使用经遗传工程改造的微观藻类、蓝细菌或细菌生产短链挥发烃类的制作方法

专利名称：使用经遗传工程改造的微观藻类、蓝细菌或细菌生产短链挥发烃类的制作方法
使用经遗传工程改造的銜见藻类、蓝细菌或细菌
生产短链挥发烃类
相关申请的交叉引用
本申请要求于2006年6月29日提交的专利申请号为60/806,244的美 国临时申请的优先权，该申请以引用形式并入本文。
背景技术：
已知有多种草本植物、落叶植物以及针叶植物具有合成短链类异戊二
烯(例如，异戊二烯(C5H8)和甲基丁烯醇(C5H^00)并将其释放到周围环
境中的遗传能力及餘波能力。这些短链类异戊二烯来自光合作用中早期的 卡尔文循环产物，并可以通过所谓的DXP-MEP途径在某种环境压力^Hf 下以可观速率在草#物、落叶植物和针叶植物的叶绿体中合成。生物体 的热应激对在植物中诱导该过程特别重要，并且所得的烃类对大气的污染 已成为本领域现有技术所关注的焦点。
异戊二烯从草本植物、落叶植物和针叶植物中的释放是由于存在异戊 二烯合酶(/S/7S)基因，其是编码一种位于叶绿体中的蛋白质的核基因， 该蛋白质催化从二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)到异戊二烯的转化。如 上文所提到的，在叶绿体中从卡尔文循环的早期产物合成类异戊二烯(碳 固定和还原，参见图l)。五碳的类异戊二烯，例如，异戊二烯(CsHs)和 甲基丁烯醇(CsHwOj为相对小的疏水分子，其直接由二曱基烯丙基二 磷酸(DMAPP)合成(图2)。这些类异戊二烯为挥发性分子，4艮容易穿 过细胞膜并因此从叶释放到大气中。热应激-诱导以及植物释放短链烃的过 程已经作为有害的大气污染在文献中讨论过。尚未有从草本植物、落叶植 物和针叶植物的叶中大规模生产、收集和分离这些烃类的描述。
急切需要开发可有助于满足全球的能源需求同时不造成气候变化的可 再生生物燃料。本发明通过提供生产完全来自于阳光、二氧化碳(C02) 和水的挥发性短链烃的方法和组合物来应对该需求。这些烃可用作生物燃 料或合成化学工业中的原料。发明概要
本发明部分地基于以下发现，即经过适当的改造可以利用微观藻类
(microalgae )、蓝细菌和原核生物光合作用生产五碳类异戊二烯(例如， 图3)。在植物和藻类中，DXP-MEP类异戊二烯生物合成途径是绝对需要 的，因为它导致许多必需长链细胞化合物的合成。单细胞绿藻在它们的叶 绿体中特异性的表达该途径，并利用相应的酶对多种分子(类胡萝卜素、
生育酚、植醇、甾醇、激素、以及其它许多分子)进行生物合成。本发明 涉及在生产和收集五碳挥发性类异戊二烯化合物(例如异戊二烯和甲基丁 烯醇)中使用经遗传^it的銜见藻类、蓝细菌以及光合和非光合细菌的方 法和组合物。这些经遗传改造的生物可商业性地用于封闭的大M^培养系 统，例如，为内燃机或者在装载改造(on-board reformation)后为燃料电 池引擎提供可再生燃料的来源；或者为用于其它化学过程(如化学合成) 中的异戊二烯提供来源。
微观藻类、蓝细菌以及光合和非光合细菌不具有异戊二烯合酶或甲基 丁烯醇合酶的基因，所述两种酶分别催化异戊二烯(C5H8)和甲基丁烯醇 (CsI^。Oj生物合成的最后一步关键步骤。因此，本发明提供了遗传改 造微生物以表达异戊二烯合酶基因(例如调整过密码子的杨树异戊二烯合 酶基因)使所述生物可以生产异戊二烯(C5H8)的方法和组合物。
另一些方面，本发明还提供了用于遗传^it銜见藻类、蓝细菌以及光 合和非光合细菌使其过表达类异戊二烯生物合成的第一关键步骤之内源 基因及其所编码蛋白质的方法和组合物。因此，本发明还包括在所述微生 物中提高天然"m和dat基因的表达，所述微生物例如绿藻如莱茵衣藻 (C7r/"wj^/o附o丽s1 mVi^nft//);蓝细菌如集胞藻(iS"ecAc^幼's1 sp.);或 者光合细菌如深红红螺菌(7 /i0^s/;f777/"w n/^w附)，或非光合细菌如大 肠杆菌(五sc/^n'c/^i"//)。 Djcs和2X^编码类异戊二烯生物合成中催化第 一关键步骤的酶。
在一些实施方案中，采用了銜见藻类。銜见藻类是光合作用的工厂， 其中约70%的细胞容量被叶绿体占据；绿藻叶绿体包含超过300万的电子 传递链，每条链每秒钟能够向卡尔文循环传递100个电子用于将C02转化 为GA-3-P;銜见藻类没有根、茎、叶和花会耗费光合作用合成的资源， 因此，大部分的光*用产物可被引导至产生挥发性类异戊二烯；#^见藻类的生长和繁殖比任何其它陆生或水生植物都要快，生物量每天翻一番； #^见藻类无毒、无污染，因此对于大皿培养和商业开发是环境友好的。 因此，在一些实施方案中，本发明提供了改造微观藻类光合作用的高效过 程的方法，以使得从阳光、C02和H20高容量地生产短链异戊二烯烃类(例 如，C5H8)。这些经&造的樹，见藻类可以例如，在大容量(例如，1000到 1000000升)的完全封闭光反应器中生产和收集挥发性短链异戊二烯烃类。
本发明可以帮助消除多种当前可再生能源商业化生产、储存和利用中 的障碍，包括但不限于(a)降低燃料生产和存储的成本，(b)提高燃料 的重量/体积比，(c)改善燃料生产/存储的效率，U)提高燃料储存的耐 久时间，(e)使燃料自动补给时间最小化，(f)在车辆可接受的范围内提 供充足的燃料储存，(g)生产适于再生过程的燃料，(h)在生产或存储阶 段，燃料不受氧气的干扰。
一方面，本发明提供了在选自^U见藻类、蓝细菌或光合细菌的微生物 中生产异戊二烯烃类的方法，所述方法包括将包含编码异戊二烯合酶的 核酸序列的表达盒引入所述微生物中；在编码异戊二烯合酶的核酸得到表 达的条件下培养所述微生物。在一些实施方案中，所述微生物是微观藻类 如绿藻，如菜茵衣藻、斜生栅藻、小球藻或盐生杜氏藻。在另一些实施 方案中，所述微生物为蓝细菌，如集胞藻。在另外一些实施方案中，所述 微生物为光合细菌，如深红红螺菌。可替代地，在一些实施方案中，所述 微生物可以是非光合细菌，如大肠杆菌。
在一些实施方案中，引入到微生物中的核酸包含编码异戊二烯合酶多 肽的序列，所述多肽具有SEQIDNO:2所示序列，或具有SEQ ID NO:2 所示序列但缺少转运肽区域。异戊二烯合酶多肽可以例如包含SEQ ID NO:2的53-595号^J^酸^，或SEQ ID NO:2的38-595号^J^酸残基。 在一些实施方案中，所述核酸包含SEQIDNO:l所示序列。在另一些实施 方案中，所述核酸包含SEQ ID NO:3中所示异戊二烯合酶的核苷酸编码序 列；或所述核酸包含SEQ ID NO:5中所示异戊二烯编码序列。
另一方面，本发明提供了选自微观藻类细胞、蓝细菌细胞以及光合细 菌细胞或非光合细菌细胞的微生物，其中所述微生物包含与启动子有效连 接的编码异戊二烯合酶的异源核酸。所述启动子可以是组成型启动子或是 可诱导启动子，在一些实施方案中，所述微生物为绿藻，如莱茵衣藻、斜 生栅藻、小球藻或盐生杜氏藻。在其它一些实施方案中，微生物为蓝细菌、如集胞藻。在其它一些实施方案中，微生物是光合细菌，如深红红螺菌。 在一些实施方案中，所述异源核酸包含编码异戊二烯合酶基因的序列，所
述异戊二烯合酶具有SEQ ID NO: 2中所示序列，或具有SEQ ID NO: 2 中所示序列但缺少转运肽。该异戊二烯合酶多肽可以例如包含SEQ ID NO: 2的53-595号氨基酸残基，或SEQ ID NO: 2的38-595号残基。在 一些实施方案中，所述核酸包含SEQIDNO: 1中所示序列。在其它一些 实施方案中，所述核酸包含SEQIDNO: 3中所示异戊二烯合酶的核苷酸 编码序列；或所述核酸包含SEQ ID NO: 5所示的异戊二烯编码序列。
另一方面，本发明提供了一种在包含编码异戊二烯合酶的异源基因的 微生物中生产异戊二烯烃类的方法，所述微生物选自孩O见藻类、蓝细菌、 光合细菌和非光合细菌，所述方法包括在表达所述异戊二烯合酶基因的 条件下，在封闭生物反应器中大皿培养所述微生物；收集所述微生物所 生产的异戊二烯烃类。在一些实施方案中，所述微生物是^bf见藻类，所述 ^bi见藻类是绿藻如莱茵衣藻、斜生栅藻、小球藻或盐生杜氏藻。可替代地， 所述微生物可以是蓝细菌，如集胞藻。在另一些实施方案中，所述微生物 为光合细菌，如深红红螺菌。在另一些实施方案中，所述微生物为非光合 细菌，如大肠杆菌。
在本发明大M^养方法的一些实施方案中，所述编码异戊二烯合酶 的异源基因包括编码具有SEQ ID NO:2中所示序列或具有SEQ ID NO:2 中所示序列但是缺少转运肽的异戊二烯合酶基因的序列。所述异戊二烯合 酶多肽可以例如包含SEQ ID NO:2的53-595^&酸^1^,或SEQ ID NO:2 的38-595号M酸戎基。所述核酸可以包含例如SEQ ID NO:l中所示的 序列。在另一些实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO:3中所示的异戊二 烯合酶的核苷酸编码序列；或SEQ ID NO:5中所示的异戊二烯编码序列。
在本发明的方法和组合物的一些实施方案中，IspS核酸编码包含SEQ ID NO:8的^tJ^酸序列或包含SEQ ID NO:8的46-608号氨基酸的蛋白质。


图1.光^ft用的卡尔文循环中二氧化碳固定和还原的途径以及有机 碳通过脱氧木酮糖/曱基赤藓糖醇(DXP/MEP)生物合成途径从普遍存在 的3-磷酸甘油醛(GA-3-P)到类异戊二烯的传递途径的示意图。
图2.(左图)分别在草本/落叶树木以及美国松树的叶绿体中生物合成异戊二烯和曱基丁烯醇的单步酶催化反应。(右图)异戊二烯(C5H8)和 甲基丁烯醇(C5H1()0)的化学式。
图3.由大量叶绿体代谢物3-磷酸甘油醛(GA-3-P)和丙酮酸形成挥 发性类异戊二烯的DXP/MEP生物合成途径。从GA-3-P和丙酮酸合成异 戊二烯需要七步不同的,化反应。单细胞绿藻、蓝细菌、光合细菌和某
些非光合细菌具有这些基因中的前六个，但是缺少异戊二烯合酶或曱基丁 烯酸合酶基因。
图4.用新型0-/印^基因进行绿藻(例如莱茵衣藻)叶绿体DNA的 共转化和同源重组。该构建物包括a^4启动子(PatpA),该启动子融合 到密码子优化的三拷贝血凝素(HA)表位标签DNA的5， UTR末端。该 DNA序列之后为编码区，之后为fl尔j 3， UTR。
