专利名称：：一种蜡蚧轮枝菌菌株及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种蜡阶轮枝菌菌株及其在防治害虫方面的应用。
背景技术：
：在烟粉虱、温室白粉虱、蚜虫和蓟马等害虫的防治上，多采用传统的化学防治方法。蜡阶轮枝菌(V^rric"/z'"/w(Zimmermann)Viegas)是一禾中昆虫病原真菌，作为一种活体生物农药，具有不同于现有化学杀虫剂的全新作用机理、对环境无污染、无残留的特征，可以作为防治某些对苏云金杆菌(Bt)产生抗药性的昆虫，替代传统化学防治药物，以大力发展生物农药防治技术。
发明内容本发明的一个目的是克服现有技术的不足，提供一种蜡蚧轮枝菌菌株。本发明的另一个目的是提供所述蜡蚧轮枝菌菌株的应用。本发明的目的通过下述技术方案来实现提供一种蜡蚧轮枝菌菌株，所述菌株是从广州地区被虫生真菌自然侵染的烟粉虱虫体上分离获得，并回接于烟粉虱虫体上复壮获得蜡蚧轮枝菌菌株，对该菌株采用单孢子分离获得纯化菌株。该菌株为VL-N6，菌株保藏号为CCTCCNo:M208086，2008年6月10日在中国典型培养物保藏中心保藏。所述蜡蚧轮枝菌菌株属丝孢目，轮枝孢属。所述蜡蚧轮枝菌菌株菌落白色至奶油色，薄絮状，背面无色至深浅不一的黄色。分生孢子梗不发达，似营养菌丝，其上有单生、对生或34个轮生的瓶梗，瓶梗纤细，大小因菌株及菌龄不同而差异较大，8.5—40x0.8—2.2nm;分生孢子椭圆形至圆柱形，两端圆，单生，在瓶梗顶部聚集成头状，大小因菌株及而变异较大，2.3—10xl—2.6萍。本发明同时提供了所述蜡蚧轮枝菌菌株在制备防治烟粉虱、温室白粉虱、蚜虫或蓟马的药物方面的应用，本发明的蜡蚧轮枝菌对防治十字花科蔬菜上的烟粉虱、温室白粉虱、蚜虫或蓟马等多种害虫有效。本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果(l)本菌株是从广东省广州地区被侵染的烟粉虱虫体上分离获得，为中国本土的菌株，并非从国外引进，能较好地适应本地的自然环境。(2)本发明所述的蜡蚧轮枝菌菌是一种昆虫病原真菌，作为一种活体生物农药，具有不同于现有化学杀虫剂的全新的作用机理、对环境无污染、无残留的特征，适应有机食品生产的要求。(3)本发明的蜡蚧轮枝菌对防治十字花科蔬菜上的烟粉虱、温室白粉虱、蚜虫和蓟马等多种害虫有效。具体实施例方式下面结合具体实施例来进一歩详细说明本发明。下述实施例为本发明较佳的实施方式，本发明主要阐述所述菌株的发明思想，实施方式不一一在实施例中追述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应为等效的置换方式，包含在本发明内。实施例11.1材料来源在广州地区的蔬菜黄瓜上采集到一种被虫真菌侵染的烟粉虱Sem/w."虫尸。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):将200g马铃薯煮熟取汁，然后在所取的汁液中加入20g葡萄糖和1720g琼脂粉，加入水使总体积为1000ml并煮沸，经高压灭菌，灭菌条件121。C，30min。无菌操作条件所有器皿和用具须经高压灭菌，灭菌条件121°C，30min，接种等操作均在实验室常规规定的超净工作台内进行。培养条件置于25X:光照(14L:IOD)恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到PDA斜面，再转入4。C冰箱贮存。1.2病原菌的分离、鉴定(一)病原菌的分离与纯化(1)分离从采回的被虫生真菌感染的烟粉虱虫尸样品上分离病原菌。利用5%的次氯酸钠溶液对样品进行表面消毒，消毒后的样品在灭菌水中洗涤3次，并放入PDA平板中，倒置于25'C恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到PDA斜面，再转入4"C冰箱贮存。(2)复壮将分离到的菌株在PDA平板上培养15天，待产生分生孢子后加入0.03%吐温一80的无菌水收集孢子，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌20分钟，用小型手动喷雾器将稀释成lxl(^孢子/ml的孢子悬浮液均匀地喷于带有烟粉虱的黄瓜叶片上，保温90%以上，24小时。