专利名称：微生物药敏培养和检验装置的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种对微生物药敏的培养和医学检验的专用装置，尤其是分枝杆菌 快速培养药敏及鉴定微量连续检测装置。
技术背景微生物的药敏培养和医学检验的专用装置，尤其是分枝杆菌快速培养药敏及鉴定微 量连续检测装置。典型的如分枝杆菌快速培养药敏及鉴定微量连续检测:第四次全国结核病流行病学抽样调査，对59个点进行全人口感染率调査结果实验人口为365， 097人,活动性肺结 核患病率367/10万、菌阳肺结核患病率为160/10万，全国的结核病疫情仍很严重。在 卫生部公布的27种重点传染病中，结核的发病数居第二位，均排在SARS之前。结核病的实验室检査是结核病的临床诊断和流行病调査的主要手段，其中细菌学检 査是结核病诊断的金标准。当前结核病治疗仍然以抗结核药物化学疗法为主，但是目前 对一种或多种抗结核药物同时耐药的菌株(多耐药菌)明显增多，还有一些依赖菌(即 对某药有依赖性，该药存在时甚至生长更好)，因此及早检出哪些药物是敏感，哪些耐 药以指导治疗十常重要。结核的病原体是抗酸分枝杆菌。大多数分枝杆菌，特别是迟缓生长分枝杆菌菌群， 例如结核分枝杆菌，牛型分枝杆菌等，生长十分缓慢。目前分枝杆菌培养药敏试验仍多 采用传统方法(以下简称《规程》法)，即绝对浓度法和比例法(全国临床检验操作规 程第三版2006 916 917)。在传统改良罗(L-J)氏固体培养基上，要经4 8周培 养才能生长出菌落，再经4周才能获得药敏结果，不能满足临床化疗的需要。因此抗酸 杆菌培养药敏检查的发展，主要集中于快速试验的研究。近年来国内外学者都努力寻找快速的培养和药物敏感试验方法。BACTEC 460tb快速分支杆菌自动检测装置，可将传统培养时间提早10天以上，药敏时间平均7天(林 健雄，郑崇辉BACTEC460-TB自动快速检测结核菌的临床应用及评价国际医药卫生 导报2001V N9 94)，但此法由于使用"C同位素棕榈酸作基质，放射性物质造成环境 污染，在使用多年后，现在已被许多发达国家和我国禁用。近20年来国内外着重对非放射性方法进行了研究，发表了许多这方面方法文章(1) 生物发光法ATP是细菌能量代谢的指标，生物半衰期短，当细菌生长抑 制或死亡后，胞内ATP含量即明显下降，因而可作为活菌的标志。结核分支杆菌培养一 段时间后，抽提菌内ATP，然后加入生物发光试剂，通过光度计进行定量检测。可在5-7 天内获得结果，但同时存在无法区分致病菌和非致病菌，ATP抽提烦琐等缺点。(2) 噬菌体生物发光检测方法采用生物发光技术检测可表达荧光素酶的分枝 杆菌噬菌体phage 40，对不同细菌的发光反应和药敏试验进行测定。在含抗结核药物的 培养基中，耐药结核菌的发光强度比非耐药结核菌强,其强度差异有显著性意义。Phage40的药敏试验结果与常规罗氏培养基法符合率一致，可在72h内得到结果。(吕斌，徐 顺清，陈志飞用重组噬菌体检测结核分枝杆菌耐药性中华检验医学杂志 2000V23N3 144-147)综上所述，各种新的方法均比传统的方法快速，但也存在许多不足之处，因此还。 不管那一种方法，只有朝着快速、准确、灵敏、防污、特异和经济的方向发展和完善， 才有望取代传统的方法在临床推广应用。目前在国内临床使用较多的快速培养方法和检测装置有以下几种 (1 ) Becton Dickinson公司BACTEC MGIT960仪在国内外已经应用， BACTEC-TB960利用对氧敏感的荧光钌复合物作为荧光探头，检测培养基中氧的含量。 当细菌生长良好时，培养基中氧含量下降，即可激发荧光，荧光增强表示细菌生长或耐 药(王巍，李洪敏，王安生BAC TEC—M GIT960快速培养药敏对肺结核诊治的应用和 评价中国防痨杂志 2003年12月第25巻第6期，379 *)。但其仪器和专用培养管价 格昂贵(仪器在百万元左右，每个试验药管在70元左右)，试剂必须依赖进口，在国内特 别在基层难于普及。另外提供的抗结核菌药物仅4 5种。