图5.通过基因组DNAPCR筛选莱茵衣藻/s/;S (0/sp51)转化子。 引物N和C代表用于扩增的引物对，其退火位置如图4所示。
图6.A.用基因组DNA的Southern印迹分析检测O/s/^转基因的完 整性。用OA/^ DNA探针检测滤膜。与0-/^;5<编码区中放射性标记的 Ndel/Xbal片段杂交仅仅在0-/s/^转化体弁9系中鉴定出3.0 kbp条带，而 在弁7对照系泳道中观察不到可检测条带。B.溴化乙锭染色以测试A中加 载等量DNA。
图7. A.密码子优化的带3xHA标签的0-/^5基因的示意图。 B. OJs/^基因表达的验证。用特异性多克隆抗HA抗体对相当于10或 20照叶绿体的可溶性蛋白质级分进行SDS-PAGE和Western印迹分析。
图8. pIspS质粒的组件和结构。其密码子用法祐i殳计成用于在蓝细菌 (例如集胞藻)中表达的新型异戊二烯合酶基因(&-75/^),其包含氨卡 青霉素抗性基因。基于杨树异戊二烯合酶蛋白质的M酸序列模板设计出 此新型5^-/^5*DNA序列，其设计原则符合集胞藻的密码子偏好性。引入 限制性位点以方便克隆。合成该新型DNA序列并克隆到质粒/^/75" 中用于在大肠杆菌中增殖。
图9.用于转化蓝细菌(如集胞藻)的pAIGA质粒的构建。采用来自 集胞藻的，M3基因的侧翼序列进行质粒的同源重组，随后用强启动子驱 动5s-Js/^基因的表达。将庆大霉素抗性盒引入到质粒中^-Js/^基因的3' 末端以用作选择标记。将基因克隆至Ncol和Pstl限制性位点之间。
8图10.双重同源重组。通过双重同源重组和用5"s-i5/^ Gm抗性构建 物替换天然/wMJ基因来转化集胞藻的原理示意图。
图ll.用于在细菌(如大肠杆菌)中过表达重组蛋白质的带His标签 包含的质粒的结构。引入N-末端组氨酸标签以方便重组蛋白质的 纯化。向液体细胞培养物中加入IPTG来诱导;U^杆菌的表达。
图12.细菌(如大肠杆菌)中带组氨酸标签的5^-75/^重组蛋白质的 表达的证据。考马斯染色的SDS-PAGE分离的来自携带pETIspS质粒的 大肠杆菌细胞提取物的总蛋白质。第一泳道未诱导的对照培养物。2-4 和6-10泳道诱导过的大肠杆菌培养物。5泳道蛋白质分子量大小标准 参照物。
图13.四种已知异戊二烯合S^白质的Clustal比对。 发明详述
定义
"微观藻类"、"藻类(alga)"等，指属于菌藻植物门(phylum Thallophyta)的藻亚门(subphylum Algae)的植物。所述藻类是单细胞 的光合生氧藻类，为非寄生植物，无才艮、茎和叶；它们具有叶绿素并且尺 寸大小各异，从m^见藻类到大型的海藻。绿藻，属于真核生物(Eukaryota) 画植物界(Viridiplantae)腸绿藻门(Chlorophyta)-绿藻纲(Chlorophyceae )， 可以在本发明中使用。然而，本发明中可用的藻类也可以是蓝绿藻、红藻 或棕色藻，只要该藻类能够实施提供异戊二烯生产的底物的必要步骤。
本发明文中的"挥发性异戊二烯烃类"是指五碳的短链类异戊二烯，例 如异戊二烯或甲基-丁烯醇。
术语"核酸"和"多核普酸，，以相同含义使用，指从5，端到3，端阅读的脱 氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。本发明中的核酸一 般包含磷酸二酯键，尽管在一些情况下，可使用可能具有替代主链的核酸 类似物，其包括例如，杀J^磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和O-甲基 亚磷酰胺连接(参见Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press );以及肽核酸主链和连接。其它核酸 类似物包括具有带正电主链、非离子主链和非核糖主链的那些。因此，核酸或多核苷酸还可能包含经修饰的核苷酸，其允许被聚合酶正确阅读。"多 核苷酸序列"或"核酸序列，，包括作为单独单链或在双链体中的核酸的有义 链和反义链。如本领域的人员可以理解的，对单链的说明还限定了互补链
的序列；因此本文中所描述的序列也提供它的互补序列。除非另外i兌明， 具体的核酸序列也隐含地涵盖了其变体(例如简并密码子取代物)和互补 序列，明确说明的序列。核酸可以是DNA,包括基因组和cDNA、 RNA 或杂交体，其中核酸可能包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及 碱基的组合，其包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、 黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟噤呤等。
词组"编码......的核酸序列"指包含结构RNA (如rRNA )、 tRNA序列信息或者具体蛋白质或多肽的一级氨基i^列信息或者反式作用调控因 子结合位点的序列信息的核酸。该表述特别地涵盖了天然序列的筒并密码 子(例如，编码单个M酸的不同密码子)，其可以被引入序列以符合特 定宿主细胞中的密码子偏好性。在本发明语境中，当涉及核酸参考序列(例 如SEQ ID NO:3、 5或7)使用时，术语"IspS编码区"指编码该蛋白质的 核酸区域。
本发明语境中的/s/^"基因"指编码IspS蛋白质或其片段的核酸。因此， 这些基因经常是编码IspS的cDNA序列。在其它一些实施方案中， 基因可包括在cDNA中不会出现的序列，如内含子。
术语"启动子"或"调控元件"指位于转录起点上游或下游的指导转录的 区域或序列决定区。如本文中所使用的，启动子包括临近转录起始位点的 必需核酸序列，例如，在II型聚合酶启动子的情况下有TATA元件。启动 子也可任选地包括远程元件，其位于距转录起始位点多至几千个4^对的 位置。"组成型"启动子是在大多数环境和发育M下都有活性的启动子。 "可诱导"启动子是在环境或发育调控下有活性的启动子。术语"有效连接" 指核^达控制序列(如启动子)和第二核酸序列(如IspS基因)之间的 功能性连接，其中所^达控制序列指导对应于所述第二序列的核酸的转 录。"藻类启动子"或"细菌启动子"是能够分别在藻类和/或细菌细胞中启动 转录的启动子。因此，该启动子在銜见藻类、蓝细菌或细菌细胞中^1有活 性的，但不必来源于该生物体。应理解，在不破坏调控元件生物功能的情 况下，可以对其作出有限的l务饰，并且与野生型藻类调控元件相比，这些 有限修饰可以使藻类调控元件具有基;M目同的或提高的功能。这些修饰可以是故意的，如通过定点诱变，或者也可以是偶然的，如通过带有所述调 控元件的宿主中的突变。只要基本保留赋予在单细胞绿藻中表达的能力， 藻类调控元件的定义中就包括所有这些经1务饰的核苷酸序列。
或Dat基因的"提高"或"增强，，活性或表达指Dxs或Dxr的活性的 变化。这种提高的活性或表达的实例包括下列。Dxs或Dxr的活性或者 或Zbr基因的表达提高至野生型非转基因对照微生物的水平之上(即Dxs 或Dxr的活性或者2Xo或Z)at基因的表达的量提高)。Dxs或Dxr的活性 或者Dxs或Djcr基因的表达是在其野生型非转基因细胞中通常检测不到上 述活性或表达的细胞中进行的(即Dxs或Dxr基因的表达提高)。当细胞 中存在Dxs或Dxr的活性或者Djcs或"at基因表达的时间比野生型非转基 因对照中更长(即Dxs或Dxr的活性或者Dxy或Dxr基因的表达的持续时 间增长)时，则Dxs或Dxr活性或者表达也^^提高的。
在本发明中基因的"表达"通常是指向细胞中引入/^S基因，所 述细胞例如微观藻类(如绿色#^见藻类)、蓝细菌、或者光合或非光合细 菌，所述基因通常不在这些生物体中表达。因此，IspS活性或表达的"提 高"通常是同不具有IspS活性的野生型细胞(例如，銜见藻类、蓝细菌或 者光合或非光合细菌)相比较确定的。
如果多核苷酸序列来源于外源物种或者若来源于相同物种但经itA类 作用而从其原始形式进行了修饰，则它是第二核苷醋列的"异源"核普酸 序列。例如，与启动子有效连接的异源编码序列是指其来源物种不同于启 动子来源物种的编码序列，或者，如果来源于相同物种，则编码序列不同 于任何天然等位基因变体。
"IspS多核苷酸"是SEQIDNO: l或SEQIDNO: 7的核酸序列，或 者SEQ ID NO : 3或SEQ ID NO : 5的IspS编码区域；或者是与SEQ ID NO: l基;M目似的核酸序列或者与SEQ ID NO : 3或SEQ ID NO : 5 的IspS编码区^Jj^目似的核酸序列；或者编码SEQIDNO : 2或SEQ ID NO : 8的多肽或者编码与SEQ ID NO : 2或SEQ ID NO : 8基杣目 似的多肽或者其片段或结构域的核酸序列。因此，IspS多核普酸1)包 含SEQ ID NO: l或SEQ ID NO: 7中的或者SEQ ID NO: 3或5之IspS 编码区域中的约15到约50、 100、 150、 200、 300、 500、 1000、 1500或 2000或更多个核苷酸，有时约20或约50到约1800个核普酸，有时约200 到约600或约1500个核苷酸的区域;或者2 )在严谨条件下，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 7或者与SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5的IspS编码 区域或者与其互补序列杂交；或者3)编码IspS多肽或编码IspS多肽(例 如，SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 8)的至少50个连续氨基酸通常至少 100、 150、 200、 250、 300、 350、 400、 450、 500、 550或更多个连续残基 的片段；或者4)编码与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8或在SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 8的至少100、 200、 300、 400、 500或550个^J^酸残 基的比较窗口上具有至少55%,通常至少60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、卯％、 95Y。或更多一致性的IspS多肽或片段；或者5)具有与SEQ ID NO: l或SEQ ID NO: 7有大于约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、卯％、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或更高核普酸序列一致性的 核断列，在SEQ ID NO: l或SEQ ID NO: 7的或者SEQIDNO: 3或 SEQ ID NO: 5之IspS编码区域的至少约50、 100、 200、 500、 1000或更 多核苷酸的比较窗口上具有至少80%、85%、卯％或至少95%、96%、97%、 98%、 99%或更高一致性；或者6 )是由针对SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 7的或者针对SEQ ID NO: 3或SEQIDNO: 5之IspS编码区域的引物所 扩增的。术语"IspS多核苷酸"是指双链或单链的核酸。本文中所用的IspS 核酸编码催化二甲基烯丙基二磷酸底物向异戊二烯转化的活性IspS。
