 两个酶酶切的表达载体中。构建包含scFv-pVIII融合基因的重组体经内切酶谱分析和DNA序 列分析证实序列正确，融合基因读码框插入正确，整个基因939bp，编码313个氨基酸。
4. 重组体转化大肠杆菌RosettaTM (DE3)，用L-阿拉伯糖诱导重组scFv-pVIII融合蛋白的表达，融合蛋白在大肠感菌体内以可溶形式表达，表达水平30-40%。经SDS-PAGE、 Western blot 检测证实重组scFv-pVIII融合蛋白的表达，经过直接酶联免疫分析、竞争酶联免疫分析表明 重组scFv-pVIII融合蛋白具有与沙门菌属O抗原的结合能力。经紫外-可见光光度计证实重组 scFv-pVIII融合蛋白具有与聚丁二炔结合的能力。
图1:重组表达质粒pBAD-scFv-pVIII构建示意图。
具体实施方案
以下通过实施例进一步描述本发明，而非限制本发明。
实施例l
scFvLH-pVIII融合基因的克隆及其表达载体的构建
(1) 设计引物VL上游5'-CGCCTCGAGCAAATCGTGGTTACTCAAG-3'引入酶切位点 VL下游5'-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC CTTAGGTTGCCCGAG-3'
"VH上游5'-GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG GAAGTTCAAGTCCAGCAGAG-3' "VH下游a5'-CTTAGCCGACGAGACAGT-3'
下游b5'-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC CTTAGCCGACGAGACAGT-3' pVIII上游5'-GGCGGAGGTGGCTCT GGCGGTGGCGGATCG GCTGAGGGTGACGAT-3' pVIII下游5' -ATGGTACCCTA GCTTGCTTTGCTGGT-3'引入酶切位点。
(2) 分别用VL上下游引物和VH上游引物和VH下游引物a分别扩增pMD-18T-VLcDNA和 pMD-18T-VLcDNA，经琼脂糖电泳确认PCR产物，行切胶回收DNA片段。
(3) 将回收的VL VH PCR扩增产物等摩尔浓度混合，以VL上游引物和VH下游引物a经重叠 延伸拼接PCR方法将VH、 VLcDNA拼接成5' -VL-Linker-VH-3'片段，即scFvLH (fl)， 并将其克隆到pMD-18T载体中。重叠延伸拼接PCR条件为94°C 5分钟；94°C 30秒，52°C 30秒，72°C 30秒，4-5个循环；94°C 30秒，60°C 30秒，72°C 30秒，4-5循环；94°C 30 秒，63°C 30秒，72°C 30秒，20个循环72°C 10分钟，4'C保存。
(4) 用pVIII上下游引物扩增pMD-18T-pVIII质粒，经琼脂糖电泳确认PCR产物，行切胶回收DNA片段。
(5) 用VL上游引物和VH下游引物b扩增pMD-18T- scFvLH，经琼脂糖电泳确认PCR产物， 行切胶回收DNA片段。
(6) 将回收的scFv片段和pVIII片段等摩尔混合，以VL上游引物和pVIII下游引物经重叠延 伸拼接PCR方法将scFv片段和pVIII片段拼接成5， -scFv-Linker- pVIII-3'片段，即scFv LH-pVIII,并将其克隆到pMD-18T载体中。记为pFUS-scFvLH-pVIII。
(7) 用VL上游引物和pVIII下游引物，以pFUS- scFv LH- pVIII为模板，PCR扩增出scFv LH-pVIII全片段，在VL上游引物和pVIII下游引物分别引入了 XhoI和KpnI酶切位点。将胶回收 后的scFv LH-pVIII全片段克隆至pMD-l8 simple,测序验证正确后，以XhoI/Kpnl双酶切， 纯化回收产物片段连接到经相同酶切的pBAD，构建为重组表达载体pBAD- scFv LH- pVIII， 其酶切图谱(见图！)。
实施例2
重组scFv LH- pVIII融合蛋白在大肠杆菌中表达与纯化
将pBAD- scFv LH- pVIII表达质粒转化表达菌株RosettaTM (DE3)，生长于含氨节青霉 素和氯霉素的LB琼脂平板上，37。C生长16小时之后，将平板上所有克隆刮下接种于500ml 含100Pg/ml氨苄青霉素和34Mg/ml氯霉素的LB液体培养基中。37'C剧烈振荡培养至OD600 约为0.5时，用20ML-阿拉伯糖进行诱导表达蛋白。37°C，剧烈振荡培养4小时后收集菌液， 以12 000rpm， 4'C离心，弃上清。得到的沉淀用500 u 1 pH7.4 PBS洗两次后用500u lpH7.4 PBS充分悬浮，将样本置于冰上以400W,超声5s，间隔15s， 30次的条件用超声细胞破碎 仪充分破碎细菌菌体；超声后的菌液处于清亮的状态，12 OOOrpm， 4'C离心后将上清转至新 的EP管标记好，沉淀用100 ix 1 pH7.4 PBS悬浮；将上清液加到一个2mlNi-琼脂糖凝胶亲和 层析柱上，上样前用结合缓冲液预平衡层析柱。用洗脱缓冲液(20mMTris-HCl;pH8.0;500mM NaCl;250mM imidazole;20X甘油)洗脱scFv LH-pVIII融合蛋白。在洗脱后的目的蛋白加入 Enterokinase，使之切割组氨酸标签。酶切产物上样用20mmol/L Tris-HCl (pH8.0，含 150mmol/LNaCl)缓冲液平衡的Sephadex G-75柱，流速0.5mL/min洗脱目的蛋白，分部收集得到有活性的重组scFv LH- pVIII。用Du-800核酸/蛋白分析仪(美国BECKMAN COULTER)
