专利名称：：人猪重配轮状病毒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及利用生物技术的构建、定性以及操作猪轮状病毒重组株的方法l人体减毒猪轮状病毒株。2覆盖Gl,G2，G3,G4，G5，G6，G8，G9,G10及P1A,P1B，P2A基因型。
背景技术：
：轮状病毒腹泻对发展中国家，甚至于发达国家都是一个巨大的健康负担。小于5岁的儿童每年约有592，000的死亡病例，在发展中国家比例最大。尽管发达国家死于轮状病毒感染的人数较少，但是从整体看，轮状病毒疾病引起的医疗负担也是巨大的。在美国每年有20例死亡，50，OOO例医疗救治，500，OOO例医生出诊，以及大于1亿美元的经济损失。因此一个有效且安全的轮状病毒疫苗，对世界公众卫生是一个重大突破。目前己经开发的轮状病毒疫苗，无论是天然的，或是人工重组获得的，大都是口服疫苗，都能有效预防系列轮状病毒疾病。这些产品包括猿猴四价疫苗，牛三价轮状病毒疫苗，单价人轮状病毒疫苗，单价羊轮状病毒疫苗，这些疫苗均在世界各地，不同人种间进行了临床实验。轮状病毒外壳蛋白中的VP7和VP4，已被验证可以独立的诱导产生中和抗体，进行免疫保护及预防疾病。200多年前，Jenner率先利用病毒在人体内被限制性复制的特性，采用来源动物基因的减毒疫苗做预防人类相关的疾病，开创动物疫苗免疫。这类疫苗在人体是减毒的，在预防人类疾病方面显示具有较高的活性。猪轮状病毒在哺乳动物和禽类轮状病毒中是独特的，它与人类轮状病毒具有特殊的关系。例如1、利用RNA-DNA杂交技术可以判定猪轮状病毒与人轮状病毒在基因型上具有紧密联系。2、人轮状病毒10个糖蛋白中有8个在猪中检测到，而在牛和猿猴中只检测到四个。3、10个蛋白激酶中有四个在猪中检测到，而在牛和猿猴中分别只有两个和零个被检测到。有趣的是，猪轮状病毒在Jennerian的方法中还没被应用。轮状病毒株VP4基因P(6)与各种G型结合，开始时被鉴定在新生婴儿中有极少的症状，现在被鉴定在新增婴儿及儿童中显著增加。
发明内容本发明提供了轮状病毒重配株的免疫机制和在人体应用的方法。描述的重配是将单价重配猪轮状病毒和人轮状病毒结合，以提供与临床中A组人轮状病毒血清型最密切的，至少能诱导人体轮状病毒抗体产生的基因配方。本发明采用具有独特性质的猪轮状病毒gottfried株，特别是血清型为P[6],G4的gottfried株。VP7G4G4血清型与牛轮状病毒UKVP7血清型P[5]G6同样代表了，在全球传染中占重要比例的人类轮状病毒的一种G血清型。同时，猪轮状病毒VP4的中和性质与人轮状病毒VP4的中和性质接近，并具有重要的临床作用。通过RNA-RNA杂交，表明猪轮状病毒goUfried株和人轮状病毒基因型接近。特性证明含有可与人轮状病毒编码抗原产生免疫交叉反应的猪轮状病毒gottfried株，其临床表现为P7血清型l，2，3，4，5，6，8，9，10和/或VP4血清型1A和1B的免疫组分，很有效用。图l显示了人轮状病毒RNA通过10。/。聚丙烯酰氨电泳的结果。第一道D株。第二道重组株GottxD,第三道猪轮状病毒gottfried株，第四道重组株GottxDS-1，第五道重组人轮状病毒DS-1，第六道人轮状病毒M株，第七道重组GottxM，第八道猪轮状病毒gottfried株，第九道重组株Gottx,第十道人轮状病毒ST3，第i^一道轮状病毒IAL28，第十二道重组GottxIAL28，第十三道猪轮状病毒gottfried株。电流为13mA,电泳15h后通过银染直观比较。图2显示了牛轮状病毒RNA电泳图谱。第一道牛轮状病毒UK株。第二道重组株GottxUK,第三道猪轮状病毒gottfried株，第四道重组株Gottx1290-1，第五道人轮状病毒1290，第六道人轮状病毒AU32株，第七道重组GottxAU32，第八道猪轮状病毒gottfried株，第九道重组株GottxKC-l，第十道牛轮状病毒KC-1，第H^—道人轮状病毒Mo，第十二道重组Moxgott，第十三道猪轮状病毒gottfried株。