专利名称：一种利用真菌诱导子提高灵芝酸含量的灵芝菌丝体液体发酵方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用真菌诱导子生 产高产量灵芝酸的液体发酵方法。
背景技术：
灵芝(GafW06fe^wa 为担子菌纲、多孑L菌科、灵芝菌属
真菌。现代药理学研究表明灵芝具有抗肿瘤、抗衰老、防止动脉硬化 等作用，而且对心脑血管疾病具有较高的药理活性。灵芝中的多糖、 三萜类物质(主要为灵芝酸)、生物碱、氨基酸多肽、微量元素等成 分是灵芝的药效物质基础。其中灵芝酸是灵芝治疗高血压、高血脂、 失眠和多种呼吸系统疾病(如去痰、止咳、平喘)以及抗肿瘤等的物 质基础。在灵芝药用价值被广泛揭示的同时，灵芝的产量成为抑制灵 芝应用的限制因素，因为在自然界中野生灵芝十分稀少，且其中灵芝 酸含量仅为1毫克/100毫克干重，远不能满足人们的需要。同灵芝人 工栽培相比，发酵法生产灵芝有效成分由于生产周期短、劳动力省以 及受外部环境影响小等优点被认为是一种有效的方法。
近年来，利用特定的真菌菌株的提取物作为诱导子来提高植物 细胞中某些次生代谢产物的积累量，在植物细胞悬浮培养中已获得了 巨大成功。但是，将真菌诱导子用于食药用真菌细胞培养的报道很少， 目前仅见关于用真菌诱导子提高虫草菌素液体发酵生产的报道，而用 于灵芝发酵培养以提高灵芝酸产量等次生代谢产物的研究尚未见报 道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述已有技术的不足而提供一种工艺简 单、成本低、效果显著，灵芝酸含量高的利用真菌诱导子生产高产量 灵芝酸的液体发酵方法，本方法可用于灵芝酸的工业化生产。
本发明的目的可以通过如下措施来达到 一种利用真菌诱导子提 高灵芝酸含量的灵芝菌丝体液体发酵方法，其特征在于包括如下步(1)真菌诱导子的制备-
① 真菌诱导子菌株的培养将真菌诱导子菌种接种于PDA斜面 培养基上活化后，转接到PDA平板培养基上，25 3(TC培养3 5天， 取菌块接种于装有PDA液体培养基的三角瓶中，于25 30°C、 100 180r/min摇床中培养5~7天后，过滤得到菌丝体备用；
② 真菌诱导子制备将真菌诱导子菌丝体于60 7(TC下烘干，研 磨破碎，按重量体积比l: 2~1: 5的比例加入浓度为65 85%乙醇， 在室温下浸泡10~15小时，减压抽滤，收集滤渣，滤渣按重量体积
比l: 2~1: 5的比例加入氯仿和正丁醇的混合液，氯仿与正丁醇的体 积比为3: 1~5: 1，洗滤渣3 5次，然后滤渣按重量体积比l: 3~1: 5的比例用丙酮冲洗后，滤渣按重量体积比l: 3 1: 5的比例再用水 冲洗，自然风干，干物质按重量体积比l: 5~1: 7的比例加入浓度为
5~15%三氟乙酸，沸水浴酸解0.5 2小时，水解物过滤，取滤液，用 NaOH中和至pH为4~7，在3匸 8'C下静置10 15小时，过滤除 菌，制成真菌诱导子，冷冻保存； (2)灵芝的液体发酵培养
将斜面保藏的灵芝菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培 养，培养温度25 30'C，培养时间5 10天，然后取菌块接种于装有 液体发酵培养基的中三角瓶进行发酵培养，摇床转速100-180 r/min， 温度25 30'C，时间5~8天；
液体发酵培养基组成葡萄糖20 50g/L、酵母膏2 8g/L、蛋白 胨2~8 g/L、磷酸二氢钾0.5~2.0g/L、硫酸镁0.1 1.0 g/L、维生素B！ 0.01~0.10g/L，余量为蒸馏水；
(3)灵芝与真菌诱导子共培养:
在灵芝液体发酵培养第1~5天，加入真菌诱导子，使真菌诱导子 浓度达到40~120pg/mL，然后继续培养2 7天，得到灵芝菌丝体。