15天后挑取被感染的烟粉虱，按前面所述的方法分离到A分离株。(3)纯化对A分离株在PDA平板上培养15d，待形成分生孢子后，挑取孢子制成lxl(f孢子/ml的孢子悬液，将悬液滴于放有盖玻片的载玻片上，在生物显微镜下观察，将一个液滴中只有一个分生孢子的玻片插入PDA培养基上，放在培养箱中培养，获得B、C、D、E、F、G共6个分离株。(4)病原菌的鉴定根据病原菌的培养性状、菌丝、分生孢子和产孢器的形态进行初歩鉴定。1、菌落形态描述将获得的6个分离株接种到PDA平板上，于25C条件下培养。23天可见到长出白色的菌丝，菌落长绒状、白色、中部隆起，第7天后开始产生分生孢子。菌落背面无色或黄色。2、菌丝和孢子形态描述菌丝白色，分生孢子梗不发达，似营养菌丝，单生、对生或34个轮生的瓶梗，瓶梗纤细，大小因菌株及菌龄不同而差异较大，8.5一40X0.8—2.2拜。分生孢子椭圆形至圆柱形，两端圆，单生，在瓶梗顶部聚集成头状，大小因菌株及而变异较大，2.3—10X1—2.6,。(二)蜡蚧轮枝菌分离株的筛选虫生真菌在遗传、生态及生物学等方面具有多样性，又存在有准性生殖现象，同种真菌的不同菌株对目标害虫的致病力差异显著，菌株不同，其LDm、LT5。可相差数倍至数十倍。高产优质菌株的筛选与获得，是取得较好防治效果的首要前提。菌株筛选常用的4个指标分别为致病力、产孢量、孢子萌发率、菌落生长速率。本发明以这些指标为依据，筛选蜡蚧轮枝菌的优势菌株。(1)供试菌株的处理经纯化后获得的蜡蚧轮枝菌B、C、D、E、F、G共6个分离株，在PDA平板于25:h0.5"C的恒温箱(14L:10D)中培养。(2)供试昆虫与寄主植物烟粉虱，将网室中饲养在黄瓜上的烟粉虱成虫，接种到无虫的黄瓜幼苗上，产卵12h后，清除成虫，将黄瓜幼苗置于25:t0.5。C的光照培养箱中，待烟粉虱发育至2龄若虫时待用。黄瓜(C"c"m/H如VwL.)，品种为万吉青瓜，购自广东省农科院蔬菜研究所，试验苗均采用23片展开叶的盆栽苗。(3)菌落生长速率和产孢量的测定将6个分离株分别配制成lxlC^孢子/ml的分生孢子悬液，分别取lml悬液滴入PDA培养基上，用三角玻璃棒涂匀，待23d长出菌丝后用直径为13mm的打孔器新鲜菌落，接种于PDA平板上，然后置于培养箱中培养(L:D=14:10)。每个菌株5次重复。第15d测定菌落直径并收集分生孢子用血球计数板记数测定产孢量。具体操作如下用直尺测量菌落直径，并用直径为5mm的灭菌打孔器在培养皿中取菌丝生长均匀的菌块，然后放入加有20ml0.03%吐温一80无菌水中，在磁力搅拌器上搅拌20分钟，使孢子充分分散，制成孢子悬浮液，用血球记数板记数测定产孢量。6个分离株的菌落生长速率和产孢量见表1，菌落生长速率B与C差异不显著，B、C与其余的分离株之间差异显著。生长15天后，分离株C与B、的产孢量差异不显著，B、C与其它分离株之间的产孢量差异显著，其中B、C分离株为较优的分离株。表1蜡蚧轮枝菌6个分离株生长速率和产孢量(15d)分离株菌落生长速率M±SE(cm)产孢量(分生孢子/mL)B4.85±0.06a2.08x10saC4.69±0.12a1.88xi08aD4.23±0.17b040xl08beE3.31±0.05c0.15xi08cF3.48±0.13c035X108beG4.25±0.04b0.75xl08b注表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。(4)孢子萌发率的测定将6个分离株分别培养15天后，用无菌水收集孢子并制成悬液，用载玻片萌发法试验。将孢子悬液滴在无菌载玻片上，置于底部铺有滤纸的培养皿内，在皿内滴加34滴无菌水保湿(100，RH)，培养36h后镜检。每个处理3个重复。6个分离株中，B、E分离株与其它分离株之间的分生孢子萌发率差异显著，结果见表2，其中B分离株的孢子平均萌发率最高，D分离株的孢子萌发率最低。表2蜡蚧轮枝菌6个分离株的分生孢子萌发率G6h)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。(5)分离株对烟粉虱若虫致病力的测定将6个分离株培养15d后，用无菌水收集孢子，配制成浓度为lxl(^分生孢子/mL的孢子悬液。将带有2龄烟粉虱若虫的黄瓜叶片浸入悬液中，对照浸入无菌水中，20秒后取出，自然晾干。每处理为34片叶，每叶50100头若虫，3次重复。