专利名称：：新的甲型肝炎灭活疫苗病毒毒株及其培养方法
技术领域：
：本发明涉及一种制备曱型肝炎灭活疫苗的新的曱型肝炎病毒JS-4抹及其培养方法。
背景技术：
：曱型肝炎是由曱型肝炎病毒感染引起的一种严重危害人类健康的急性传染病。在A艮中国家尤其是一个重要的公共卫生问题，表现为较高的发病率和局部流行，甚至爆发引起死亡。因此曱肝的防治工作在全球的疾病预防控制中占有重要的地位。我国是曱型肝炎高^y亍区，每年至少有24万人患曱肝it^巨大的经济损失和社会影响。国务院总理温家宝在十届人;Jm次^i过府工作报告中提出将甲型肝炎、流脑等传染病纳入国家计划免疫。我国现有三个厂家生产甲肝减毒活疫苗，两个厂家生产曱肝灭活疫苗，但由于各家使用的毒林、细月驢质不同，产量质量都有差异，我国人口众多，曱肝疫苗仍远不能满足国内市场的要求。
发明内容本发明一方面涉及一种新的曱型肝炎病^4抹，命名为JS4毒抹，该毒抹亍2008年1月25日保藏于中国典型培;^保藏中心,保藏编号为CCTCCNO:V200802。该病44林抗原滴度可达1:640—1:1280，感染性滴度为106.67—107.50CCID50/mL，经绒猴毒力试JHi明该毒林毒力较弱，用它生产曱型肝炎灭活疫苗不仫在安全性方面更可靠，具有良好的免疫原性和保护效果，而且该毒抹具有在Vero细胞上增殖周期短、繁殖效率高的特性，适合于作;W^模工业化生产的甲型肝炎灭活疫苗毒种，是生产甲型肝i^灭活疫苗的理想毒株。本发明另一方面涉及曱肝病毒的培养方法，该方法包括以下步骤(a)从曱型肝炎急性感染患者粪便中分离，经生物学特性鉴定确认为曱型肝炎病毒；(b)用活性炭处理后在Vero细胞上培养，早代次培养周期为28天，传至10代后缩短至21天，继续培养10代，培养温度为35。C-36°C，培养时间从28天缩短培养直到培养高峰为21天；(c)选择经步骤(b)细皿养适应后的病毒测试后作为生产疫苗的毒林。本发明还涉及一种制备甲型肝炎灭活疫苗病毒抗原的方法，其特征是包括如下步骤(a)在培养液中静止或立体吸附培养细月&^Vero细胞，使细胞浓度达到106~107/mL;(b)以感染剂量(M.O.I)为0.2-0.5将权利要求1的曱型肝炎病44林JS-4抹接种到上述细胞浓度的细胞基质培养液中，在37。C与悬浮的细胞吸附30-50min后接种于3L三层瓶中，置35-36。C培养，期间每七天换液一次，21天收毒；(c)用消化液消化获得病^~细胞培养悬液；(d)经破碎抽提、浓缩纯化、灭活后获得曱型肝炎灭活疫苗病毒抗原。相比于现有技术，本发明提供的毒林用于曱肝灭活疫苗的生产，可大大提高疫苗的产量和质量，适应于Vero细胞的曱肝病毒抹在国内外均处于领先地位，比人二倍体细胞更适于大规模工业化生产。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。实施例1曱型肝炎病毒毒抹JS-4抹的培养方法从临床甲型肝炎病人采集的急性期粪便制备成20%悬液，用5%植物活性炭处理后10000rpm离心30min,吸取上清加适量抗生素，置4。C备用。待小方瓶Vero细胞长成单层后，洗细胞面一次，每弁IU妻种2ml粪便悬液，37。C吸附2小时，补充细胞维持液置36。C培养28天收毒，期间每七天换液一次。由(b)步骤分离传代的样品继续进行Vero细胞适应性培养。不同的是每瓶细^^:种lmL样品，37。C吸附2小时，36。C培养28天，传至IO代后减少培养时间至21天，再继续传10代，先在克氏瓶传5代，3L单层瓶传3代，3L三层瓶传2代。其中，每次培养期满后，用胰酶一EDTA消化获得的病f细胞培养悬液，置-80。C保存备用。接种前用超声波破^ff义破碎细胞，破碎率达95%以上，以感染剂量(M.O.I)为0.2~0.5进行接种。最终获得一抹甲型肝炎病毒毒抹，命名为JS4毒株，该毒4朱于2008年2月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC-V200亂该曱型肝炎灭活疫苗病毒毒株JS-4株的特征为病毒颗粒直径27-32nm;耐酸性在pH3.0条件下，2—8。