"IspS多肽，，是具有SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 8 ^J^紗列的 ^&酸序列，或是与SEQIDNO: 2或SEQ ID NO: 8基^目似的氨基酸 序列，或其片段或结构域。因此，IspS多肽可以1)与SEQ ID NO: 2 或SEQ ID NO: 8，或者是在SEQIDNO: 2或8的至少100、 200、 250、 300、 350、 400、 450、 500或550个氨基酸的比较窗口上，有至少55%的 一致性，通常至少60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、卯％、 95%或 更高的一致性；或者2)包含SEQIDNO: 2或8的至少100，通常至少 200、 250、 300、 350、 400、 450、 500、 550或更多个连续^^酸；或者3) 结合针对包含SEQ ID NO: 2或8之M酸序列的免疫原及其保守修饰变
体所产生的抗体。本发明中的IspS多肽是催化二甲基烯丙基二磷酸底物向 异戊二烯转化的功能性蛋白。
如本文中所使用的，特定的75/^基因(例如，SEQIDNO: 1)的同 源物或直系同源物例如是同一植物类型或不同植物类型中与所述第一基 因中序列基本一致(如下所述确定)的第二基因。
术语"Dxs"和"Dxr"核酸和多肽是指片段、变体等。示例性Dxs和Dxr序列包括公开于美国专利申请公开No. 20030219798中所公开的核酸和多 肽Dxs和Dxr序列，例如衣藻(C7^附j^wffwios)序列。美国专利申请乂> 开No. 20030219798中所述的Dxs和Dxr序列以引用形式并入本文。
"表达盒"是指核酸构建物，当引入到宿主细胞中时，其导致RNA或 多肽的转录和/或翻译。
在转基因表达的情况下，技术人员能够认识到插入的多核苷^列不 需要与该序列所来源的基因序列一致，而是可以"基本一致"。如下所解释 的，本术语具体地涵盖了这些变体。
在插入的多核苷酸序列被转录和翻译产生功能性多肽的情况下，技术 人员会了解，由于密码子的简并性，有一些多核苷酸序列会编码相同的多 肽。术语"IspS多核苷酸序列"或"IspS基因"具体地涵盖了这些变体。
当两序列中的核苷酸序列或氨基酸残基序列如下所述地进行最大对应 性比对时是相同的，则这两种核酸序列或多肽被称为"一致的"。本文中所 用的术语"互补于"意味著该序列互补于参考多核苷酸序列的全部或部分。
用于比较的最佳序列比对可以通过局部同源性算法(Smith和 Waterman Add. APL. Math . 2 :482 ( 1981 ))、同源性比对算法(Needle man和WunschJ. Mol. Biol. 48:443 (1970))、相似度检索方法(Pearson和 Lipman Proc. Natl. Acad. Sd. (U.S.A.) 85: 2444 (1988))、这些算法的计算机 化形式(GAP、 BESTFIT、 BLAST、 FASTA和TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI)或通过检查来进行。
"序列一致性的百分比"是通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列 来确定的，其中相比于用于两序列最佳比对的参考序列(不含有添加或缺 失)，所述比较窗口中的多核香酸序列部分可以包含添加或缺失(即缺口 )。 所述百分比如下进行计算确定两序列中一致的核酸威基或氨基酸残基的 位置的数目，得到匹配位置数，然后用匹配位置数除以比较窗口中位置总 数再乘以100，就可以得到序列一致性百分比。本文所使用的"比较窗口" 包括涉及任一连续位置数目的区段，例如20到600，通常约50到约200, 更通常为约100到约150，其中在两序列最佳地比对之后，序列可以与具 有相同连续位置数的参考序列相比较。
在多核苷酸或Jl^酸序列的上下文中术语"基本一致"意为多核苷酸或多肽包含与参考序列有至少50%序列一致性的序列。可替代地，百分比一 致性可以为从50%到100%的任何整数。示例性实施方案包括用本文中所 述的程序与参考序列相比具有至少55%、 57%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80、 85%、卯％、 95%或99%的一致性；所述程序优选如下所述釆用标准 参数的BLAST。因此，本发明的IspS序列包含与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 7或者与SEQIDNO: 3或SEQ ID NO: 5的IspS编码区J^本 一致的核酸序列。如上所提到的，本发明中的IspS多肽序列包含与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 8基本一致的多肽序列。
如上所提到的，除了不一致的残基位置可能由于保守的氛基酸变化而 不同外，"基4^目似"的多肽具有共有的序列。保守M酸替换是指具有相 似侧链的残基的互换性。例如，具有脂肪族侧链的M酸组为甘氨酸、丙 氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的JL^酸组为丝 氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的M酸组为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有 芳香基侧链的M酸组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨 基酸组为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的M酸组为半胱氨酸 和甲硫氨酸。示例性保守Jl&酸取代组为缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙 氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、天冬氨酸-谷氨酸和天冬酰 胺-谷氨酰胺。
核苷酸序列基本一致的另 一个指示是两个分子在严谨条件下是否可以 相互杂交或可以与第三核酸杂交。词组"严谨杂交条件，，是指探针可以与其 靶标子序列(通常是在核酸的复杂混合物中)杂交，但是不与其它序列杂 交的条件。严谨M是依赖于序列的，并且在不同的环境中有所不同。更 长的序列在更高的温度下特异性杂交。对核酸杂交的详细指导可以参照 Tijssen， Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)。通常，选择在限定的离子强度和pH 值下比该特定序列的热熔解温度(Tm)低约5-10。C的严谨条件。Tm值为 平衡时(由于耙序列过量存在，在Tm温度下，平衡时占用了 50%的探针) 互补于靶标的探针中的50%与乾序列杂交的温度(在限定的离子强度、pH 值和核酸浓度下)。严谨条件是pH值7.0到8.3时盐浓度小于约1.0 M的 钠离子，通常约0.01到l.OM钠离子浓度(或其它盐类)，以及温度对于短 探针(例如10到50个核苷酸)至少约30'C，对于长探针(例如大于50个核普酸)至少约60°C。也可以通过添加如甲酰胺的去稳定剂实现严谨条 件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号为背景的至少两倍，任选地为背 景杂交的10倍。示例性严谨杂交条件可以为如下所示50%曱酰胺、 5xSSC、 1。/。SDS在42。C下孵育，或者5xSSC、 1% SDS、在65。C下孵育， 用0.2xSSC和0.1% SDS在55。C、 60。C或65。C下清洗。这些清洗可以实 施5、 15、 30、 60、 120分4中或更长时间。
如果所编码的多肽基本一致，则在严谨条件下不互相杂交的核酸仍然 是基本一致的。这会在一些情况下发生，例如，当用遗传密码所允许的最 大密码子简并性产生核酸拷贝时。在这种情况下，该核酸通常在中等严谨
的杂交条件下杂交。例如，也可以通过其在严谨条件下(例如，Tm~40°C) 与具有SEQIDNO: l或SEQIDNO: 7序列的核酸探针杂交的能力鉴定 IspS多核苷酸。相对于所选择的核酸探针，该IspS核酸序列可以有例如 约25-30%或更低的磁《^错配。SEQ ID NO: 1是一个示例性IspS多核苷 酸序列。示例性"中等严谨杂交条件"包括在40%甲酰胺、1M NaCl、 1% SDS的緩冲液中在37'C下的杂交，以及在45。C下用lxSSC清洗。这些清 洗可以实施5、 15、 30、 60、 120分钟或更长时间。阳性杂交是背景的至少 两倍。那些普通的技术人员会4^易了解另外的杂交和清洗条件可用来提 供相似严谨条件。