(2) 阿克苏公司的BacT ALERT 3D培养系统BacT ALERT 3D仪是利用颜色感应 器来监测分支杆菌生长过程中释放的C02，随着C02浓度的升高，培养基中H+浓度也直接 升髙，从而使感应器的颜色由墨绿色变为金黄色(Thorpe T C， Wilson M L， Turner J E, et al. Bact/Alert: an automated colorimetric microbial detection system J. Clin Microbiol, 1990， 28(7): 1608-1612; 廖传玉蒋克珉高万痰分支杆菌快速 培养和药敏试验的评价临床肺科杂志2005年1月第10巻第l期115)。(3) DIFC0公司的ESP系统是利用压力感应器，检测密封培养瓶中，在培养过 程细菌生长代谢产生C02、 H2、 N2和消耗02引起培养瓶内气体压力的改变。(4) 噬菌体裂解法分支杆菌噬菌体只能够感染相应的活的分枝杆菌，并在菌 体内繁殖，使指示菌菌体裂解，出现噬菌斑。发明内容本实用新型目的是提出微生物药敏培养和医学检验装置，尤其是分枝杆菌快速培 养药敏及鉴定超千倍放大连续微量检测装置；尤其由无级超千倍放大、连续微量培养直 视观察组成的微生物药敏培养、尤其是分枝杆菌超快速培养药敏及鉴定系统。快速检测 从结核病人分离培养出的抗酸分枝杆菌，对各种抗菌药物的敏感性，为临床治疗提供依 据。提出一种快速、简单、直观、经济、安全防污和更接近人体内环境状态的培养药敏 装置。微生物药敏的培养和检验的专用装置，包括生物安全橱、微量培养板和图象采集放 大检测装置构成在微量培养板的透明平台底部置有放大物镜，微量培养板底部透明并 置于透明平台上，微量培养板或透明平台置于一二维螺旋调节平台上，物镜的光路输出 通过设置一反光光路接可移动调节放大倍数的CCD， CCD输出图象并外接监视器，微 量培养板的上部设有照明光源。上部设有照明光源采用LED，尤其是光源罩内置5-10支LED半导体冷光源，中间一支，周围均布4-9支LED， LED颜色不限，亦可以采用双色LED，功率在10mW及 以上均可。直接从微量培养板底部连续观察细菌增殖状态，通过横向可移动调节放大倍数的调 节，对CCD放大倍数可进行无级调节。图像清晰可见。由于设计的观察方向从培养板 底部进行，因此可以在活体培养条件下连续观察细菌的增殖过程。微量培养板的培养孔为圆柱加锥型台体，孔底是锥型台的小头，直径仅有1 ± 0.3mm，具有镜面平整和载玻片样透光性，作为采集图象的观察窗口。在加样后通过自 然沉降，使细菌集中于孔底观察窗口，可提高细菌增殖时观察效率。板盖对应每一孔上 方，有一突出的密封圈，盖合后嵌入孔口内，有效的防止孔内液外溢。 分枝杆菌快速培养药敏及鉴定微量检测法① 标本处理后，接种于培养基，经过培养，在生物安全橱内将生长出的抗酸分枝 杆菌取出，并制成规定浓度的菌悬液；② 在生物安全橱内，将设有的专用微量培养板上盖打开，板内各孔预先加好培养 基和相应药物，另有阳性对照孔(含有培养基无药)和阴性对照孔(无培养基无药)， 向各孔内加入O.lml规定浓度的菌悬液，将上盖盖好，并将盖和底间封好；以上均根据 培养规程进行；③ 将各个板放入密封湿盒内，置于37士2。C恒温培养箱内培养；④ 每天或隔天取出培养板，放置在活体细菌直视放大系统上观察；从专用培养板 各孔底部的观察窗，在底部成像，连续观察细菌增殖状况。通过光学放大系统，采集细 菌生长图象，并与阴阳对照孔图象比较，与阳性对照孔相似判为耐药，反之为敏感。本实用新型的有益效果快速通过连续超千倍放大系统可将培养中的分枝杆菌 放大l卯0 4000倍，可以在培养过程早期，观察到单个细菌的增殖和微小菌簇的增殖形 态，因此可以早期判断药物作用的结果。而经典的方法是要在细菌经过大量繁殖，长出 肉眼可见的菌落，才能判断结果，故《规程》规定要4周才报告结果。此外，通过培养 基的改进(使用改良7H9培养基内加入适当量的药物)，使其更适合抗酸分枝杆菌的生 长，与其他培养基相比，加快生长速度，因此可以提前获得药敏结果(施旭东，刘正华， 吴晓渊等.