进行蛋白质定量分析。
实施例3
scFv LH-pVIII融合蛋白的SDS-PAGE和Western blot鉴定
在纯化后的蛋白样本中加入5X蛋白上样缓冲液(50mMTris， pH6.8， 200mMDTT， 0.2% 溴酚兰20%甘油，4%SDS)在漩涡混匀器上充分混匀。混合后置于IO(TC沸水浴10min; 12000rpm， 4'C离心后，取上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。目的蛋白质表 达量通过考马斯亮蓝R-250染色后，扫描后用Bandscand软件计算表达量。
Western blot (免疫印迹分析)样品以12%SDS-PAGE进行电泳，然后以380毫安转移 30分钟，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，膜以封闭液(PBS， pH7.5,含5%脱脂奶粉和 0.5%Tween-20)于4。C封闭过夜后，加入以封闭液稀释(1: 1000)的鼠源性抗His-tag单克 隆抗体，于室温温育2h，洗膜后加稀释(1: 1000)的HRP-羊抗鼠IgG于室温温育2h，洗去 二抗后以ECL发光试剂盒进行显色，X光片曝光后进行显影、定影。
实施例4
重组scFv LH- pVIH融合蛋白功能研究
(1) 重组scFv LH- pVIII融合蛋白的免疫反应性将血清型B沙门菌O抗原以1Mg/100W/孔包 被96孔酶标板，以10(^110%脱脂奶粉进行封闭，加入大肠杆菌表达上清液，孵育后洗去， 加入抗M13pVIII的单克隆抗体再次孵育，洗涤后加入HRP-羊抗鼠IgG抗体，以邻苯二氨为 底物进行显色，酶标仪测定490nm处吸光值。结果表明，融合蛋白仍然保留了单抗对沙门菌 O抗原的免疫反应性。
(2) 重组scFvLH-pVin融合蛋白与类生物膜聚丁二炔纳米囊泡的结合能力取3ml类生物膜 聚丁二炔纳米囊泡蓝色溶液，加入重组scFvLH-pVm融合蛋白，利用红外光谱仪、激光拉曼 光谱仪及紫外-可见分光光度仪检测，并做好对照。
权利要求
1、一种抗沙门菌单链抗体与跨膜蛋白融合蛋白的制备方法，其特征在于采用下列步骤1)利用PCR的方法分别扩增单链抗体scFv的轻链VL cDNA和重链VH cDNA以及M13丝状噬菌体主要衣壳蛋白pVIII成熟肽DNA，并采用重叠延伸拼接PCR的方法利用两个连接肽GGGGSGGGGSGGGGS编码基因将三段基因连接成融合基因，包括scFv LH-pVIII融合基因和scFv HL-pVIII融合基因；2)在表达载体中分别克隆scFv LH-pVIII融合基因和scFv HL-pVIII融合基因；3)用重组载体转化大肠杆菌；4)发酵培养工程菌，制备和纯化融合蛋白。
2、 根据权利要求1的方法，其所述的表达载体不限于特定的表达载体，只要它能够与所述的 DNA片段重组，形成适宜的表达载体。
3、 根据权利要求2的方法，其所述的表达载体是原核表达载体pBAD/HisB。
4、 根据权利要求1的方法，其所述的宿主菌不局限于特定的宿主菌，只要它能够表达原核表 达载体。
5、 根据权利要求4的方法，其所述的宿主菌是大肠杆菌Rosetta (ED3)。
6、 根据权利要求l的方法，其所述的纯化融合蛋白是指大肠感菌诱导表达后经Ni-琼脂糖凝 胶亲和层析、凝胶过滤层析两歩法，其特征为将初步纯化的scFvLH-pVIII融合蛋白加到一 个2mlNi-琼脂糖凝胶亲和层析柱上，上样前用结合缓冲液(20mM Tris-HCl;pH8.0;500mM NaCl;10mM imidazole; 20%甘油)预平衡层析柱。用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl;pH8.0;500mM NaCl;250mM imidazole; 20%甘油)洗脱scFv LH-pVIII融合蛋白。在洗脱后的目的蛋白加入 Enterokinase，使之切割组氨酸标签。酶切产物上样用20mmol/L Tris-HCl (pH8.0，含 150mmol/LNaCl)缓冲液平衡的SephadexG-75柱，流速0.5mL/min洗脱目的蛋白，分部收集 得到有活性的重组scFvLH-pVIII。用Du-800核酸/蛋白分析仪(美国BECKMAN COULTER) 进行蛋白质定量分析。
7、 根据权利要求l的方法，其所述的重组scFvLH-pVIII融合蛋白在检测沙门菌的应用，其 特征在于所述的试剂盒可以用于沙门菌感染或污染的诊断，也可以用于沙门菌的微生物学研 究。
全文摘要
本发明涉及一种用于制备抗沙门菌属O抗原单链抗体和跨膜蛋白的融合蛋白的方法。本发明还涉及包含所述融合基因的表达型重组体、包含所述表达型重组体的工程菌、由此工程菌表达和分离纯化的目的融合蛋白scFvLH-pVIII(和scFvHL-pVIII)以及此融合蛋白用于沙门菌属的临床检验诊断以及食品卫生诊断。
文档编号C12N15/62GK101469333SQ20071030538
公开日2009年7月1日 申请日期2007年12月25日 优先权日2007年12月25日
发明者吕建新 申请人:温州医学院