摘下处理过的叶片，插于盛有无菌水的花泥中，置于透明的保鲜盒内。再置于25K).5'C的光照培养箱中(L:D=14:10)。每日镜检并记录感染死亡率，连续观察14d。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。致病力研究结果表明，所有分离株的侵染率与对照相比差异显著。6个分离株在第34天开始表现出侵染症状，从第7d的侵染率可看出B、C分离株显著高于D、F、H、G分离株，第14d时B分离株与其它分离株的侵染率差异显著。从总体而言，分离株B的致病力较强，平均为89.23%(14d)，G分离株的侵染率较低，为45.22%(14d)，见表3所示。表3蜡蚧轮枝菌6个分离株对烟粉虱的致病力<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。(6)蜡蚧轮枝菌分离株的筛选在筛选优良分离株时，致病性和产孢量是重要的参考指标，孢子萌发率和菌落生长速率次之。在本发明中，菌落生长速率和产孢量分离株B、C与D、E、F、G差异显著。从孢子萌发率和致病性上看，分离株B较为优良，具有致病性强、产孢量高等特点，由表1和表3可见。综合比较各方面的因素，B分离株为最佳菌株，将其命名为VL-N6菌株，经贵州大学刘爱英教授鉴定为蜡蚧轮枝菌(论Wd历"m^^m'KZimmermann)Viegas)，其菌株保藏号CCTCCNo:M208086,2008年6月10日在中国典型培养物保藏中心保藏。该蜡阶轮枝菌(旨ft'"'ZZ/wn(Zimmermann)Viegas)菌株VL-N6，属丝抱目，轮枝孢属。该蜡蚧轮枝菌菌落背面无色或黄色，分生孢子梗单生或聚集成孢梗束，100xl.52,，壁光滑，透明，大多由着生46个瓶梗组成轮生体的轮状分枝组成。瓶梗基部球形，或拟椭圆形膨大，上部细长，5.78xl2,。分生孢子柱形至梭形，光滑，透明至微淡红色，34xl2,，无厚垣孢子。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。实施例2蜡蚧轮枝菌VL-N6菌株对烟粉虱的致病力测定生物测定是检测虫生真菌对目标害虫的致死程度和致死速率的有效手段之一，能为综合评价该真菌的生物防治潜力提供重要的参考依据。本发明就蜡蚧轮枝菌VL-N6菌株对烟粉虱的致病力进行测定，以筛选出在防治时所用的最佳浓度。供试昆虫与寄主植物烟粉虱，将温室中饲养在黄瓜上的烟粉虱成虫，接种到无虫的黄瓜幼苗上，产卵12h后，清除成虫，将黄瓜幼苗置于25±0.5"的光照培养箱中，待烟粉虱发育至2龄若虫时待用。黄瓜(C"c"m"MrimsL.)，品种为万吉青瓜，购自广东省农科院蔬菜研究所，试验苗均采用23片展开叶的盆栽苗。(1)供试菌株的处理经纯化后获得的蜡蚧轮枝菌VL-N6菌株，采用PDA平板，于25:b0.5。C的恒温箱(14L:10D)中培养15天，加入0.3%吐温一80的无菌水收集孢子，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌20分钟，待孢子被打散均匀后，用医用纱布过滤去杂质，获得孢子悬浮液，用血球记数板记数确定孢子浓度后，再配成lxl04、lxl05、lxl06、lxi07、lxl08孢子/ml5个浓度梯度待用。(2)分离株对烟粉虱若虫的致病力测定将带有烟粉虱2龄若虫的黄瓜叶片浸入5个梯度的孢子悬浮液中，对照浸入含0.03%吐温一80的无菌水中，20秒后取出，自然晾干。每处理为34片叶，每叶50100头若虫，3次重复。处理过的叶片连同黄瓜苗一起放置于25±0.5°C的光照培养箱中(L:D=14:10)。每日镜检并记录感染死亡率，连续观察14d。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。(3)蜡蚧轮枝菌株对烟粉虱2龄的累计死亡率接种后的第34天，各处理区的若虫开始表现出发病症状，随后可观察到虫体上有少量白色的菌丝长出，几天后虫体表面出现孢子，接着烟粉虱死亡。表4为蜡蚧轮枝菌处理后2龄若虫第7d、14d的累计死亡率，结果表明随着浓度的增加烟粉虱2龄的死亡率也增加，同一浓度下随着时间的增加，烟粉虱2龄的死亡率也增加。其中lxl(^和lxl()S处理区，烟粉虱的累计死亡率差异不显著。表4蜡蚧轮枝菌对烟粉虱2龄若虫的累计死亡率浓度7d14dlxl04O息l.