为了进一步实现本发明的目的，所述的真菌诱导子菌种为枝顶孢 属真菌顶头孢(爿cre附o"/wms^7'"wm)，菌种编号CGMCC No.3.2058; 或木霉属真菌木素木霉(7Hc/2o&rma vzW&)，菌种编号为CGMCC No. 3.2196;或轮枝'菌属真菌蘑燕轮枝孢(FeW/c/〃/"w/ ^//zbtoe)，菌种编 号为CGMCC No. 3.4423。
为了进一步实现本发明的目的，所述的发酵用灵芝菌种为普通栽
培品种(Ga"oAmfl/Mc/由/w)，购自中国普通微生物菌种保藏中心， 编号为CGMCC No. 5.644。
为了进一步实现本发明的目的，所述的真菌诱导子菌株的培养步 骤中取直径0.3~0.6cm的菌块3~5块，接种于PDA液体培养基中， 每500mL三角瓶装PDA液体培养基100~200mL。
为了进一步实现本发明的目的，所述的灵芝的液体发酵培养步骤 中取直径0.3~0.6cm的菌块3 5块，接种于液体发酵培养基中，每 500mL三角瓶装PDA液体培养基100~200mL。
为了进一步实现本发明的目的，所述的灵芝与真菌诱导子共培养 步骤中真菌诱导子加入浓度为80pg/mL。
为了进一步实现本发明的目的，所述的灵芝与真菌诱导子共培养 步骤中真菌诱导子于灵芝发酵培养的第1天加入，然后与灵芝共同培 养。
为了进一步实现本发明的目的，所述的灵芝与真菌诱导子共培养 步骤中真菌诱导子于灵芝发酵培养的第3天加入，然后与灵芝共同培养。
为了进一步实现本发明的目的，所述的灵芝与真菌诱导子共培养 步骤中真菌诱导子于灵芝发酵培养的第5天加入，然后与灵芝共同培 养。
本发明同已有技术相比可产生如下积极效果本发明将真菌诱导 子用于灵芝酸的液体发酵生产，大幅度提高灵芝酸的含量(由 0.8mg/100mg菌丝提高到3.2mg/100mg菌丝)，该新方法操作工艺简 单，成本低廉，具有很好的工业化应用前景。
具体实施例方式下面对本发明的具体实施方式
作详细说明
实施例h
菌种真菌诱导子菌种为枝顶孢属真菌顶头孢(JCM附om'WW
^n'"wm)，由中国普通微生物菌种保藏中心购买，菌种编号为CGMCC No. 3.2058。
灵芝菌种为普通栽培品种((7"w^fe^a/wc/^附)，购自中国普通 微生物菌种保藏中心，编号为CGMCC No. 5.644。
一种利用真菌诱导子提高灵芝酸含量的灵芝菌丝体液体发酵方 法，其特征在于包括如下步骤-
(1)真菌诱导子的制备
① 真菌诱导子菌株的培养将真菌诱导子菌种接种于PDA斜面 培养基上活化后，转接到PDA平板培养基上，25。C培养5天，用打 孔器在菌落边缘打取直径0.3cm的菌块3块，接种于PDA液体培养 基中，每500mL三角瓶装PDA液体培养基lOOmL，于25°C 、 lOOr/min 摇床中培养7天后，过滤得到菌丝体备用；
② 真菌诱导子制备将真菌诱导子菌丝体于60 。C下烘干，研磨 破碎，按重量体积比l: 2的比例加入浓度为65%乙醇，在室温下浸 泡10小时，减压抽滤，收集滤渣，滤渣按重量体积比l: 2的比例加 入氯仿和正丁醇的混合液，氯仿与正丁醇的体积比为3: 1,洗滤渣 3~5次，然后滤渣按重量体积比1: 3的比例用丙酮冲洗后，滤渣按
重量体积比l: 3的比例再用水冲洗，自然风干，干物质按重量体积
比1: 5的比例加入浓度为5 %三氟乙酸，沸水浴酸解0.5小时，水解 物过滤，取滤液，用NaOH中和至pH为5.8，在3'C下静置10小 时，过滤除菌，制成真菌诱导子，冷冻保存； (2)灵芝的液体发酵培养
将斜面保藏的灵芝菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培 养，培养温度25"C，培养时间10天，然后用打孔器在菌落边缘打取 直径0.3cm的菌块3块，接种于液体发酵培养基中进行发酵培养，每 500mL三角瓶装培养基100mL，，摇床转速100 r/min，温度25°C, 时间8天；
液体发酵培养基组成葡萄糖20 g/L、酵母膏2 g/L、蛋白胨2g/L、 磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸镁0.1g/L、维生素B,0.01g/L，余量为蒸馏 水；
