专利名称：强直性脊柱炎易感性检测方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及抗原肽转运蛋白
1 (Transporter of Antigen P印tides 1， TAP1)的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)及其与强直性脊柱炎的相关性。本发明还涉及 检测这些SNP的方法和试剂盒。
背景技术：
强直性脊柱炎又名别赫捷列夫氏(VonBechterev)病或马-施二氏(Maritstrumpell) 病，是一种慢性、进行性，中轴关节受累的慢性炎症性疾病。主要影响骨盆的骶 髂关节、脊柱关节和椎旁组织。主要症状为下腰痛、脊椎僵硬及运动范围受限、 X线显示两侧骶髂关节炎(sacroilitis)为其特征。由于该病一般先侵犯骶髂关节，并 重点累及脊柱，最终导致脊柱骨性强直，故目前国内外多称之为强直性脊柱炎 (Ankglosing Spondytitis， AS)。
强直性脊柱炎有明显的种族性，在不同民族中发病率的差异很大。印第安人 发病率最高，北美印第安人发病率为2.7% 6.3%。其次为白种人，白种人中发病 率为0.1% 1.4%。黄种人低于白种人,我国约为0.3%。而黑人发病率最低，约为 白人的l / 4，在非洲仅为0.2%。
强直性脊柱炎好发于20至40岁的成年人，尤其是20 30岁的青年男性。
强直性脊柱炎呈常染色体显性遗传，有明显的家族遗传倾向,遗传因素>90%。 据调査，强直性脊柱炎病人亲属发病率比一般人高一倍左右，同胞复发风险比为 82。 90。/。以上的AS病人具有HLA-B27阳性,在正常人群中阳性率为8。/。；子女HLA-B27阳性占50Y。，发生强直性脊柱炎的占25%。目前基本上已有定论，HLA-B27作 为独立的致病基因在AS的发病中起作用。因为在HLA-B27阳性个体中只有iy。
5y。发展成为AS，提示还有其他基因参与AS的发病。
近年来，单核苷酸多态性(SNP)和单倍型(haplotype)概念在多基因疾病研究 中的广泛运用，为在分子水平上研究强直性脊柱炎的发生和发展的机制开辟了全新的思路。同时，高通量、低成本的SNP检测手段的不断出现也为SNP大规模快速 分型提供了可能。
SNP的存在与否以及等位基因频率存在人种及地域的差异，这就提示多基因
疾病遗传异质性的存在，即同一疾病或性状在不同的人群中可能是不同的遗传因 素造成的。
另外，不同人群中SNP及其单倍型的类型和频率存在的这种差异可能与不同
人群对药物及环境因素的反应性不同密切相关。
强直性脊柱炎作为一种遗传因素起较大作用的疾病，寻找其相关基因进而阐 明强直性脊柱炎发病的遗传机制已经成为目前研究的热点。
虽然已有许多关于各种基因多态性与强直性脊柱炎的研究，但没有证实TAP1 基因与强直性脊柱炎相关性的报道，更没有证实本发明所述的TAP1基因SNP与强 直性脊柱炎相关性的报道。
综上所述，为了尽早诊断强直性脊柱炎，本领域迫切需要寻找强直性脊柱炎 易感基因，并开发检测强直性脊柱炎的方法和试剂盒。
发明内容
本发明的目的就是提供一种辅助诊断(尤其是早期诊断)强直性脊柱炎的方 法及检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种新的治疗强直性脊柱炎的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种对个体的强直性脊柱炎易感性进行诊断的 方法，它包括步骤
检测该个体的TAP1基因、转录本和/或蛋白，并与正常的TAP1基因、转录本 和/或蛋白相比较，
存在差异就表明该个体患强直性脊柱炎的可能性高于正常人群。
在另一优选例中，所述的方法中检测的是TAP1的基因或转录本，并与正常 TAP1核苷酸序列比较差异。
在另一优选例中，所述的差异是以下的单核苷酸多态性 430位G—T; 其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID N0:1。
在本发明的第二方面，提供了一种检测样品是否存在抗原肽转运蛋白1(TAP1)的单核苷酸多态性的方法，包括步骤-
(a) 用TAPl基因特异性引物扩增样品的TAPl基因，得到扩增产物；和
(b) 检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性
430位G—T; 其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID N0:1。
在另一优选例中，所述的基因特异性引物具有SEQ ID NO:2和3的序列。 在另一优选例中，所述的扩增产物的长度为100-2000bp，且含有SEQ ID N0:l中第430位。
在本发明的第三方面，提供了一种检测强直性脊柱炎的试剂盒，它包括特异 性扩增TAP1基因或转录本的引物，更佳地，所述的引物扩增出长度为IOO-2000bp，且含有SEQ ID NO: l中第430位的扩增产物。
在另一优选例中，所述试剂盒还含有选自下组的试剂
(a) 与SEQ ID N0:l中第430位的突变结合的探针；
(b) 识别SEQ ID N0:l中第430位的突变限制性内切酶。 在另一优选例中，所述的突变选自以下单核苷酸多态性
430位G—T; 其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID N0:1。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的SNP进行了测定和分 析。首次发现和证明了TAP1的基因组序列与强直性脊柱炎密切相关，其中关联研 究结果显示，在TAP1的SEQ ID NO:1中第430位的SNP(430位G—T)(记为RS2071482) 在对照组和病例组中的分布存在显著性差异(代O. 05),因此可作为辅助性检测强 直性脊柱炎(或其易感性)的特异性SNP。在此基础上完成了本发明。
TAP1基因
抗原肽转运蛋白l (Transporter of Antigen P印tides 1， TAP1)的序列是已 知，其详细序列和一些相关信息可参见网址http:〃www. ncbi. nlm. nih, gov/ Genebank/; http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/SNP。为了方便起见，在SEQ ID NO: 1给出TAP1中与本发明SNP相关的核苷酸序列。