(Bc0.55±4.23clxl050.34±0.98bc0.61±3.35bclxl060.42士1.64b0.70±2.38blxl070.57±2.45a0.89±3.06alxl080.63±2.31a0.94±3.15aCK0.06±0.87c0.08±0.68d注表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMKT法)。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。实施例3蜡阶轮枝菌VL-N6菌株对蚜虫的致病力测定供试昆虫与寄主植物蚜虫，将网室中饲养在小白菜上的蚜虫成虫，接种到无虫的小白菜幼苗上，产卵12h后，清除成虫，将小白菜幼苗置于2510.5t:的光照培养箱中，待蚜虫发育至3龄若虫时待用。小白菜c"m/7&s7r/j1L.ssp.chinensis)，购自广东省农禾斗院蔬菜研究所，试验苗均采用68片展开叶的盆栽苗。(1)供试菌株的处理经纯化后获得的蜡蚧轮枝菌VL-N6菌株，在PDA平板上于25:b0.5。C的恒温箱(14L:10D)中培养15天，加入0.03%吐温一80的无菌水收集孢子，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌20分钟，待孢子被打散均匀后，用医用纱布过滤去杂质，获得孢子悬浮液，用血球记数板记数确定孢子浓度后，再配成lxl04、lxl05、lxl06、lxl07、lxl08孢子/ml5个浓度梯度待用。(2)分离株对蚜虫的致病力测定将带有蚜虫3龄若虫的小白菜叶片浸入5个梯度的孢子悬浮液中，对照浸入无菌水中，20秒后取出，自然晾千。每处理为34片叶，每叶10头若虫，3次重复。处理过的叶片放入灭菌的托盘中(25cmx35cm)，并放置于25:t0.5。C的光照培养箱中(L:D=14:10)。每日镜检并记录感染死亡率，并更换新鲜的白菜叶片，连续观察10天。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。(3)蜡阶轮枝菌菌株对蚜虫3龄的累计死亡率接种后的第34天，各处理区的幼虫开始表现出发病症状，如虫体行动迟缓，随后可观察到虫体上有少量白色的菌丝长出，几天后虫体表面出现孢子，烟粉虱逐渐死亡。表5为蜡蚧轮枝菌处理3龄若虫后第7d、14d的累计死亡率，结果表明随着浓度的增加，蚜虫3龄的死亡率也增加，同一浓度下随着时间的增加，蚜虫3龄的死亡率也增加。其中lxl(^和lxl()S处理区，蚜虫的累计死亡率差异不显著。表5蜡蚧轮枝菌对蚜虫3龄若虫的累计死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。权利要求1、一种蜡蚧轮枝菌菌株，其特征在于所述菌株为蜡蚧轮枝菌VL-N6，菌株保藏号CCTCCNoM208086，2008年6月10日在中国典型培养物保藏中心保藏。2、根据权利要求1所述蜡蚧轮枝菌菌株，其特征在于所述蜡阶轮枝菌菌株属丝孢目，轮枝孢属。3、根据权利要求1所述蜡蚧轮枝菌菌株，其特征在于所述蜡阶轮枝菌菌株菌落白色至奶油色，薄絮状，背面无色至深浅不一的黄色。分生孢子梗不发达，似营养菌丝，其上有单生、对生或34个轮生的瓶梗，瓶梗纤细，大小因菌株及菌龄不同而差异较大，8.5—40x0.8一2.2pm;分生孢子椭圆形至圆柱形，两端圆，单生，在瓶梗顶部聚集成头状，大小因菌株及而变异较大，2.3—10xl—2.6拜。4、一种权利要求l所述蜡蚧轮枝菌菌株的应用，其特征在于应用于制备防治烟粉虱、温室白粉虱、蚜虫或蓟马的药物中。全文摘要本发明公开了一种蜡蚧轮枝菌菌株，所述菌株为蜡蚧轮枝菌VL-N6，菌株保藏号CCTCCNoM208086，2008年6月10日在中国典型培养物保藏中心保藏，所述菌株属丝孢目，轮枝孢属，是从广州地区被虫生真菌自然侵染的烟粉虱虫体上分离获得，将野生菌株回接于烟粉虱虫体上复壮获得蜡蚧轮枝菌菌株，对该菌株采用单孢子分离获得纯化菌株。经长期的侵染生物学研究和室内生物测定，蜡蚧轮枝菌对粉虱、蚜虫等多种刺吸式口器害虫和蓟马等害虫具有很强的侵染杀虫效果。文档编号C12N1/14GK101319193SQ20081002916公开日2008年12月10日申请日期2008年7月1日优先权日2008年7月1日发明者任顺祥,振黄申请人:华南农业大学