当用于核酸或蛋白质时，术语"分离的"表示该核酸或蛋白质基本上不 含在自然状态下与其相关联的其它细胞组分。优选地，其处于均一的状态， 并且可以是干燥形式或在水性溶液中。纯度和均一性通常采用分析化学技 术确定，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。作为主要物质存在于制 剂中的蛋白质是基本上纯化的。特别地，分离的基因与位于所逸基因侧翼 并且编码目的基因之外蛋白质的开放读码框相分离。
如本文中所使用的，"大规模培养，，是指大量培养已经过改造而表达 i5/^基因的微观藻类、蓝细菌、或者光合或非光合细菌。"大量"通常是在 约100升到约1500000升的范围，或更多。在一些实施方案中，在模块化 生物反应器中大量培养该微生物，所述每个反应器的容量为约1000到约 1000000升。
本发明中的"生物反应器"为^XC藻类、蓝细菌或者光合或非光合细菌
在其中生长的任何密闭的大容量容器。本发明中的"大容量容器，，可以容纳
约100升，通常为约500升，或约1000升到约1000000升，或更多。
15如本文所使用的，"收集"挥发性异戊二烯烃类是指在密闭的或容纳的 环境中捕获或隔离这些烃类。
本发明中采用了多种常规的重组核酸技术。总的来说，以下所述的重
组DNA技术中的术语和实验室程序都是公知的并且在本领域普遍采用。 许多指导实施重组DNA操作的手册都是可以获得的，例如，Sambrook& Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd Ed， 2001);和 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al" eds" 1994-1999)。
IspS核酸和多肽序列是本领域已知的。IspS基因已从杨树和山杨树(两 种相关的树种)以及葛藤(藤a物)中分离出来并测序。通过登录号在 下文中给出所涉及的物种及可从NCBI数据库中获得的序列，其每一个都 以参考形式并入本文
银白杨(户印m/"sfl幼fl) (white poplar)的异戊二烯合酶的IspS mRNA; 登录号AB198180;
美洲山杨(/^戸/"s "e附m/wV/es) (quaking aspen)的异戊二烯合酶(IspS ); 登录号AY341431 (完整cds);
4艮白杨美洲山杨杂交种(尸0/7M/mS a/6flXPo^w/ms "^wm/wV/eS )的IspS
mRNA;登录号AJ294819;
黑杨(尸o/ m/ms "/gm) (Lombardy poplar)的异戊二烯合酶的mRNA (IspS 基因)；登录号AM410988。
山葛膝野变种(户MminVi附o她"a iyw: /otofl) (kudzu vine)的异戊二蹄合 酶(IspS);登录号AY316691 (完整cds.)。
对这些IspS序列的检查表明了高度的核苷酸和Jl^酸序列一致性，例如，杨树和山杨树杂交种的cDNA序列在多肽和核苷酸水平上具有98 %的 一致性(参见，例如，Sharkey et al， Plant Physiol. 137:700-712， 1995 )。山 杨树异戊二烯合酶的核苷酸编码序列与葛藤基因有65%的一致性，而蛋白 质序列(不包括叶绿体转运肽)有57 %的一致性。
杨树的IspS蛋白在所述蛋白质羧基端一半上有高密度的半胱氨酸和 组氨酸。例如，就Cr-IspS蛋白(SEQIDNO: 4)的591个^J^酸序列来 说，其中半胱氨酸位于34、 326、 378、 413、 484、 505和559号位置，即 7个半胱氨酸中有6个位于蛋白质的后45 % 。同样也观察到在所述蛋白的 C端一半多个位置处有另外的成簇组氨酸。已知组氨酸和半胱氨酸参与了 蛋白质适当的折叠和催化位点的结构，并且对于酶活性来说是重要组成部 分。图13中提供了对四种已知IspS蛋白质的比对，其表明在所述分子的 C端部分中半胱氨酸的高度保守。在一种情况下，葛藤蛋白质中有被丝氨 酸取代的另外保守的半胱氨酸(图13的clustal比对中银白杨或黑杨或美 洲山杨的Cys-509-Ser序列)。丝氨酸对于半胱氨酸来说是高度保守的取代， 因为这两种M酸唯一的不同在于用-OH基取代了-SH基。事实上，对四 种IspS序列的检查揭示了在包含所述蛋白质的C端一半中许多保守丝氨 酸的额外性质。因此，在一些实施方案中，本发明中所4吏用的核酸编码IspS 多肽，其包含SEQIDNO: 2之C端的45。/。，并保持了催化二曱基烯丙 基二磷酸(DMAPP)转化为异戊二烯的活性。也有其它实例，其中在一 种微生物(例如绿色#^见藻类)中的相关蛋白质缺少所述蛋白质N端的基 本部分(相对于例如细菌的另一种微生物中存在的蛋白质形式)，但对活 性没有有害作用(参见，例如Melis和Happe， Plant Physiol. 127: 740-748， 2001 )。因此，在一些实施方案中，本发明中所使用的IspS核酸编码包含 SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 8的从约330号氨基酸残基到C末端的多 肽。在一些实施方案中，IspS核酸编码的IspS多肽包含SEQIDNO: 2或 SEQ ID NO: 8的从约300号氨基酸残基到C末端的多肽。在一些实施方 案中，IspS序列可以另外缺少SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 8的最后 10、 15或20个残基。
IspS蛋白质的转运肽最低限度地包含1-37号氨基酸(对于杨树和山杨 树)以及l-45号氨基酸(对于葛藤)。据此分析，成熟的蛋白质以氨基酸 序列"CSVSTEN..."等起始。本发明中所使用的IspS核酸序列不需要包含 编码转运多肽的序列，并且还可以省略额外的N-末端序列。例如，实施例部分所提到的Ss-IspS构建物缺少编码合成基因DNA中的52个氨基酸。 IspS蛋白质的合成和积累没有影响。
在本发明的一些实施方案中，使用编码杨树或山杨树IspS多肽(例如， SEQ ID NO: 2)的核酸序列，在另外一些实施方案中，使用编码葛藤IspS 多肽(例如，SEQ ID NO: 8)的核酸序列。由本发明的方法中所用核酸 编码的IspS多肽具有催化DMAPP转化为异戊二烯的活性。通常地，活性 水平与杨树或山杨树IspS多肽(例如，SEQ ID NO: 1所编码的)或天然 葛藤IspS多肽(例如，SEQ ID NO: 7所编码的)所显示的活性相当。
示例性Dxs和Dxr序列包括美国专利申请No. 20030219798所公开的 Dxs和Dxr的核酸和多肽序列，例如，衣藻(CMfl附j^tow卵fls)的序列。 美国专利申请No. 20030219798中的Dxs和Dxr序列以引用形式并入本文。
可采用多种技术来实现A/;51、 或"jcs多核苷酸序列的分离和生成。 该技术的克隆和表达在有关IspS基因的部分中有所涉及。然而，也可以采 用同样的技术分离和表达Dxr或Dxs多核苷酸。例如，基于本文所公开序 列的寡核苷酸探针可用于从所需植物物种的cDNA或基因组DNA文库中 鉴定所需的多核苷酸。然后可以使用基于所克隆的IspS基因序列(例如 SEQ ID NO:l或SEQ ID NO:7)的探针筛选这些cDNA或基因组文库。探 针可以用于与基因组DNA或cDNA序列杂交，以分离相同或不同植物物 种中的同源基因。
可替代地，可使用扩增技术从核酸样本中扩增目的核酸。例如，可以 采用PCR直接从mRNA、 cDNA、基因组文库或cDNA文库中扩增所述基 因的序列。PCR和其它体外扩增方法也可例如用于克隆编码待表达的蛋白 质的核酸序列，用于制备用作检测样本中期望mRNA存在情况之探针的核 酸，用于核酸测序中或其它一些目的。
可以从本文所提供的序列比较中产生用于从植物细胞(例如杨树或另 一落叶树)中鉴定IspS基因的合适的引物和探针。对PCR技术的整体概 述可以参见PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, (rnnis， M, Gdfand， D.， Sninsky， J. and White, T.， eds.)， Academic Press, San Diego (19卯)。在实施例中提供了用于扩增IspS核酸序列的示例性的PCR。
本发明中所使用的IspS核酸序列的种类包括用例如杂交和/或序列分 析的技术使用示例性核酸^列(如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 7)和蛋白质序列(如SEQIDNO: 2或SEQIDNO: 8)鉴定或表征的基因和或基 因产物。
重组载体的制备
为了在上述的技术中使用分离的序列，制备了适于绿藻、蓝细菌和光 合或非光合细菌细胞转化的重组DNA载体。转化的技术是众所周知的， 并在科技文献中已有说明。例如，编码/s/^基因的DNA序列(在以下内 容中会进一步详细说明)可以与转录调控或其它调控序列结合，这些序列 会指导来自该基因的序列在转化的藻类、蓝细菌或细菌中的预期细胞中进
行转录。在一些实施方案中，包含了含有/^y基因^达盒的表达载体还
包含有效连接于75/^基因上的启动子。在其它一些实施方案中，指导/^S" 基因转录的启动子和/或其它调控元件对该微生物而言是内源性的，并通过
例如同源重组引入包含/^S基因的表达盒，从而异源T5/;5"基因与内源启 动子有效连接，并由内源启动子驱动表达。
调控序列包括可以是组成型或者可"i秀导型的启动子。在一些实施方案 中，启动子可以在环境条件改变的影响下用于指导/s/^核酸的表达。可影 响可诱导型启动子转录的环境条件的例子包括厌氧条件、升高温度或存在
光。在暴露于化学试剂时可诱导的启动子也可用于/^y核酸的表达。其它
有用的可诱导调控元件包括铜-诱导型调控元件(Mett et al， /Voc A^/.