第十四道重组DS-lxGott，，第十五道人轮状病毒DS-1，电流为13mA,电泳15h后通过银染直观比较。本发明提供供人体使用的重配轮状病毒疫苗。组分是通过结合单价的重配动物轮状病毒和一个人轮状病毒或者是别的能与人抗原发生交叉反应的抗原的动物病毒，来提供与人轮状病毒A组临床研究关系最密切的血清型之一，从而诱导产生人轮状病毒特异性抗体反应。本发明的组成成分包含一个重配的猪轮状病毒株和一个可以在生理上接受的载体。体现在，采用目前与在世界各地最为流行的人轮状病毒血清型相近的猪轮状病毒重配株。该免疫组分可以免疫婴儿、孩子或成人，产生防御轮状病毒的免疫球蛋白，从而产生针对人轮状病毒血清型的特异免疫反应。该组分可以预防重的轮状病毒感染引发的疾病，如腹泻。反应己经通过动物模型展示了。本发明疫苗在临床上还未发现有发热，不良反应等。免疫后，可在机体血清检测到中和轮状病毒血清型的免疫抗体。本发明的多价免疫组分能够有效的，在目前不同地区分离到的人轮状病毒A组引发的临床反应起防御作用。还可以应用在将来临床中可能出现的人轮状病毒血清型的预防。本发明中的猪轮状病毒重配株免疫组分是通过分离纯化得到的。分离意味着是将其它细胞和病毒重组产物中分离得到的。例如野毒株，母体毒株，以及其他的细胞培养或系统中的异质成分。普遍意义上来说，轮状病毒重配株是将动物细胞和动物细胞敏感病毒如猪，牛，及人轮状病毒等共感染。典型的如非洲绿猴肾细胞(AGMK)作为受体细胞。共感染后，筛选期望的病毒重配株，通过其中和针对与人轮状病毒替换后的动物轮状病毒基因表达蛋白特异性抗体而确定。如针对VP7或VP4的多克隆血清或是单克隆抗体。经过几轮的蚀斑纯化和传代培养，可以确定筛选的重配株的血清型和基因型。血清型是通过蚀斑中和减少数确定或是酶联反应。基因型是通过凝胶电泳和RNA-RNA杂交技术。VP7或Vp4基因是用来筛选轮状病毒重配株的。期望的重配株包含VP7或Vp4基因的毒株。具体的如人猪轮状病毒重配株具有人轮状病毒Vp4(P1A,P1B，P2A0)基因和人轮状病毒Vp7基因(Gl，G2，G3'G4，G5,G6，G8，G9，G10)。一般的，轮状病毒重配株的生产是采用哺乳动物细胞感染培养。特别的是AGMK(非洲绿猴肾细胞)。动物和人轮状病毒株感染后，采用针对人轮状病毒基因编码蛋白的中和抗体来筛选出期望的重配株。特别是采用针对VP7/VP4的多克窿血清或单克窿抗体。通过几个循环的纯化和再培养，选出的重配株就被确定血清型和基因型。血清型是通过噬斑减少中和或是酶联免疫吸附确定，基因型是通过凝胶电泳或RNA-RNA杂交确定。人轮状病毒通过分离用做本发明的免疫组分。主要的人轮状病毒Dstrain(PlA[8]，Gl)，Mstrain.ST3(P2A[6]，G4)，Mo(P1A[8]，G1),DS-1(P1B[4]，G2)'IAL28(P1A[8],G5),1290(P[4]'G8)，AU32(P1A[8],G9),被用做人猪轮状病毒的构建。为了获得人轮状病毒VP7G10血清型，牛轮状病毒KC-1及人VP7G10血清型被构建到人猪轮状病毒中。同时，为了获得VP7G6血清型，将牛UK及人VP7G6血清型构建到人猪轮状病毒中。在可选择的构建体中，一个特异的血清型可以采用先前获得的重配株产生。例如，包含有人轮状病毒VP7血清型的GottaD株用来制备能与人VP7G2,G3,G4,G5,G6,G8,G9,G10血清型交叉反应的猪Gottfried重配株。重组轮状病毒的增殖可通过支持轮状病毒的细胞培养。在釆用细胞培养增殖前，需要进行一级或二级的AGMK(非洲绿猴肾细胞)细胞，二倍体FRhl-2(恒河猴二倍体细胞)及合适的Vero细胞的培养。病毒感染复数为0.1-1或更多，在病毒适宜的条件下增殖培养3-5天或者更长时间，达到合适的病毒滴度后收获轮状病毒，然后通过诸如离心方法将轮状病毒从细胞碎片中分离出来。纯化可以采用该领域里成熟的技术，选择合适的纯化方法进行制备。本发明中的多价猪轮状病毒重配株免疫组分可以有效的预防目前临床中最普遍的人轮状病毒VP7血清型。