结核分枝杆菌培养和药敏试验及菌群鉴定快速法方法的研究.中华检验医学 杂志 2005 28 (8) 790-792)。对80例的临床菌株测定，药敏测定时间平均5.2天，71.3%在5天内，90.3%在 7天内获得结果。比目前任何一种培养药敏方法都快(如3D法药敏时间平均要12天； BACTEC^M GIT960快速培养药敏时间平均要6. 5天)。简单在微量培养板各个微量培养孔内，预先已加入配置好的含一定药量的培养 基(可以作成冻干试剂使商品化)，直接加入从初培养来的菌悬液，置于37'C恒温培养 箱，隔天或每天置活体细菌直视连续超千倍放大系统上观察,根据监视器显示的细菌生 长的数量和微小菌簇的形态,与阳性对照孔比较判定结果，通过电脑采集图象储存记录， 结果可打印图文报告。方法简单，凡具有一定经验的临床检验人员，经过一周培训即可 学会操作。而进口的大型仪器结构复杂，需要较高的技术和外文水平。直观通过活体细菌直视连续超千倍放大系统，可以直接观察到细菌在药物作用 下的生长状态，观察是在密闭生活状态下，可以根据细菌个体的数量和微小菌簇的形态 来判断，该菌株对该药是敏感、耐药或依赖(即该菌株在该药存在下生长更好)，并可 以根据形态判断是否有霉菌或一些杂菌污染。《规程》方法虽然也属于直视观察法，但 它是用肉眼观察菌落，无法看到每一个细菌，因此需要的时间长，而且不能看到细菌在生长过程中的微细变化；而其他方法(如BACTECMGIT960仪、ESP系统、BacT ALERT 3D仪等)，都是间接的以测定生物的生命现象为指标(如氧的消耗、产生气体的压力改 变和二氧化碳产生等)，并不一定与抗酸分枝杆菌生长完全相关，常出现假阳性。经济:使用的活体细菌直视连续超千倍放大系统和专用微量培养板是完全用国产 原材料构建和制造的，成本很低，专用微量培养板每块五元(含40个检测孔板)。微量 板使用的培养基很少，每个检测孔板(test)仅0.1ml，(仅为常法的1/25 1/40)。因此 本法每test的成本价仅一元，因此节约了大量试剂成本。安全防污将已装好培养基和相应药物的培育板置于生物安全橱内，打开上盖加 入菌悬液后将盖盖上，用透明胶带密封后置于37'C培养箱培养，在以后观测检查时不 再开盖， 一直到结果报告后整体培养板高压消毒或微波消毒。而有些快速法(如噬菌体 法和流式细胞仪法)，需要反复开盖、取出、转管和开放测定，增加了污染风险。更接近人体内环境使用液体培养基，使细菌在液体内部生长，与《规程》使用 的固体培养基，细菌在培养基的表面直接与空气接触的环境下生长相比，更接近于人体 内环境。因为结核菌是寄生于细胞内，所以在液体内培养的结果更接近临床状态。特别适合抗菌药物的MIC和混合药敏试验无论是MIC或混合药敏试验，其对每 一种药物都需要多个不同浓度的管或多个不同药物和浓度搭配的管，不论成本上还是在 操作上，在其他快速法都不可能在临床检验中实施。本法由于使用多孔微量培养板，培 养基用量很少，很容易进行倍比稀释和药物搭配混合，成本低操作简便，因此可以实现 临床意义上是MIC或混合药敏试验。
图l是本实用新型光学检测结构示意图，图2是本实用新型培养活体细胞(细菌)和直视放大观察检测流程图具体实施方式
图中1、输出图象外接监视器；2、放大物镜；3、标本微量培养板和标本；4、 光源箱内置七支半导体冷光源(正面及侧面)；5、 CCD， 6、是光路反射镜；7、螺旋 二维调节平台；8、 CCD可移动调节方向。光学系统通过光学显微镜物镜和放大CCD图象采集系统一道构成，通过物镜头3 将图像进行显微放大，经光路反射6至CCD图象采集系统5， CCD放大可直接从监视 器观察。可移动调节放大倍数的CCD、 二维螺旋调节平台用于使标本微量培养板正好 对准物镜窗口、图中光源箱内置七支半导体冷光源(正面及侧面)。CCD输出图像并外 接监视器，可以用电脑系统的监视器，并可以在电脑控制下工作，并没有超出本实用 新型的范围。