USA 90:4567-4571 (1993); Furst" CW/ 55:705-717 (1988));四 环素和氯-四环素-谦导型调控元件(Gatz " "/.，户/"W丄2:397-404 (1992); R6der C A/o/' 243:32-38 (1994); Gatz， AfW/i. CW/
50:411-424 (1995));蜕皮素资导型调控元件(Christopherson W 胸/. USA 89:6314-6318 (1992); Kreutzweiser W fl/，
五mwVwi. 28:14-24 (1994));热应激诱导型调控元件(Takahashi"
户/"W户/i"/0/. 99:383画3卯(1992); Yabe " iVfl^ CW/ TV^s/o/. 35:1207-1219 (1994); Ueda W /, Afo/. GWi. G^fi". 250:533- 539 (1996));以 及乳糖操纵子元件，其与组成型表达的lac阻抑蛋白一起用于提供例如 IPTG画诱导型表达(Wilde W "/，五AffiO / 11:1251-1259 (1992))。诱导型调 控元件也可以是例如从菱菜硝酸盐还原酶基因中衍生的(Back W"/., i，/fl^ AW. 17:9 (1991))硝酸盐-诱导型启动子，或光-诱导型启动子如与 RuBP羧化酶的小亚基或LHCP基因家族有关的启动子(Feinbaum W /.,ikfe/ GWi. G^/iW. 226:449 (1991); Lam and Chua, 5We"" 248:471 (19卯))， 或光。
在一实施例中，可以使用对光有反应性的启动子序列来驱动引入到暴 露于光的衣藻(C7f/fl附j;^wo"fls)中的/sp51核酸构建物的表达(例如， Hahn， Cm t Ge/i" 34:459-66,1999; L叩pes, /VflWMo/fi/< / 45:215-27, 2001; Villand，5/oc/ie附/327:51-7， 1997)。也可以4吏用其它光-诱导型启动子系 统，例如光敏色素/PIF3系统(Shimizu曙Sato, 7V"f丑,V tecA/^/ 20):1041國4， 2002 )。另外，可以采用对热有反应性的启动子来驱动藻类(如衣藻 (CMi附j^"腳腿))中的表达(Muller, G謝111: 165-73, 1992; von Gromoff，Mo/CW/所o/9:3911-8， 1989)。其它的启动子，例如在藻类(如绿 微观藻类)中的表达，包括RbcS2和PsaD启动子(参见，例如，Stevens" /， MoZ G饥G^威251: 23-30, 1996; Fischer & Rochaix, Af。/ G謝f GWio附/cs 265:888-94， 2001 )。
在一些实施方案中，启动子可来自与待转化物种或另一物种中的光合 成有关的基因。例如，来自一个物种中的这种启动子可以用于指导经转化 藻类细胞或另一光合水生生物细胞中的蛋白质表达。可基于来自其它光合 生物的已知序列来分离或合成出合适的启动子。优选的启动子是来自其它 光合物种的与待转化水藻宿主的光合基因同源的基因的那些。例如，已在 三角褐指藻(/，/^e<w/flc&/"m加Vw7iw似附)中鉴定出一系列来自褐藻素叶 绿素结合蛋白的光捕获启动子(参见例如Apt, W fl/. MoJ 252:572-579,1996)。在其它一些实施方案中，可以采用类胡萝卜素叶绿体 结合蛋白质启动子，例如多曱藻(黄)素叶绿素结合蛋白质启动子。
在一些实施方案中，用于驱动异源A/^基因表达的启动子为组成型启 动子。用于銜現藻类中的组成型强启动子的例子包括例如《^4、 fl^B和 Wd基因的启动子。也已知在蓝细菌中有活性的多种启动子。这些启动子 包括，如蓝细菌中的/;^A 基因(组成型)启动子和例如美国专利申请 No. 20020164706中所提到的那些启动子，它们都以参考形式并入本文。也 可以在藻类中使用其它一些在植物中有效的启动子，例如，来源于植物病 毒中的启动子，如CaMV35S启动子。
在一些实施方案，通it^t相应于A/^基因的基因组克隆的5'端序列进 行分析来鉴定启动子。启动子序列的特征性序列可用于鉴定所述启动子。启动子可以通过例如测试启动子在期望引入/s/^表ii^J建物的植物细 胞例如绿藻中驱动表达的能力进^Sf价。
包含75/75*核酸序列的载体通常会包含能够赋予藻类或细菌细胞可选择 表型的标记基因。这些标记都是已知的。例如，所述标记可以编码抗生素 抗性，例如卡那霉素、G418、博莱霉素、潮霉素等等的抗性。在一些实施 方案中，用于衣藻的选择标记可以是具有壮观霉素抗性(Fargo, Mo/ CW/ 说W 19:6980-卯，1999)、卡那霉素和阿米卡星抗性(Bateman, Ge/fC 263:404-10, 2000 )、 zeomycin 和腐草霉素抗性(Stevens,肠/ Ge" 251:23- 30， 1996 )、巴龙霉素和新霉素抗性(Sizova， (7e"e 277:221-9, 2001)的标记。
本发明中的/s/^核酸序列在微生物中(例如銜见藻类、蓝细菌或者光
合或非光合细菌)重组表达。如本领域技术人员所理解，可以考虑如i5/^ 核酸将在其中表达的微生物的密码子用法频率等性质来设计表达构建物。
可釆用已知的方法(参见，例如，NakamuraWfl/.JVi/c/.J"Vfei d 28:292， 2000 )列出密码子用法频率表。密码子用法频率表，包括^Jf见藻类和蓝细 菌的那些表，也可以从本领域中获得(例如，在KazusaDNA研究所的植 物基因组研究部的密码子用法数据库中，www,kazusa,or,jp/codon )。
细菌和蓝细菌的细胞转化方法以及选择标记在本领域中是众所周知的 (Wirth， A/o/G^iC 1989 March; 216(1):175-7; Koksharova， J/ / / Af/cn^/o/丑/otec/mo/ 2002 February; 58(2): 123-37; Thelwell )。用于细菌的 转化方法和可选择标志物也是众所周知的(参见，例如，Sambrook""A， sw/;ni )。
在微观藻类(如绿色微观藻类)中，其核、线粒体和叶绿体基因组通 过多种公知的方法转化，包括通过微粒轰击或使用玻璃珠的方法(参见， 例如，Kindle, / CW/ fi/r / 109:2589-601, 1989; Kindle, A^/爿cflrf 5W USA 87:1228-32， 19卯；Kindle, 7Voc iVW/USA 88:1721-5, 1991; Shimogawara， GewWcs 148:1821-8, 1998; Boynton, Sc/^i" 240:1534-8, 1988; Boynton， M^/wA五"z^附o/ 264:279-96, 1996; Randolph-Anderson, MoJ Ge 236:235-44， 1993 )。在一些实施方案中，将/，S基因引入
到銜见藻类的叶绿体中。在其它实施方案中，将/s/;51基因引入到细胞核中。
本文中所述的用于在銜!见藻类、蓝细菌或者光合或非光合细菌中获得
21和表达/sp51核酸序列的技术也可以用于表达Z)at或核酸序列。
可以作为目标的微生物
A/^可以在期望在其中生产异戊二烯的多种孩吏观藻类(如绿藻)、或蓝 细菌、或者光合或非光合细菌中表达。表达异源7s/^基因的经转化的微观 藻类、蓝细菌或细菌(光合细菌或非光合细菌)在用于烃类(例如，用作 燃料来源或合成化学的原料)生产的大目培养的条件下培养。经转化的
生物体在提供容纳所述烃类的密闭环境的生物反应器或发酵罐中培养。在 大自培养的典型实施方案中，所述微观藻类、蓝细菌或细菌在密闭的反
应器中生长，其容量为至少约500升，通常为至少约1000升或更大，在一 些实施方案中，其容量为约1000000升或更大。
在一些实施方案中，/s/^在微观藻类中表达。藻类等是指属于菌藻植 物门藻亚门的植物。所述藻类是单细胞的光合生氧藻类，它们是非寄生植 物，无根、茎、叶；它们包含叶绿素并且大小各异，>^銜见级别的到大型 的海藻都有。具有叶绿素a和叶绿素b的生氧光合单细胞真核生物的绿藻， 属于真核生物(Eukaryota )-植物界(Viridiplantae )-绿藻门(Chlorophyta) -绿藻纲(Chlor叩hyceae )，通常^l^优选的靶标。例如、/s/^可以在莱侖衣 藻(C. mVi/i"f浙/)中表达，其分类为团藻目(Volvovales)-衣藻科 (Chlamydomonadaceae)。本发明中可以用到的藻类林包括，例如，莱茵 衣藻(CM鹏j^wio憩s1 m7i/^n/板)、斜生樹藻(5^w^fes附ws1 oA/一ws)、 小 球藻((7似01^//" w/g"n's)、布朗葡萄藻(fiWf"a ccMS 6m簡//) 、 5W，C0ccws
SMflfeftV^ 、 盐生杜氏藻(2>"腦//"〃" 5 //聰)和雨生红球藻(份fl挑"似"07"51
大皿培养藻类的方法是已知的。例如，藻类可以生长于高密度光生 物J^应器(参见，命J如,Lee & fl/"5/0e"g/weenVig 44:1161-1167， 1994; Chaumont， J^/;/ /. iV^c"/^j; 5:593-604， 19卯)、例如那些用于污水或 废7JC处理的生物反应器(例如，Sawayama " j/7p/. 丑/ofec/i" 41:729-731,1994; Lincoln, De Z/iVi^&m^ (Monaco),
12:109-115,1993 )，其可以大，涪养用于从受污染的水中消除重金属(例 如，Wilkinson, 5,》tec/i. i^股rs, 11:861-864， 1989 )，可以大M^培养以用于 生产P-胡萝卜素(例如，Yamaoka， 5W6wtew-A(^flA:M J^/W/, 72:111-114， 1994)、氢气(例如，美国专利申请No. 20030162273 )和药物化合物(例如，Cannell, 1990 )、以及人和动物使用的营养补充剂(Becker, 1993， 丑w,/C/zi Dd'/"s故"f 6>mi ogm/7/r/《Me (Monaco), 12， 141-155 )和生产其它 有营养价值的化合物。
以上出于示例性目的所说明的培养表达/^51的藻类或细菌的条件在本 领域中是已知的(参见例如本文中引用的示例性参考)。可以采用已知的 技术收集由^it过的微生物所生产的挥发性异戊二烯烃类。异戊二烯烃类 不能与水混合，它们上升至并飘浮于微生物生长培养基的表面。从该表面 将它们吸取后放置于合适的容器内。另外，根据微生物大M^莫培养时的主 要温度，异戊二烯可以在反应器容器内的^养基上以蒸气形式存在(异 戊二烯的沸点为T=34。C)。从生物反应器容器内将异戊二烯蒸气抽走并通 过冷却或低程度压缩将其凝结成为液体燃料形式。
实施例
本文中所描述的实施例是以说明性的方式而非限制性的方式提供。本 领域中的技术人员会很容易了解可以改变或修改多个非关键参数以获得 本质上相似的结果。
实施例1.用于在微观藻类中生产异戊二烯烃类的新型Cr-IspS基因的 i殳计和表达
根据已知的核编码的银白杨(i^/^/ws "/6fl)"异戊二烯合酶"IspS蛋白 质序列，生成了调整了密码子的合成DNA构建物。采用该M酸序列(SEQ ID NO: 2 )作为模板用于从头设计/s/^DNA序列以用于在模式微观藻类 莱茵衣藻(C似fl附j;甴附卵fls fr!7i/^n/故)的叶绿体中表达所述基因。出于 本发明的目的，将该基因称为0-75pS。该基因的特征包括(l)密码子用 法不同于杨树的密码子用法，并具体地选择成适合莱茵衣藻 (C7i/fl附jvto附oiifls fe/"/mn/故)叶绿:体的密码子用法；(2 ) >^新型O-A/^ 基因的设计中省略了所述蛋白质的杨树叶绿体靶向序列。(3)将编码血凝 素(HA)表位标签的经过密码子优化的基因的三个拷贝融合到所述75/;X 基因的上游。
CV-A/^ DNA序列(SEQ ID NO: 3 )设计成特异性地在^UC藻类(如 莱茵衣藻(CM"附j;^附^w^ "/"/iflnfti7))的叶绿体中编码异戊二烯合Sl^
23白(SEQIDNO: 4)。根据莱茵衣藻(CM"wy;^附做"s "/"Afln/放)叶绿 体6803的密码子用法表，调节了用于在衣藻(C7f/"附，yrfo附卵fls)叶绿体中 表达所述基因的密码子用法，所述的密码子用法表列于以下链接 http:〃www.bio.net/bionet/mm/chlamv/1997-March/000843.htm1.