TAP1基因位于6P21.3，大小为8.7k,共有ll个外显子。其编码的蛋白属于 ABC(ATP-结合盒)超家族的MDR/TAP亚家族。TAP是一类转运蛋白，分为TAP1和
6TAP2两种形式，表达于内质网膜表面，参与内源性抗原肽的处理和加工。蛋白酶 体水解产生的肽段在TAP1和TAP2组成的异二聚体的作用下转运至内质网腔，经由 内质网泵入膜分隔区，与HLAI类分子结合，形成稳定的HLA-Ag复合物，然后才能 表达于细胞表面并提呈给T细胞。抗原多肽可能就是这样呈递给CD8 + T淋巴细胞 受体而导致了关节炎的产生。TAP的多态性可使不同的肽转运至内质网。
现有的研究已发现TAP1基因与糖尿病、多发性硬化、原发性开角型青光眼、 青少年特发性关节炎、桥本氏甲状腺炎、牛皮癣、白癜风等多种自身免疫性疾病 及肿瘤的发生发展密切相关。其与AS(ankylosing spondylitis,强直性脊柱炎) 的关系也是值得探讨的研究方向。国外有研究发现TAP1某些位点在HLA-B27阳性 者和具有脊柱外疾病的AS患者中增加。我国有学者在安徽人群中的研究发现HLA-B27阳性个体中TAP1 333位Val/Val表型频率可能具有显著的AS抗性。
本发明人对TAP1基因中的几乎整个区域进行了测序，发现了许多SNP，其中 大部分SNP与强直性脊柱炎易感性并不相关，然而关联研究表明SEQ ID N0:1中 430位G—T却是与强直性脊柱炎易感性关联性非常高的SNP。
具体而言，本发明揭示了TAP1基因一种单核苷酸多态性(SNP)以及该多态性 与强直性脊柱炎的相关性。本发明的SNP是SEQ ID NO: l所示序列的第430位的 G/T多态，等位基因型T在强直性脊柱炎病人群中的频率，要高于在正常对照人群 中的频率。
基于本发明的新发现，TAP1蛋白或多肽有多方面的新用途。这些用途包括 (但不限于)用于辅助性诊断强直性脊柱炎。
另一方面，本发明还包括对人TAP1 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的 多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，"特异性"是指抗体能结合 于人TAP1基因产物或片段。较佳地，指那些能与人TAP1基因产物或片段结合但不 识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑 制人TAP1蛋白的分子，也包括那些并不影响人TAP1蛋白功能的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗 体片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分 子；或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如， 纯化的人TAP1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆 抗体的产生。与之相似的，表达人TAP1蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来 免疫动物来生产抗体。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来 制备。本发明的抗体包括能阻断人TAP1蛋白功能的抗体以及不影响人TAP1蛋白功 能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人TAP1基因产物的片段或功能区，通过常
规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合
成。与人TAPl基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E. Coli) 中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化 或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因 产物来免疫动物而获得。
抗人TAP1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人TAP1 蛋白的多少和/或突变与否。 一种优选的抗TAP1抗体是不识别正常TAP1但识别突 变TAP1的抗体，或者识别正常TAP1但不识别突变TAP1的抗体。利用这些抗体，可 以方便地进行蛋白质水平的强直性脊柱炎易感性检测。
利用本发明TAP1蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与TAP1蛋白发生相 互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明还涉及定量和定位检测人TAP1蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是 本领域所熟知的，且包括ELISA等。
一种检测检测样品中是否存在TAP1蛋白的方法是利用TAP1蛋白的特异性抗 体进行检测，它包括将样品与TAP1蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体 复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在TAP1蛋白。
TAP1蛋白的多聚核苷酸可用于TAP1蛋白相关疾病的辅助诊断。在诊断方面， TAP1蛋白的多聚核苷酸可用于检测TAP1蛋白的表达与否或在疾病状态下TAP1蛋白 的异常表达。如TAP1 DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断TAP1蛋白的表达异 常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方 法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸 的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为"基因 芯片")上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用TAP1蛋白特异的 引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测TAP1蛋白的转录产物。