人猪轮状病毒重配株的每个剂量可以形成104-101()的蚀斑形成单位。免疫组分可以在可接受的载体或结合物时被引入宿主，如人。使用的载体有柠檬酸-碳酸缓冲液，盐缓冲液。混合的液体可以直接包装或是冻干，冻干疫苗应在4'C保存。冻干粉应与无菌注射用水在注册前包装。这项发明中的猪轮状病毒重配株至少含有一个目前临床最普遍的人轮状病毒VP7的血清型。每个剂量为104-1(T噬斑形成单位。致免疫成分可以采用一些载体，如拧檬酸-碳酸缓冲液，盐缓冲液等导入人体，。混合的液体可以直接包装或是冻干，冻干疫苗应在4"C保存。成分中可以含有药学上允许的辅助成分以提供适当的物理条件需要，如pH调节和缓冲试剂，例如醋酸钠，乳酸钠，氯化钾，氯化钙等。如果是口服，还需要提供单独的缓冲液来中和胃酸保证疫苗可以流至肠道。缓冲液包括碳酸钠，柠檬酸-碳酸或类似的。对与人猪轮状病毒重配株，特别是口服制品，宿主的免疫应答主要是通过产生自身分泌物和血清抗体。目前，发明中成分的安全及初始有效性实验可以采用各式动物模型。特别是采用无菌猪作为动物模型。这个模型中，轮状病毒株不仅可以感染猪还可以致其腹泻。这样可以模拟猪模型中的免役机制，同时模拟预防人轮状病毒株的感染。无菌猪模型在主动及被动免疫人轮状病毒疫苗中有好于其它动物模型的优点。相比较小鼠和小牛，其肠道物理环境，体形大小，被动免疫方式等都与人类婴儿类似，总之，人轮状病毒致猪敏感并能导致其腹泻。人猪重配轮状病毒的剂量在使用中需根据病人的年龄，健康状况及体重，注射的形式，复合液的性质等决定。但是基本范围为每个剂量为104-101()噬斑形成单位。优化的单位为105-108噬斑形成单位。任何使用中，均要保证使用的人猪重配轮状病毒疫苗的量可以提供预防轮状病毒感染的量。在一些情况下，可以将本发明中的疫苗与其它的肠道病毒疫苗共同使用。例如，将人猪重组轮状病毒VP7血清型1，2，3，4，5，9与可以与人VP41A或1B血清型交叉反应的轮状病毒猪牛重组轮状病毒联合使用。本发明中的单个或多个免疫组分可以同时进行。新生婴儿，多重给药可能引发高效的免疫，特别是源与母体的高水平的轮状病毒抗体。给药可以在最初的2-4月内，然后间隔l-2月再免疫。给药也可以在出生后的四周内以预防肠套叠的出现。在此种给药下，再次给药不早于免疫后三周。暴露后的成人、小孩的日常护理，需要进行多次免疫以建立免疫保护体系。诱导的免疫可以通过轮状病毒特异性抗体检测或血清型中和抗体检测。下面结合附图进一步说明本发明。图1是显示了人轮状病毒RNA通过10%聚丙烯酰氨电泳的结果示意图。图2是显示了牛轮状病毒RNA电泳图谱。具体实施例方式以下例子中猪轮状病毒重配株已被构建和定性。在预防人轮状病毒野株感染时可以混合使用轮状病毒重配株以诱导VP7或VP4的免疫反应。以下例子主要介绍猪轮状病毒重配株的构建和性质。从感染的无菌小猪大便获得的猪轮状病毒株。用AGML细胞培养生长，传代11次包括一次噬斑纯化。感染人轮状病毒D株或M株的猪大便的10%悬液连续用AGMK细胞传代10次。AGMK细胞主要用做基因重排，噬斑纯化及病毒扩增。绿猴肾细胞系MA104用做病毒滴度和噬斑减少中和实验。补充0.5ug/ml胰酶及抗生素的EMEM培养基用做维持液，补充抗生素的L-15培养基用做制作病毒或血清稀释液。噬斑减少中和实验采用50-60PFU/250ul的上述提到的病毒，琼脂是该实验中的固化试剂。超免疫抗血清生产用没有任何轮状病毒中和抗体的无病原体guniea猪，血清在使用前需56。C热处理30min针对VP4、Vp7抗体反应和人猪轮状病毒配组Gottfried株的有效保护性通过猪动物模型进行检测了。人猪Gottfried轮状病毒重配株等用做免疫猪崽。切除子宫的猪被随机的分成六组并在无菌的条件下保存。小猪在限菌的条件下用商业化的婴儿处方的食品作为基本食物，没有母体来源的抗体并隔绝外源免疫。所有的小猪在第3-5天口服第一剂量的疫苗。在第一次免疫三周后再次口服大约106ID50(表一)的人轮状病毒来评价保护效用。