C作用18小时，感染性滴度无明显影响；耐乙醚性经乙醚2—8。C作用18小时，感染性滴度无明显影响；中和试验被HAV特异性抗体中和；基因序列分析与NCBIGeneBank中曱肝病毒基因序列同源性高达98.2%，属同一基因亚型；抗原滴度1:640—1:1280;感染性滴度106.67—107.50CCID50/mL;繁殖高峰期21—28天；最适培养温度35°C—36°C;繁殖部4立细月包包浆内；具有曱肝病毒特性。实施例2制备曱型肝炎灭活疫苗病毒抗原的方法自Vero细胞工作种子库取出细胞冻存管，迅ii^tA40。C水中溶化，然后加到预温37。C的199培养液中，种入细胞瓶，置37。C培养，经3~4天长成单层后，扩增数代，直至生产用的规定代次。将上述细万M要0.2MOI加入实施例1获得的曱型肝炎病毒毒株JS-4抹，在37。C与悬浮的细胞吸附40min后接种于3L三层瓶中，置36。C培养，期间每七天换液一次，21天收毒，其中培养液成份为199培养基，含2—8%小牛血清培养期满后用消化液消化获得的病毒一细胞培养悬液，经破碎抽提、浓缩纯化、灭活后获得甲型肝炎灭活疫苗病毒抗原。本发明中相关实验数据见以下列表。证明JS-4毒抹具有在Vert;细胞上高效稳定增殖的特性，经绒猴毒力试r^i正明该毒株毒力较弱，用它生产甲型肝炎灭活疫苗不仅在安全性方面更可靠，具有良好的免疫原性和保护效果。表1JS-4林不同代次抗原滴度及感染性滴度代次抗原滴度絲歸4(EUZO.lmL)103204.50156406.00186406.672012807.505表2JS-4抹19代增殖高峰期il验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3JS-4抹毒力情况比專交(绒猴il验)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求1、一种甲型肝炎病毒毒株，命名为JS-4，该毒株保藏编号为CCTCC-V200802。2、一种培养曱型肝炎病44抹的方法，其特征是包括下述步骤(a)从甲型肝炎急性感染患者粪便中分离，经生物学特性鉴定确认为曱型肝炎病毒；(b)用活性炭处理后在Vero细胞上培养，早代次培养周期为28天，传至10代后缩短至21天，继续培养10代，培养温/复为35°C-36°C,培养时间从28天缩短培养直到培养高峰为21天；(c)选择经步骤(b)细胞培养适应后的病毒测试后作为生产疫苗的毒株。3、一种制备曱型肝炎灭活疫苗病毒抗原的方法，其特征是包括如下步骤(a)在培养液中静止或立体吸附培养细胞基质Vero细胞，使细胞浓度达到106-107/mL;(b)以感染剂量(M.O.I)为0.2-0.5将权利卖-求1的曱型肝炎病4^4朱JS-4抹接种到上述细胞浓度的细胞基质培养液中，在37。C与悬浮的细胞吸附30-50min后接种于3L三层瓶中，置35-36。C培养，期间每七天换液一次，21天收毒；(c)用消化液消化获得病^"细胞培养悬液；(d)经破碎抽提、浓缩纯化、灭活后获纟寻甲型肝炎灭活疫苗病毒抗原。全文摘要本发明提供一种制备甲型肝炎灭活疫苗的新的甲型肝炎病毒JS-4株及其培养方法。该毒株是从一个甲型肝炎急性感染患者粪便中分离，再传至Vero细胞上适应培养所得，经中和试验等方法证明为甲肝病毒，适应过程中，早代次培养周期为28天，传至10代后缩短至21天，继续培养10代，培养温度为35℃-36℃，病毒繁殖周期由28天缩短到21天，抗原滴度可达1∶640-1∶1280，感染性滴度为106.67-107.50CCID50/ml。经绒猴毒力试验证明该毒株毒力较弱，用它生产甲型肝炎灭活疫苗不仅在安全性方面更可靠，而且具有良好的免疫原性和保护效果，是生产甲型肝炎灭活疫苗的理想毒株。文档编号C12N7/08GK101525597SQ20081001865公开日2009年9月9日申请日期2008年3月8日优先权日2008年3月8日发明者周佳丽,张玉慧,曹雨露,王益民,胡焱灵,蒋建江,明黄申请人:江苏延申生物科技股份有限公司