检测可以针对cDNA,也可针对基因组DNA。 TAP1蛋白突变的形式包括与正常 野生型TAP1 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用 已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外， 突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判
8断基因有无突变。 '
最方便的检测本发明SNP的方法，是通过用TAP1基因特异性引物扩增样品的
TAP1基因，得到扩增产物；然后检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性
430位G—T，其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID N0:1。
应理解，在本发明首次揭示了TAP1基因的SNP与强直性脊柱炎的相关性之 后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含该SNP位置的扩增产 物，然后通过测序等方法确定是否存在430位G—T。通常，引物的长度为15-50bp，较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域 技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5'端)的情况下， 也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这 些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明 SNP的对应位置。一种优选的引物对具有SEQ ID N0:2和3的序列。
虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为ioo-2000bp，较佳地为150-1500bp，更佳地为200-1000bp。这些扩增产物都应含有 SEQ ID N0:l中第430位。
由于本发明的SNP与强直性脊柱炎具有非常高的关联性，因此不仅可用于早 期辅助性诊断强直性脊柱炎，而且可以未雨绸缪地使一些携带者在未发病前就采 取合理的预防措施，从而提高携带者的生存期和生存质量，因此具有极其重大的 应用价值和社会效益。当然，最终还应当用常规检测方法进行确诊。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。
实施例l
1. 1研究对象
病例样本全部采集自门诊病人，患者的诊断由仁济医院富有临床经验的风湿 病科医师根据1984年提出修订的纽约标准作出，并通过多次随访确诊。对照样本选自南方中心样本库中年龄、性别匹配，无关节炎病史的个体。
在知情同意的基础上随机收集了192个病人和463个正常对照个体的外周血样本。
1. 2实验方法和结果 1. 2.1 DNA提取
用常规酚氯仿法从人的外周血样本中提取DNA，浓度校正至20ng/ul后，用于 常规PCR扩增。
1.2.2 PCR及测序引物的设计
根据GenBank中TAPl的基因组序列，设计和合成以下引物。具体引物如下表l 所示。
表l引物序列表
引物名称序列(5'-3')SEQ ID NO:
有义引物GCTCCCCAGACAAGGTGATA2
反义引物GTTGGGGCCAGTGGAATAC3
1.2.3 TAP1基因的PCR扩增
以提取的DNA为模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700 PCR仪上以Touchdown程序 进行PCR扩增。反应条件为94。C预变性2分钟，94。C变性30秒，63。C退火40秒， 72。C延伸40秒，共10个循环，每个循环退火温度递减0.5。C;以后94。C变性30 秒，58。C退火40秒，72。C延伸40秒，共30个循环；最后72。C延伸7分钟。PCR扩增 产物经琼脂糖凝胶电泳验证。结果，获得TAP1的扩增产物。
1.2.4 SNP的发现和检测
PCR产物经Resin树脂纯化后，用ABI-3730 DNA测序仪(美国应用生物系统公 司appliedbiosystems(ABI))进行测序，用Polyphred软件(美国华盛顿大学 http:〃droog. mbt. Washington, edu/ Polyphred. html)进行序歹U的判读、基因分 型和SNP确认。
结果，发现存在数个SNP,其中包括以下SNP: SEQ IDNO:1中430位G—T(RS2071482)。
1.2.5 SNP基因分型和关联分析
用直接单向测序法进行SNP基因分型。即在强直性脊柱炎病人和正常对照组 中进行分型和关联分析。
对基因分型结果进行描述性统计分析，列联表进行卡方检验。观察基因型在 病人和对照之间是否具有差异。
分析结果如下在SEQ ID NO: l的第430位上，在463例对照中，GG 300例， GT 155例，TT 8例；在192例病例中GG 121例，GT 60例，TT ll例，两者具有显 著性差异，卡方检验P二0.021。 (GG+GT)/TT在对照和病例中分别为455/8和 181/11， P=0. 005。
上述结果综合表明G—T改变，增加了AS的易感性，等位基因型T与AS的发 生显著相关。换言之，SEQ ID NO: 1中430位的SNP与强直性脊柱炎的发生存在 着相关性。
实施例2
强直性脊柱炎易感性检测试剂盒
如实施例l所述，SEQ ID NO: 1中430位G—T的突变与强直性脊柱炎疾病密切 相关。因此，可基于这个突变设计TAP1基因特异性引物在以病人的DNA为模板进 行扩增进行检测。
制备一试剂盒(100人次)，它含有
名称序列浓度
有义引物SEQ ID NO: 2副pmol
反义引物SEQ ID NO: 3lOOpmol
PCR反应液含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液随机挑选100个人构成的测试组，其中包括未知是否患强直性脊柱炎的对
象、已知患强直性脊柱炎病人和经检测无强直性脊柱炎的正常人。
抽取测试组中待检测对象的外周血3ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将强直性脊柱炎检测试剂盒中的PCR引物稀释到 limol/il，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化 后，用ABI 3730 DNA测序仪进行测序，用Polyphred软件进行序列的判读和 SNP确认。