表一Gottx或GottxM重组疫苗对感染Wa或M病毒的无菌猪保护效力<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表二几尼猪超免血清中和抗体分析法评价VP7或VP4单基因替代重组Gottx株的抗原特性<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求1、一种人猪重配轮状病毒，其特征是免疫组分至少包含一种轮状病毒重配株，每个轮状病毒重配株至少包含一个编码与人血清型交叉反应蛋白的基因，至少保留编码猪轮状病毒Gottfried株一个蛋白的基因。2、按照权利要求1所述的人猪重配轮状病毒，其特征是重配株包含有10个来自于猪轮状病毒Gottfried株的基因和一个来源与人轮状病毒的可以编码VP7G1，VP7G2，VP7G3，VP7G4，VP7G5，VP7G6，VP7G8，VP7G9，VP7G10，VP4P1A，VP4P1B,VP4P2A的基因。3、按照权利要求2所述的人猪重配轮状病毒，其特征是重配株包含有10个来自于猪轮状病毒Gottfried株的基因和一个来源与人轮状病毒的可以与人VP710，VP76血清型的基因。4、按照权利要求2所述的人猪重配轮状病毒，其特征是重配株包含有IO个来自于猪轮状病毒Gottfried株的基因和一个来源与人轮状病毒的可以与人VP710，VP76血清型的基因，人猪轮状病毒重配株疫苗每剂量含有少于106蚀斑形成单位，人猪轮状病毒重配株GoUxD，GottDS-1，GottxP,GottxST3，Gottx1290以及GottxAU32和GottxKC-1和GottxUK。5、按照权利要求2所述的人猪重配轮状病毒，其特征是重配株组分为人猪轮状病毒重配株编码抗原有VP7G1，VP7G2，VP7G3，VP7G4，人猪轮状病毒重配株组成为GottxD，GottDS-1，GottxST3，Gottx1290以及GottxAU32和GottxIAL28。6、按照权利要求1所述的人猪重配轮状病毒，其特征是重配株包至少含GottxD，GottxDS—1，GottxM'GottxST3,GottxIAL28'GottxUK，MoxGott中的一个。7、按照权利要求1所述的人猪重配轮状病毒，其特征是包含有结合体、包含有机体可接受的载体，组分为冻干的，人猪轮状病毒重组株疫苗每剂量提供103-106蚀斑形成单位，人猪轮状病毒重配株编码包含有VP7G1,VP7G2，VP7G3，VP7G4，VP7G5，VP7G6，VP7G8，VP7G9，VP7G10，VP4P1A，VP4P1B[4]及人牛重组株编码的蛋白与人VP710血清型交叉反应的组分。8、一种人猪重配轮状病毒，其特征是多价人猪轮状病毒重配株给药时至少包含一个基因，其编码的蛋白可以与VP7G1，VP7G2，VP7G3，VP7G4，VP7G5，VP7G6，VP7G8，VP7G9，VP7G10，VP4P1A，VP4P1B,VP4P2A产生交叉反应。全文摘要本发明提供了一种人猪重配轮状病毒，所要解决的技术问题是来源动物基因的减毒疫苗做预防人类相关的疾病。猪轮状病毒在哺乳动物和禽类轮状病毒中是独特的，它与人类轮状病毒具有特殊的关系。本发明的要点是采用具有独特性质的猪轮状病毒gottfried株，特别是血清型为P[6]，G4的gottfried株，免疫组分至少包含一种轮状病毒重配株，每个轮状病毒重配株至少包含一个编码与人血清型交叉反应蛋白的基因，至少保留编码猪轮状病毒Gottfried株一个蛋白的基因。本发明的作用是通过结合单价的重配动物轮状病毒和一个人轮状病毒或者是别的能与人抗原发生交叉反应的抗原的动物病毒，来提供与人轮状病毒A组临床研究关系最密切的血清型之一，从而诱导产生人轮状病毒特异性抗体反应。文档编号C12N7/01GK101638638SQ20081001252公开日2010年2月3日申请日期2008年7月29日优先权日2008年7月29日发明者译张,伟李,艳李,李中兴,胡金东,煦谭申请人:辽宁依生生物制药有限公司