SEQIDNO: 4也包含血凝素标签的三个拷贝，其在该序列的N-末端 一侧用下划线标出。在0-is/^DNA序列的末端引入限制性内切酶的识别 位点以方便克隆该基因，合成整段序列并克隆到载体质粒中。
生成了表达密码子优化的重组异戊二烯合酶基因(0-75/^)的转基因 莱茵衣藻(CMfl附j^o附o"fls wViAflnft,7)叶绿体。该过禾呈是通过构建包含 fl伊J启动子(PatpA)的嵌合基因(图4上部，实现的，所述启 动子融合至密码子优化的三拷贝血凝素(HA)表位标签DNA的5，UTR 末端(图4)。该DNA序列之后是CV-i5/^编码区(图4)，再之后是fl伊J 3'UTR(图4， TatpA)。通过使用基因枪转化和同源重组实现所构建的嵌 合基因在莱茵衣藻(CM"附jvto附o"flsre/"Aflf浙7)叶绿体基因组中的整合， 其要求转化载体和叶绿体基因组之间的序列同源性(Boynton Wfl/.， 240:1534-1538,1988)。出于此目的，采用了载体p322，其包含用作同源重 组耙标的部分莱茵绿藻(C似fl附j;^附""^ M/"/^MYfe7)叶绿体基因组
(Franklin C iV朋Z / ， 30:733-744, 2002 )。如图4中所示，将嵌合0-75/75" 基因连接至p322的BamHI位点以生成质粒pApISAt。通过颗粒轰击
(Boynton " a/" 5We/ice， 240:1534-1538, 1988 )的方法，将所述pApISAt 构建物与包含赋予壮观霉素抗性(Franklin " "/., /，/aW /.， 30:733-744， 2002 )的经修饰16S核糖体基因的质粒p228共转化到莱茵绿藻
(CM"附j;^附卵fls r"7i/ifln/故)CC503林的叶绿体中。图4中的引物N和 C标记用于后续在分离的壮观霉素抗性转化体中进行PCR筛选的引物的 退火位置。
图5.提供了对原代转化体进行基因组PCR筛选分析的例子，将所述原 代转化体在包含壮观霉素的培养基上进行筛选以检查嵌合基因的 N-末端或C-末端区域是否存在，从而筛选莱茵衣藻(C. mVi/ifln/故)0-75/^ 转化体。对超过100个莱茵绿藻(《/"附>^ 附< "^ w/"/^/vfc7)的壮观霉 素抗性转化体集落进行了分离和测试，从中发现了两个独立的林系(#9和 #20 )在其叶绿体DNA中明确包含稳定整合的O- 75/^基因。采用 一个壮 观霉素抗性转化体(#7，未显示)作为PCR分析的阴性对照，并将pApISAt质粒做为阳性对照的^^L。引物N和C代表用于扩增的引物，图4示出了 它们的退火位置。
用BamHI对来自莱茵衣藻(C7i/fl附j^o附柳fls ir/"/ifln^/)对照(#7 ) 和推定的O- /^S1转化体#9系的基因组DNA进行消化，并在琼脂糖^ 上分离，进行Southern印迹分析以检测0-A/^转基因的完整性。与CV-A/^ 编码区的放射性标记的Ndel/Xbal片段的杂交鉴定出在0*-/s/^转化体#9 系中特有的 3.0kbp的条带，而在#7对照系的泳道上没有观察到可检测到 的条带(图6A)。这些结果验证了在莱茵衣藻(C7f/"附j^附卵"sfW"/i"nft//) 转化体#9系的叶绿体基因组中稳定整合了 0-/s/^，并与PCR分析的结果 一致(图5)。对琼脂糖皿进行溴化乙锭染色(图6B)以确定有等量的 DNA加载。在转化体#20系中也得到了相似的结果(未显示)。
为了证明O-is/^基因表达，用Western印迹分析(图7)证实了在莱 茵衣藻转基因#9系中Cr-IspS蛋白的积累。采用抗-HA标签抗体U-HA) 检测重组Cr-IspS蛋白的存在及其细胞浓度。将血凝素(HA)标签的三拷 贝引入至编码成熟蛋白质的OJs/^基因之前的位置(图7A)，用作检测 Cr-IspS蛋白积累的方便的表位。在50mMHEPES緩冲液(pH7.0)中， 将莱茵衣藻细胞浓缩至50(^106个细胞/毫升，并用玻璃珠搅拌5分钟进行 破碎以释放叶绿体的可溶性级分。用特异性多克隆抗血凝素抗体，对相当 于10或20照叶绿体的可溶性蛋白质级分进行SDS-PAGE和western印迹 分析。在加载了来自莱茵衣藻(C7ita^to附tm"s m>i/^inft,7)转化体弁9系 的样品的泳道中约67 kD条带处观察到了明显的抗体蛋白质交叉反应，但 在对照中(C#7)未观察到(图7B)。另外，在约38 kD处也观察到了抗 体蛋白质交叉反应，如图5B中加星号处所示。38kD条带的Cr-IspS蛋白 的积累可能表示0-75/;5 mRNA翻译的提前终止，或对所述重组蛋白质的 特异性降解活性。在对照泳道(C#7)中没有可检测的67kD或38kD条带。 对应于34kD蛋白质的明显交叉反应可能是针对莱茵衣藻(C7i/fl附j;^w卵fls 蛋白质的第一或第二抗体的非特异结合。在转化体#20系中也 检测到了 Cr-IspS蛋白(未显示)。
实施例2.用于在蓝细菌中生产异戊二烯烃类的Ss-IspS基因的设计和表
逸
为了在蓝细菌中表达产生异戊二烯烃类，基于银白杨(i^/m似sfl/M)
25的已知异戊二烯合酶IspS蛋白序列生成了调整了密码子的合成DNA构建物。使用此M酸序列作为模板从头设计/sp51 DNA序列用于在蓝细菌(如集胞藻(^""/^o;s船sp.))中表达所述基因。根据集胞藻(5y""/^qv幼:s)PCC 6803的密码子用法表，调整了用于在蓝细菌中表达基因的密码子用法，所述密码子用法表列于以下链接http:〃gib.genes.nig,ac.iD/single/codon/main.php spid=Svne PCC6803。
本文中所述调整了密码子的基因是指5^-^^。该基因的特征包括(1)密码子的使用不同于杨树的密码子用法，其具体地选择为适合集胞藻(5y麼c/^o^/s)的密码子用法；(2)在新的5^-A/^基因的设计中省略了所述蛋白质的杨树叶绿体耙向序列。所述DNA序列^t设计成特异性地在蓝细菌(如集胞藻(5>mc/^o^&))中编码异戊二烯合酶蛋白质。SEQIDNO: 5的第一段下划线序列代表(反向互补)P-内酰胺酶基因，而第二段下划线序列是5^/s/^ DNA。另外，斜体序列为起始和终止密码子，加粗的序列为克隆用限制性位点。在新i殳计的5^-75/^DNA序列的末端引入限制性酶识别位点以帮助克隆所述基因，合成所述整个序列并克隆至载体质粒中(图8)。
将经过密码子优化、长度调节且化学合成的5^/s/^基因克隆至集胞藻(5y""/ioo;幼's)的/w^43启动子区的下游，与/w^43基因的ATG起始密码子同一读码框。^-A/;5"基因之后是转录终止子和庆大霉素抗性盒，其后是紧接在戸M5基因下游的集胞藻(5y""力"c^他)序列。
该新的构建物允许同源重组，即经双重同源重组通过替换内源戶^43基因，DNA序列插入到集胞藻基因组中(图10)。可以釆用庆大霉素(Gm)作为选择标记来选择集胞藻(^"ec/^o^/s)转化体，强的启动子驱动基因的表达。
为了用5^-/spS构建物转化集胞藻(^""/^o^/s )，集胞藻(^""/^o;幼's sp.)细胞生长于存在5 mM葡萄糖的基本BG11生长培养基，直到细胞密度达到约5(^106个细胞/亳升(0073。=0.5)。接着收集细胞并浓缩至101()个细胞/亳升，与pAIGA质粒混合用于转化并孵育4-6个小时，然后将混合物涂布在含BG11的琼脂平板上的滤膜上，所述平板还含有0.5Hg/mlGm、 0.3%硫代硫酸钠和10mMTES-NaOH， pH8.0。
将Petri平板在低光密度下保持1-2天，随后转移到正常生长M。每周一次将滤膜转移到包含庆大霉素的新鲜平板上。分离Gm选择标记存在下形成的菌落，然后重新在新鲜滤膜上划线，随后在存在Gm的连续选择条件下，将其转移到液体BG11生长培养基中。
实施例3.大肠杆菌中带组氨酸标签的/幼S的表达
为构建在大肠杆菌中表达带组氨酸标签的/sp5"基因的载体，使用引物IspS一F一NdeI， 5，-CTGGGTCATATGGAAGCTCGACGAA-3'
和IspS_R_HindIII， 5，-ATGGAAAACCTGAAGCTTTTAACGTTCAA-3，；通过PCR^T增经过密码子优化用于在蓝细菌中表达的DNA,其分别在所U因5'和3，末端引入Ndel-位点和HindlII-位点。使用这些位点将所述基因克隆至pET1529表达载体内构成栽体pETIspS,所述栽体pETIspS携带了位于蛋白质N-末端的组氨酸标签(图11 )。
为了证明在大肠杆菌中重组的带组氨酸标签的的表达，用pETIspS质粒转化大肠杆菌，所絲粒包含5^/s/^基因和位于A-75/^基因5，未端的组氨酸标签编码DNA。加入0.1 mM IPTG到液体细胞培养物中诱导该His-5^-/s/^基因在大肠杆菌中的成功表达。收集细胞并通过SDS-PAGE和考马斯染色分析其蛋白质含量(图12 )。证明了携带pETIspS质粒的所有克隆表达 65 kD的His-5^-7s/^蛋白质(图12， ~ 65 kD条带)。
釆用经过密码子优化而在单细胞绿藻(如莱茵绿藻(C7m附j7^附o舰sM/"Aanfe7))中表达0-/^75*基因也类似地进行了细菌(如大肠杆菌)中7sp51基因的表达和重组IspS蛋白质的积累的相似工作和证明(结果未显示)。
本说明书中引用的所有出版物、登录号和专利申请以引用形式并入本文，每个单独的出版物或专利申请都是具体地并单独地指明以引用形式并入本文。
示例性IspS序列
SEQ ID NO:l银白杨(户o/7"/ws "/6")异戊二烯合酶的cDNA，登录号No.AB198180<formula>formula see original document page 28</formula>1021gtaaca^tcsttgatgatatctatgatgtttatggtactctggacgagttggagctattt
1081acagatgctgttgagagatgggatgttaatgccatcaatgatcttccggattatatgaag
1141ctctgcttcctagctctctacaacactatcaatgagatagcttatgacaatctgaaggac
1201ssgggggaaaacattcttccatacctaacaaaagcgtgggcagatttatgcaatgcattc
1261ctacaagaagcaaaatggttgtacaataagcatttgatgactatttcgga
1321aatgcatgga33tC3tCCtCagggcctcttcaactagtttttgcctactttgccgtggtt
1381agaaagaggaaattgaaaacttacaaaagtatcatgataccatcagtagg
1441ccttcccacatctttcgtctttgcaacgacctggcttcagcatcggctgagatagcgaga
1501ggtgaaacagcgaattctgtatcatgctacatgcgtacaaaaggcatttctgaggagctt
1561gctactgaatccgtaatgaacttgatcgacgaaacctggaaaaagatgaacaaagaaaag
1621cttggtggctctttgtttgcaaaaccttttgtcgaaacagCt3tt33CCttgcacggcaa
1681tcccattgcacttatcataacggagatgcgcatacttcaccagacgagctaactaggaaa
1741cgtgtcctgtcagtaatcacagagcctattctaccctttg
