专利名称：：一种无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的构建方法一种无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的构建方法
技术领域：
一种无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的构建方法，本发明利用融合PCR、高效率酵母电转化感受态制备、制霉菌素富集和限制性培养基筛选构建大片段缺失的无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母，属于生物工程
技术领域：
。技术背景光滑球拟酵母是一种单倍体酵母，没有有性生殖阶段。光滑球拟酵母被广泛用于丙酮酸和oc-酮戊二酸的生产。某些光滑球拟酵母菌株还是临床上的机会致病菌。光滑球拟酵母的基因工程研究目前还处于起步阶段。在酵母中最常用的遗传标记是可以完成互补的营养缺陷型标记。目前国内研究光滑球拟酵母分子生物学的机构较少，仍处于研究的初步阶段。筛选光滑球拟酵母营养缺陷型菌株是对其进行深入研究的重要基础工作之
发明内容本发明的目的是提供一种无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的构建方法，并使用其构建了三株营养缺陷型菌株。本发明的技术方案的详细描述一种无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的构建方法，该方法有机的结合了融合PCR技术，酵母高效率感受态制备及转化技术，制霉菌素富集技术及限制性培养基筛选技术；(1)融合PCR技术根据融合PCR技术，使用4条引物，使用/^高保真DNA聚合酶从基因组上PCR得到待敲除基因的左右两臂，再进一步进行融合PCR将左右臂连接起来;(2)酵母高效率感受态制备及转化技术a)挑单菌落接种于5mLYPD培养基中，30。C过夜培养至饱和；b)0.1。/。接种至100mLYPD培养基中，30。C培养10h,细胞密度为1X108细胞/mL;c)培养物分装至两个50mL预冷的无菌离心管中，5000rpm、5min离心去上清，每管加入8mL无菌水重悬，合并成一管；d)加入2mLpH7.5的IO倍TE缓冲液，摇动混匀，加入2mL1mol七-1醋酸锂和0.5mLlmol'L"二硫代苏糖醇，旋转混匀，30°C，50rpm，摇45min;e)菌悬液稀释至50mL水中，5000rpm、5min沉淀细胞，去上清，重复一次；f)用适量预冷的1mol/L山梨醇重悬，使最终菌悬液OD,-200;按每份80pL分装于1.5mL离心管中，直接转化或保存于-80。C;g)将20)iL的PCR片段/质粒，与80pL的上述步骤f)所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，冰浴5min;h)采用电穿孔仪进行电转化电压1.5kV;电容25^F;电阻200Q;电击时间为5ms;i)电击完毕后，加入1mL冰预冷的1moll'1山梨醇溶液将菌体混匀，转移至1.5mL的离心管中；(3)制霉菌素富集技术及限制性培养基筛选技术j)将步骤i)所得菌悬液转入YPD液体培养基中24h后，离心；k)所得菌体用NFMM洗涤后继续在NFMM中培养6h，用NFMM离心洗涤后，再加入MM培养2h;1)MM离心洗涤后，分别加入制霉菌素和蔗糖至终浓度10pg.L"和170g.L"，培养30-120min;m)将菌体悬液稀释10，100，IOOO倍分别涂布于LM平板上；n)将平板置于30。C培养，直至单个菌落出现；o)小菌落为可能的营养缺陷型菌株；p)挑取平板上的小菌落进一步在MM平板相应的SM平板上进行划线分离确认；q)营养缺陷型菌株进一步用菌落PCR进行验证。构建了3种营养缺陷型光滑球拟酵母菌株分别是精氨酸缺陷型光滑球拟酵母菌株，尿嘧啶缺陷型光滑球拟酵母菌株，精氨酸/尿嘧啶双缺陷型光滑球拟酵母菌株。相关培养基IO倍TE:将100mMTris-Hcl(pH=8.0)6.057g与10mMEDTA(pH=8.0)1.8612g溶于ddH20中，调pH-7.5，定容到500mL。酵母膏蛋白胨葡萄糖培养基(YPD):酵母抽提物10gl—1，胰蛋白胨2.0g，L—1，葡萄糖20g丄—1。无氮源基本培养基(NFMM):葡萄糖20g.L"，KH2P041.0g.L"，MgS04.7H200.5g.L"。基本培养基(MM):NFMM中加入(NH4)2S0410g丄"。限制性培养基(LM):MM中加入0.5。/。的YPD。各种补充培养基(SM):MM中加入相应的营养物质80mg，L-1精氨酸(SM-ARG),80mgl"尿嘧啶(SM-URA)，80mgl"精氨酸和80mgl'1尿嘧啶(SM画ARG/URA);维生素溶液烟酸1.0gl"，生物素5.0mg.L'1，维生素B!5.0mg.U1，维生素B650mg.lA以上所有培养基中每升均加入10mL维生素溶液和1mL100g.U1氨苄青霉素，pH均调节至6，并在115'C灭菌10min.相应的YPD，MM和SM平板均加入20g1—1琼脂粉。而LM平板仅加入15g丄'1琼脂粉。本发明的有益效果本发明为一种选育大片段缺失的无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的系统方法，主要包括融合PCR方法得到大片段缺失的同源重组片段，高效率酵母电转化感受态的制备，制霉菌素富集和限制性培养基筛选。通过一整套系统方法，可以在3-5天内快速的得到目的营养缺陷型菌株。大片段的缺失，有效的避免了回复突变和与外源质粒的同源重组。此外，由于在整个过程中未使用任何抗性标记，使用该方法还可以在同一出发菌株上使用多次，得到多重营养缺陷型，供后续基因工程研究使用。具体实施方式实施例1按照上文所述方法，用引物P1/P2和P3/P4，以基因组DNA作为模板，用p/"高保真DNA聚合酶，分别得到了^GS基因的左右臂，PCR条件为95°C，3min;{95。C，50s;55。C，50s;72。