① 病人的标本(痰、胸腹水、脑脊液、尿、便或灌洗液等)按卫生部《规程》规定方法处理后，接种于培养基，经过培养(L-J法或其他快速法)，在生物安全橱内将生长出的抗酸分枝杆菌取出，并制成规定浓度的菌悬液。② 在生物安全橱内，将专用微量培养板上盖打开，板内各孔已经预先加好培养基和 相应药物，另有阳性对照孔(含有培养基无药)和阴性对照孔(无培养基无药)，向各孔内加入0.1ml规定浓度的菌悬液，将上盖盖好，用透明胶带将盖和底间封好。③ 将各个板放入密封湿盒内，置于37'C恒温培养箱内培养。④ 每天或隔天取出培养板(不要打开盖)，放置在活体细菌直视连续超千倍放大系统 上观察。从专用培养板各孔底部的观察窗，通过超千倍放大系统，采集细菌生长图象， 并与阴阳对照孔图象比较，与阳性对照孔相似判为耐药，反之为敏感。专用微量培养板每孔容积3.5ml，具有样品浓集光学孔底和密闭盖。该板无菌处 理后，预先在各个孔内分别加入含有各种不同抗菌药物的培养基。培养中活体细菌连续直视超千倍放大系统。该系统可将培养中的细菌放大1000 4000倍(放大倍数无级可调)显示在监视器上，结果由计算机控制采集图象储存并可 打印图文报告。细菌微量培养板-微量培养板具有圆柱锥形微量培养孔，孔底直径仅有1 mm，具有镜面平整和载 玻片样透光性，作为采集图象的观察窗口。板盖对应每一孔上方，有一突出的密封圈， 盖合后嵌入孔口内，有效的防止孔内液外溢。微量培养板具要圆柱锥形微量培养孔，培 养板的培养孔为圆柱锥型台体，在加样后通过自然沉降，使细菌集中于孔底观察窗口， 可提高细菌增殖时观察效率。微量培养板的培养孔为圆柱加一锥型台体，孔底即锥型台 底是纯平面。而不似现有产品的截面为U形的结构。微量培养板的板盖上设有一突出 的密封圈。直观放大检测仪可做到无级超千倍放大，由置于微量培养孔上部的光源和光学放大 CCD图象采集系统构成，通过微量培养板下部物镜成像光路经放大后可直接从微量培 养板底部连续观察细菌增殖状态，放大倍数可无级调节。使非染色的活体标本呈立体图 象，清晰可见。由于设计的观察方向是从培养板底部进行，因此可以在活体培养条件下 连续观察细菌的增殖过程。
权利要求1. 微生物药敏的培养和检验装置，包括生物安全橱、微量培养板和图象采集放大检测装置构成其特征是在微量培养板的透明平台底部置有放大物镜，微量培养板底部透明并置于透明平台上，微量培养板或透明平台置于一二维螺旋调节平台上，物镜的光路输出通过设置一反光光路接CCD，CCD输出图象，微量培养板的上部设有照明光源。
2、 根据权利要求l所述的微生物药敏的培养和检验装置，其特征是微量培养板 上部照明光源采用LED。
3、 根据权利要求2所述的微生物药敏的培养和检验装置，其特征是光源是内置 5-10支LED半导体冷光源，中间一支，周围均布4-9支LED。
4、 根据权利要求1所述的微生物药敏的培养和检验装置，其特征是CCD是可 移动调节放大倍数的CCD。
5、 根据权利要求l所述的微生物药敏的培养和检验装置，其特征是微量培养板 的培养孔为圆柱加一锥型台体，孔底即锥型台底是纯平面。
6、 根据权利要求5所述的微生物药敏的培养和检验装置，其特征是微量培养板 的板盖上设有一突出的密封圈。
7、 根据权利要求5所述的微生物药敏的培养和检验装置，其特征是孔底直径1 ± 0.3mm。
专利摘要微生物药敏的培养和检验装置，包括生物安全橱、微量培养板和图象采集放大检测装置构成在微量培养板的透明平台底部置有放大物镜，微量培养板底部透明并置于透明平台上，微量培养板或透明平台置于一二维螺旋调节平台上，物镜的光路输出通过设置一反光光路接CCD，CCD输出图象并外接监视器，微量培养板的上部设有照明光源。构成活体细菌直视放大系统；从专用培养板各孔底部的观察窗，通过光学放大系统，采集细菌生长图象，并与阴阳对照孔图象比较，与阳性对照孔相似判为耐药，反之为敏感。
文档编号C12Q1/18GK201092573SQ20072004039
公开日2008年7月30日 申请日期2007年7月27日 优先权日2007年7月27日
发明者刘正华 申请人:刘正华