SEQ ID NO:2银白杨(i^/ w/ws 异戊二烯合酶的多肽序列(来自登
录号No. AB198180 )。所述蛋白的下划线部分表示叶绿体转运肽。
MATELLCLHRPISLTHKLFRNPLPKVIOATPLTLKLRCSVSTENVSFTETETEARRSAN
DQNGNFLENLKEDIKAILSLYEASFLALEGENILDEAKVFAISHLKELSEEKIGKELAE
ETSRWWRRVGLATKLHFARDRL正SFYWAVGVAFEPQYSDCRNSVAKMFSFVT皿D
IYDVYGTLDELELFTDAVERWDVNA函LPDYMKLCFLALYNTINEIAYDNLKDKGE
NILPYLTKAWADLCNAFLQEAKWLYNKSTPTFDDYFGNAWKSSSGPLQLVFAYFAV
VQNIKKEEffiNLQKYHDTISRPSHIFRLCNDLASASAE證GETANSVSCYMRTKGISE
ELATESV画LIDETWKKMNKEKLGGSLFAKPFVETAINLARQSHCTYHNGDAHTSP
DELTRKRVLSVITEPILPFER
SEQ ID NO: 3用于在单细胞绿藻中进行转化/表达的Cr-IspS基因和血凝素标签。/s/^核苷酸序列由下划线"CCA"密码子开始
说明书第27/32页
AAAACTAGTTTACATGGTACTGCTTTAAGTTTTCGTTTACTTCGTCAACATGGTTTTGAAG
GGTTATATAATAAATCAACACCAACATTTGATGATTATTTTGGTAATGCTTGGAAAAGTTCATCTGGTCCATTACAATTAGTTTTTGCTTATTTTGCTGTTGTTCAAAATATTAAAAAAGA
TACAGAACCAATTTTACCATTTGAACGTTAA
SEQ ID NO:4用于Oi5/;51异戊二烯合酶基因的多肽序列。下划线表示血凝素HA标签的三个拷贝。该异戊二烯合酶序列缺少杨树IspS蛋白序列的叶绿体靶向序列。该IspS序列由"CS......"开始，如字体的改变所示。
FVSSGGFDAVTKTSLHGTALSFRLLRQHGFEVSQEAFSGFKDQNGNFLENLKEDIKAILSLYE ASFLALEGENILDEAKVFAISHLKELSEEKIGKELAEQVNHALELPLHRRTQRLEAVWS正AY
KSSSGPLQLVFAYFAWQNIKKEE正NLQKYHDTISRPSHIFRLCNDLASASAEIARGETANSV
SCYMRTKGISEELATESVMNLIDETWKKMNKEKLGGSLFAKPFVETAINLARQSHCTYHNGD
AHTSPDELTRKRVLSVITEPILPFER
SEQ ID NO:5 5^-/^5 DNA以及用于蓝细菌的质粒pIspS的核普酸序列。 SEQIDNO:5的第一个下划线序列表示(反向互补)p-内酰胺酶基因，而 第二个下划线是Ss-IspS DNA。另外，斜体序列A^始密码子和终止密码 子，粗体序列是克隆用限制性位点。
>pIspS
gccttctgcttagtttgatgcctggcagttccctactctcgccttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgct cggtcgttcggc仁gcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggata
tccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggac
tctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctgg
31aagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctag
二c
gtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaa agcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggc agcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtc attctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatag
atccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtg
aaataaacaaataggggtc atatggctcataac
ggtccatgrgaagctcgacgaagcgctaattatgaaccaaatagttgggactacgattttctattatcctctgata cggatgagtccat
cgaccgcactcagttttcggctattacgtcaacacggtttcgaagtgagtcaagaggcgtttagtggcttcaaag atcaaaatggcaattttctggaaaacttgaaagaagacacaaaagctatcctaagtttatacgaagctagttttc
aaaagattggcaaagaactcgccgaacaggtaaatcacgccttggaactgcccctccatcgtcgtacccaacgat tggaagctgtgtggagtatcgaagcctatcgcaagaaagaagacgctaaccaagttttgttggaactggccatct tggattataacatgattcaatccgtatatcsigcgcgatctacgtgaaacgtctcggtggtggcggcgtgttgggc tcgctactaaattacattttgcaaaggatcgactcattgaatccttttattgggccgtcggggtggcttttgaac cccagtacagcgattgccgtaattctgtagcaaaaatgttttctttcgttacaattattgatgacatttatgacg tttacggcaccctcgacgaactggaattgttcactgacgctgtggaacgttgggacgtaaatgccattaatgacc tgccagattacatgaagttgtgttttctcgcgttatataacaccattaatgaaattgcatacgacaatttaaagg
tccaactgatttttgcttattttgcggtagtacaaaacattaagaaagaagagattgaaaatttgcaaaagtacc
gtggcgaaacagctaatagtgtgagttgttacatgcgcacaaagggcatttccgaagaactagctacggaaagtg tcatgaacctgattgacgagacttgcaagaaaatgaataaggaaaaattgggcgggtccctatttgccaaaccct
atgaattaacccgtaaacgagttctgtctgtgattactgaacccattttgccctttgaacgttaaaagtaacagg
SEQ ID NO:6来自蓝细菌质粒的预期65kD翻译后Ss-IspS蛋白的^&酸
32序列
1MEARRSANYEPNSWDYDFLLSSDTDESIEVYKDKAKKLEAEVRREI丽EK
51AEFIiTLjIiEIiIDNVQRIjGIiGYRFESDIRRALiDRFVSSGGFDGVTKTSLHAT
101ALjSFRIiljRGHGFEVSQEAFSGFKDQNGNFIiENLKEDTKAIIjSIjYEASFIjA
151LjEGENIIjDEARVFAISHLjKELSEEKIGKELAEQVNHALELPIjHRRTQRIjE
201AVWSIEAYRKKEDANQVIjliELAILDYNMIQSVYGRDLiRETSRWWRRVGIA
251TKLHFAKDRLIESFYWAVGVAFEPGYSDCRNSVAKMFSFVTIIDDIYDVY
301GTLDEIjELFTDAVERWDVNA工NDLPDYMKLCFLALYNTINEIAYDNLKDK
351geni:lpyIjTKAWADLCNAFIjQEAKWLYNKSTPTFDDYFGNAWKSSSGPLG
401LIFAYFAWQNIKKEEIENLQKYHDIISRPSHIFRIjCNDIjASASAEIARG
451ETANSVSCYMRTKGISEEIjATESVMNLIDETCKKMNKEKIjGGSIiFAKPFV
501ETAINLARQSHCTYHNGDAHTSPDELTRKRVLSVITEPIIjPFER*
SEQ ID NO :7山葛膝野变种(i^min'fl附卵," v"r. 涵似)异戊二烯合酶 (IspS);登录号AY316691 (完整cds.) .atg起始密码子由下划线表示， 其表明cDNA的蛋白质编码区域的起点。1 aatcaatata taatatttac ggaagatttg 61 ccctgcataa aataattgtg gtcaccgtac 121 actagcaagc aaggtataat cattcatcta 181 caattttcgt gtgttttatt ttagtgtcct 241 atggcatcgc aattttagag catatcattg 301 gtctaataaa ttatcgtccc ccacaccaac 361 cttcatcaca caaaaaacat ctcttgccaa 421 gagctctcaa tttacccaaa taacagaaca 481 aaacctctgg aattttgaat ttctgcagtc 541 tatattccag ttaatttttc tttttttctt 601 gaaagtattt tttttatttg cacttttaat 661 tctattcatt ttcaaaattt tacatagaaa 721 attttcatta tttctcaaat caaacggtat 781 cttttaattt tattttttta caataatggg 841 gttatttttt ttttataata ttgttcttat 901 agagaaggca acaaagctag aggaggaggt 961 accattaagc ttactagaat tgatcgacga 1021 tgagaaggac ataatcaaag cccttgagaa 1081 taaaagtgac ctccatgcta ctgctctcag 1141 ggtttcccaa ggtatttatg tatatatatg 12 01 atattatgat tcactgacca tgcatgtggt
12 61 gagggaggtt tcagtggtga acttaaaggt 1321 gcatcctatc ttggctttga gggagaaaat