C，lmin}，循环30次；72。C,15min;-2(TC保存。将所得左右臂分别割胶回收后，再分别作为模板，以P1/P4为引物，得到大片段缺失的J"rgS片段。PCR条件如下94°C，4min;{94°C，50s;55°C，50s;72°C,3min}，循环30次；72°C，12min，-20。C保存备用。将所得zlagS片段电转化光滑球拟酵母CCTCCNO:M202019，按后续富集步骤进行培养，得到了一株精氨酸缺陷型光滑球拟酵母菌株。并用引物P1/P4进一步进行了菌落PCR验证。引物编号引物引物序列(5'-3')PIP2ARG8國leftSARG8-leftAGAACAATACCACCGTAAGTGAGTAATTTTGGTTAACGCTTAGGGAAAACAGATP3P4ARG8腸rightSARG8-rightATAAGCGTTAACCAAAATTACAGTACCCAAGCCGATAATAACATAGATGCCGACA实施例2按照上文所述方法，用引物P5/P6和P7/P8，以基因组DNA作为模板，用p/"高保真DNA聚合酶，分别得到了WL43基因的左右臂，PCR条件为95°C，3min;{95。C，50s;55。C，50s;72。C，2min}，循环30次；72。C，15min;-20°(:保存。将所得左右臂分别割胶回收后，再分别作为模板，得到大片段缺失的z/w"3片段。PCR条件如下:94°C，4min;{94°C,50s;55°C，50s;72°C，3min}，循环30次；72°C，12min;-20°(:保存。将所得z/wra3片段电转化光滑球拟酵母CCTCCNO:M202019，按后续富集步骤进行培养，得到了一株尿嘧啶缺陷型光滑球拟酵母菌株。并用引物P5/P8进一步进行了菌落PCR验证。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例3将实施例2中所得zl"ra3片段电转化实施例1中所得的精氨酸缺陷型菌株，按后续富集步骤进行培养，得到了一株精氨酸/尿嘧啶双缺陷型光滑球拟酵母菌株。并分别用引物Pl/P4和P5/P8进一步进行了PCR验证。权利要求1、一种无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的构建方法，其特征是有机的结合了融合PCR技术，酵母高效率感受态制备及转化技术，制霉菌素富集技术及限制性培养基筛选技术；(1)融合PCR技术根据融合PCR技术，使用4条引物，使用pfu高保真DNA聚合酶从基因组上PCR得到待敲除基因的左右两臂，再进一步进行融合PCR将左右臂连接起来；(2)酵母高效率感受态制备及转化技术a)挑单菌落接种于5mLYPD培养基中，30℃过夜培养至饱和；b)0.1％接种至100mLYPD培养基中，30℃培养10h，细胞密度为1×108细胞/mL；c)培养物分装至两个50mL预冷的无菌离心管中，5000rpm、5min离心去上清，每管加入8mL无菌水重悬，合并成一管；d)加入2mLpH7.5的10倍TE缓冲液，摇动混匀，加入2mL1mol·L-1醋酸锂和0.5mL1mol·L-1二硫代苏糖醇，旋转混匀，30℃，50rpm，摇45min；e)菌悬液稀释至50mL水中，5000rpm、5min沉淀细胞，去上清，重复一次；f)用适量预冷的1mol·L-1山梨醇重悬，使最终菌悬液OD＝200；按每份80μL分装于1.5mL离心管中，直接转化或保存于-80℃；g)将20μL的PCR片段/质粒，与80μL的上述步骤f)所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，冰浴5min；h)采用电穿孔仪进行电转化电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω；电击时间为5ms；i)电击完毕后，加入1mL冰预冷的1mol·L-1山梨醇溶液将菌体混匀，转移至1.5mL的离心管中；(3)制霉菌素富集技术及限制性培养基筛选技术j)将步骤i)所得菌悬液转入YPD液体培养基中24h后，离心；k)所得菌体用NFMM洗涤后继续在NFMM中培养6h，用NFMM离心洗涤后，再加入MM培养2h；l)MM离心洗涤后，分别加入制霉菌素和蔗糖至终浓度10μg·L-1和170g·L-1，培养30-120min；m)将菌体悬液稀释10，100，1000倍分别涂布于LM平板上；n)将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现；o)小菌落为可能的营养缺陷型菌株；p)挑取平板上的小菌落进一步在MM平板相应的SM平板上进行划线分离确认；q)营养缺陷型菌株进一步用菌落PCR进行验证。2、根据权利要求1所述的一种无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的构建方法，其特征是构建了3种营养缺陷型光滑球拟酵母菌株分别是精氨酸缺陷型光滑球拟酵母菌株，尿嘧啶缺陷型光滑球拟酵母菌株，精氨酸/尿嘧啶双缺陷型光滑球拟酵母菌株。全文摘要一种无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的构建方法，属于生物工程
技术领域：
。本发明为一种选育大片段缺失的无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的系统方法，主要包括融合PCR方法得到大片段缺失的同源重组片段，高效率酵母电转化感受态的制备，制霉菌素富集和限制性培养基筛选。通过一整套系统方法，可以在3-5天内快速的得到目的营养缺陷型菌株。大片段的缺失，有效的避免了回复突变和与外源质粒的同源重组。此外，由于在整个过程中未使用任何抗性标记，使用该方法还可以在同一出发菌株上使用多次，得到多重营养缺陷型，供后续基因工程研究使用。文档编号C12R1/645GK101240250SQ20081001866公开日2008年8月13日申请日期2008年3月7日优先权日2008年3月7日发明者刘立明,周景文,堵国成,坚陈申请人:江南大学