或者，将扩增产物与正常对照用变性高效液相色谱仪(DHPLC)进行色谱分 析，也可检测出430位G—T。 检测结果-
对于TAP1存在430位G—T的对象，进一步通过常规方法检测以确认是否患 有强直性脊柱炎情况。检测结果表明，含430位G—T的检测对象的强直性脊柱 炎易感性比例明显高于不含G正常人群(高出至少80。/。)。
因此，这表明通过检测TAP1的430位G—T，可进行强直性脊柱炎的辅助性 检测。
实施例3
强直性脊柱炎易感性辅助性检测
重复实施例2的检测，不同点在于随机选取了75个人(检测前不知道是否有强 直性脊柱炎症状)进行检测。
制备一试剂盒(100人次)，它含有
名称序列浓度
有义引物SEQ ID NO: 2lOOpmol
反义引物SEQ ID NO: 3lOOpmol
PCR反应液含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液抽取待检测对象的外周血3ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血 液中提取DNA。将强直性脊柱炎检测试剂盒中的PCR引物稀释到limol/U,以所 提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI 3730 DNA测序仪进行测序，用Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。
结果同样证实了，含430位G—T的检测对象的强直性脊柱炎比例明显高于 该位点为GG的检测对象(高至少80%)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文
12献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容
之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样 落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表
〈110〉上海人类基因组研究中心
〈120>强直性脊柱炎易感性检测方法和试剂盒3
<130〉 081332
<160〉 3
<170〉 Patentln version 3.4
〈210〉 1 〈211〉 739 <212〉,
〈213〉 智人(Homo sapiens)
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 739
〈210〉 2
<211〉 20
〈212〉 DNA <213>引物
〈400〉 1 gctccccaga
gcattgagtc
cgatgtcact
gtgtcccctc
ggtatgctgc
gt卿C3gtg
gaggtg鄉t ctgtgtgatg acctcacttt ag卿gctgt
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gCtCCCCElga C33ggtg3t3 20
<210> 3
<211〉 19
<212〉 DNA
<213〉 引物
<400〉 3
gttggggcc3 gtgg犯tac 19
权利要求
1.一种体外检测样品是否存在抗原肽转运蛋白1(TAP1)的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括步骤(a)用TAP1基因特异性引物扩增样品的TAP1基因，得到扩增产物；和(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性430位G→T；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因特异性引物具有SEQ ID NO:2和3的序列。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的扩增产物的长度为100-2000bp且含有SEQ ID N0:l中第430位。
4. 一种检测强直性脊柱炎的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增TAP1基 因或转录本的引物，所述的引物扩增出长度为100-2000bp且含有SEQ ID NO:l中 第430位的扩增产物。
5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，它还含有选自下组的试剂(a) 与SEQ ID N0:l中第430位的突变结合的探针；(b) 识别SEQ ID N0:l中第430位的突变限制性内切酶。
6. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的突变是以下的单核苷酸 多态性430位G—T; 其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID N0:1。
7. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物具有SEQ ID N0:2 和3的序列。
8. —种对个体的强直性脊柱炎易感性进行诊断的方法，其特征在于，它包括 步骤检测该个体的TAP1基因、转录本和/或蛋白，并与正常的TAP1基因、转录本 和/或蛋白相比较，其中，存在差异就表明该个体患强直性脊柱炎的可能性高于正常人群。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，检测的是TAP1的基因或转录本， 并与正常TAP1核苷酸序列比较差异。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的差异是以下的单核苷酸 多态性430位G—T; 其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID N0:1。
全文摘要
本发明公开了一种检测强直性脊柱炎易感性的方法，它包括检测个体的抗原肽转运蛋白1(TAP1)、转录本和/或蛋白与正常相比是否存在变异，存在变异就表明该个体患强直性脊柱炎的可能性大于正常人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK101525657SQ20081003422
公开日2009年9月9日 申请日期2008年3月5日 优先权日2008年3月5日
发明者牛振民, 蓉 雷, 薇 黄 申请人:上海人类基因组研究中心