13 81 acacatctca agaacaacct aaaagaagga 1441 catgcactgg aacttcccta tcatcaaaga 1501 gacaaatatg aaccaaagga accccaccat 1561 ttcaatatgg tgcaaacatt gcaccagaaa 1621 tcaattctca agtaattatt acctcataag 1681 agagatttcc aattaaaaat taacatacga 1741 tactaatgaa atatatgcta ggtggtggac 1801 tgtccgagac agattaatgg aagtgtattt 1861 attcggtgaa tgtcgtaaag ctgtcactaa 1921 tgtatatgac gtttatggta ctttggatga 1981 gttcgtaatt gatttcagtc tcgattcagt 2 041 acttgcgtac atgcatacac acagatggga 2101 catgaagttg tgcttcctag cactttataa
atgcctttcc tgattttaat ttatttttat actgttcttg tcacttggac aagaaatttg aacttatggt gatttattgc cccacctcat tggatcctcg ttccaatata aaaggagaac aaaagtcatg gcaaccaacc ttttatgctt accaagtact agatttccac aaagtaagaa tcccaaacct tggcgagtta tttgtgctac taatagtcgg cgttcagcta attaccagcc tctggaaaat gaccttaagg tgattataca ttgtgatttt taaggaatca tttagtttgg tataaaaatg ttatatcatt ttcacttttt acagtaaatt ttttattttt tttattttct taaagcataa acaaagaaat taatattgtt aacgattata tattaggctg accttaataa tgtaacctaa cgacaggtgg aaaaactaga acgatgcatg atcaacagag tagacacaca tgtccagcgt ctaggattga cctacaagtt tattgttttg ctggatgaga ataagaaaaa cttccgttta cttagacaac atggctttga ttacccactt agcaacatat atatatatat gcagatgtgt ttgagagatt taaggacaag gatgtgcaag ggttgctgag tctatatgaa ctcttggagg aggcaaggac attttcaata ataaacacca aagtggcaga acaagttagt ttgcatagac tagaagcacg atggttcctt cagttactac tcgagcttgc aaagctagat gaactgcaag acctgtcaag gttagaaatt aaattaaata acaataacaa tattgagtgt gaggatcaat atatattctt aggtatgtgg ggagatgggg ctagcaagca agctagactt ttgggcgttg ggaatggcac ctgatcctca aatgtttgga ttggtcacca tcatcgatga gctacaactc ttcactgatg ctgttgagag tggaatttaa ttattgctta attaataata cgtgaatgcc ataaacacac ttccagacta caccgtcaat gacacgtctt atagcatcct2161 taaagaaaaa ggacacaaca acctttccta 2221 atctccttgg ttgattaatt agtttagttt 2281 aatattatat atggatgttg acagtggcgt 2341 aaatggtcga acaacaaaat cattccagca 2401 tcctcctccg gtgtggcttt gcttgctcct 2461 gatatctcag accatgctct tcgttcttta 2521 tgcgtcattt tcagactctg caatgatttg 2581 taattaattt gtaacacttg ttagactaat 2 641 gctgagctag agaggggtga gacgacaaat 2701 ggcacttctg aagagcaagc acgtgaggag 2761 aagatgaacc gagagcgagt ttcagattct 2821 gctgttaaca tggctcgagt ttcgcattgc 2 881 ccagactacg ccacagagaa tagaatcaag 2 941 caactaatgt acgtgtaaca acacaatata 3001 atttcggtgt tgaattaggg gtcaacacag 3061 aatctgataa gagaaaaaaa ataaaaataa 3121 agatatcaag ttt
tttgacaaaa tctgtacata tatactaatt agtttagttg gtatgtcaac acaattaatt gagttatgca aagcattcct tcaagaagca tttagcaagt acctggaaaa tgcatcggtg tcctacttct cagtgtgcca acaacaagaa actgatttcc atggccttgt gcgctcctca gctacctcag cggtgtgtaa ttaattacct atatataggt gtgtctgtta attactacag tcaataatat cttatatgca tgagaatgac ttgagaaaat tgatcgatgc agagtggaag acactactcc caaaagcttt tatggaaata acataccaat atggagacgg acttggaagg ttgctactta tagacccctt tccaatcaat aacacttttc tacaagtata tatttgttta ctatatatac ttcaatggac caactcaacc ggttaggtta actttgtata aatccaagtt
SEQ ID NO:8山葛藤野变种(尸i/^yw7Vi /wo/i似/ifl v"r. /M"似)异戊二烯合酶 多狀序列
MATNLLCLSNKLSSPTPTPSTRFPQSKNFITQKTSLANPKPWRVICATSSQFTQITEHN
SRRSANYQPNL丽FEFLQSLENDLKVEKLEEKATKLEEEVRCMINRVDTQPLSLLELI
DDVQRLGLTYKFEKDIIKALE雨LXDENKKNKSDLHATALSFRLLRQHGFEVSQDV
FERFKDKEGGFSGELKGDVQGLLSLYEASYLGFEGENLLEEARTFSITHLKNNLKEGI
NTKVAEQVSHALELPYHQRLHRLEARWFLDKYEPKEPHHQLLLELAKLDFNMVQTL
HQKELQDLSRWWTEMGLASKLDFVRDRLMEVYFWALGMAPDPQFGECRKAVTKM
FGLVTEDDVYDVYGTLDELQLFTDAVERWDVN趣TLPDYMKLCFLALYNTVNDT
SYSILKEKGHNNLSYLTKSWRELCKAFLQEAKWSNNKIIP馬KYLENASVSSSGVAL
LAPSYFSVCQQQEDISDHALRSLTDFHGLVRSSCVIFRLCNDLATSAAELERGETTNSI
ISYMHENDGTSEEQAREELRKLIDAEWKKMNRERVSDSTLLPKAFMEIAVNMARVS
HCTYQYGDGLGRPDYATENRIKLLLIDPFPINQLMYV
3权利要求
1. 一种在选自微观藻类、蓝细菌或光合细菌的微生物中生产异戊二烯烃类的方法，所述方法包括向所述微生物中引入包含编码异戊二烯合酶的核酸的表达盒；和在表达所述编码异戊二烯合酶之核酸的条件下，培养所述微生物。
2. 根据权利要求l所述的方法，其中所述微生物为微观藻类，该 微观藻类是绿藻。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中绿藻选自莱茵衣藻(C/r/fl附jWo附o/ifl51 mViAflnfti7 )、斜生掛藻(5cew^/e膽MS1 o緒《wws1 )、 小 球藻(C/r/ore〃" y"/^a".s)或盐生杜氏藻(Z>M"fl//e〃" sa/zVf")。
4. 根据权利要求l的方法，其中所述微生物为蓝细菌。
5. 根据权利要求4中所述的方法，其中所述蓝细菌为集胞藻 (5)7lec^c"ris sp.)。
6. 根据权利要求l中所述的方法，其中所述微生物为光合细菌。
7. 根据权利要求6中所述的方法，其中所述光合细菌为深红红螺 菌(7 /ro^s/7zW〃M附rM6ra附)。
8. 根据权利要求l所述的方法，其中所述核酸编码包含SEQID NO: 2之53-595号氨基酸残基的异戊二烯合酶。
9. 一种选自微观藻类细胞、蓝细菌细胞和光合细菌细胞的微生 物，其中所述微生物包含编码异戊二烯合酶并与启动子有效连接的异源 核酸。
10. 根据权利要求9所述的微生物，其中所述微生物为微观藻类， 该微观藻类是绿藻。
11. 根据权利要求10所述的微生物，其中所述绿藻选自莱茵衣藻、 斜生栅藻、小球藻或盐生杜氏藻。
12. 根据权利要求9中所述的微生物，其中所述微生物是蓝细菌。
13. 根据权利要求12中所述的微生物，其中所述蓝细菌为集胞藻。
14. 根据权利要求9所述的微生物，其中所述微生物为光合细菌。
15. 根据权利要求14中所述的微生物，其中所述光合细菌为深红红螺菌。
16. 根据权利要求9中所述的微生物，其中所述异源核酸编码包含 SEQIDNO: 2之53-595号氨基酸残基的异戊二烯合酶。
17. —种在包含编码异戊二烯合酶之异源核酸的微生物中生产异 戊二烯烃类的方法，该微生物选自微观藻类、蓝细菌、光合细菌和非光 合细菌，所述方法包括在表达所述异戊二烯合酶基因的条件下，在封闭的生物反应器中大 规模培养所述微生物；和收集由所述微生物生产的挥发性异戊二烯烃类。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述微生物为微观藻类， 该微观藻类为绿色微观藻类。
19. 根据权利要求18中所述的方法，其中所述绿藻选自莱茵衣藻、 斜生栅藻、小球藻或盐生杜氏藻。
20. 根据权利要求17中所述的方法，其中所述微生物为蓝细菌。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述蓝细菌为集胞藻。
22. 根据权利要求17所述的方法，其中所述微生物为光合细菌。
23. 根据权利要求22中所述的方法，其中所述光合细菌为深红红 螺菌。
24. 根据权利要求17所述的方法，其中所述微生物为非光合细菌。
25. 根据权利要求24所述的方法，其中所述非光合细菌为大肠杆 菌(五sr/rer/c/r/fl co// )。
26. 根据权利要求17所述的方法，其中所述异源核酸编码包含 SEQ ID NO: 2之53-595号氨基酸残基的异戊二烯合酶。
全文摘要
本发明提供了从微观藻类、蓝细菌以及光合和非光合细菌中生产异戊二烯烃类的方法和组合物。
文档编号C12N9/02GK101479378SQ200780024683
公开日2009年7月8日 申请日期2007年6月29日 优先权日2006年6月29日
发明者阿纳斯塔西奥斯·梅利斯 申请人:加利福尼亚大学董事会