(3) 灵芝与真菌诱导子共培养-在灵芝液体发酵培养第1天，加入真菌诱导子，使真菌诱导子终
浓度达到40pg/mL,然后继续培养7天，得到灵芝菌丝体。
(4) 灵芝酸的提取和检测
将灵芝菌丝体烘干，取0.5g样品(干重)研成粉末，加30mL 甲醇超声提取2小时，过滤，上清蒸干，加甲醇定容至2mL，紫外 比色法测定灵芝酸含量为3.2mg/100mg菌丝(干重)。
实施例2: 菌种真菌诱导子菌种为木霉属真菌木素木霉(7Hc/wcfew2a
vzW&)，由中国普通微生物菌种保藏中心购买，菌种编号为CGMCC No. 3.2196。
灵芝菌种为普通栽培品种(Ga"0&w7a/wcWwm)，购自中国普通 微生物菌种保藏中心，编号为CGMCC No. 5.644。
一种利用真菌诱导子提高灵芝酸含量的灵芝菌丝体液体发酵方 法，其特征在于包括如下步骤
(1)真菌诱导子的制备
① 真菌诱导子菌株的培养将真菌诱导子菌种接种于PDA斜面
培养基上活化后，转接到PDA平板培养基上，30'C培养3天，用打 孔器在菌落边缘打取直径0.6cm的菌块5块，接种于PDA液体培养 基中，每500rnL三角瓶装PDA液体培养基200mL，于30°C 、 180r/min 摇床中培养5天后，过滤得到菌丝体备用；
② 真菌诱导子制备将真菌诱导子菌丝体于70 。C下烘干，研磨
破碎，按重量体积比h 5的比例加入浓度为85%乙醇，在室温下浸 泡15小时，减压抽滤，收集滤渣，滤渣按重量体积比1: 5的比例 加入氯仿和正丁醇的混合液，氯仿与正丁醇的体积比为5: 1，洗滤 渣5次，然后滤渣按重量体积比l: 5的比例用丙酮冲洗后，滤渣按 重量体积比l: 5的比例再用水冲洗，自然风干，干物质按重量体积 比h 7的比例加入浓度为15%三氟乙酸，沸水浴酸解2小时，水解 物过滤，取滤液，用NaOH中和至pH为4，在8"C下静置15小时， 过滤除菌，制成真菌诱导子，冷冻保存； (2)灵芝的液体发酵培养
将斜面保藏的灵芝菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培 养，培养温度3(TC，培养时间5天，然后用打孔器在菌落边缘打取 直径0.6cm的菌块5块，接种于液体发酵培养基中进行发酵培养，每 500mL三角瓶装培养基200mL，，摇床转速180 r/min，温度30°C，
时间5天；
液体发酵培养基组成:葡萄糖50 g/L、酵母膏8 g/L、蛋白胨8 g/L、 磷酸二氢钾2.0g/L、硫酸镁1.0g/L、维生素B^.10g/L，余量为蒸馏 水；
(3)灵芝与真菌诱导.子共培养
在灵芝液体发酵培养第5天，加入真菌诱导子，使真菌诱导子终 浓度达到120pg/mL，然后继续培养2天，得到灵芝菌丝体。 (4)灵芝酸的提取和检测
将灵芝菌丝体烘干，取lg样品(干重)研成粉末，加50mL甲 醇超声提取5小时，过滤，上清蒸干，加甲醇定容至5mL，紫外比 色法测定灵芝酸含量为2.5mg/100mg菌丝(干重)。
实施例3:
菌种真菌诱导子菌种为轮枝菌属真菌蘑菇轮枝孢(KW"7/^m 戸"〃/otoe)，由中国普通微生物菌种保藏中心购买，菌种编号为
CGMCC No. 3.4423。
灵芝菌种为普通栽培品种(Gawo6ferwfl /wc^ww)，购自中国普通 微生物菌种保藏中心，编号为CGMCCNo. 5.644。
一种利用真菌诱导子提高灵芝酸含量的灵芝菌丝体液体发酵方 法，其特征在于包括如下步骤
(1)真菌诱导子的制备
① 真菌诱导子菌株的培养将真菌诱导子菌种接种于PDA斜面 培养基上活化后，转接到PDA平板培养基上，28。C培养4天，用打 孔器在菌落边缘打取直径0.4cm的菌块4块，接种于PDA液体培养 基中，每500mL三角瓶装PDA液体培养基150mL，于28°C、 150r/min 摇床中培养6天后，过滤得到菌丝体备用；
② 真菌诱导子制备将真菌诱导子菌丝体于65 。C下烘干，研磨 破碎，按重量体积比l: 3的比例加入浓度为75%乙醇，在室温下浸 泡12小时，减压抽滤，收集滤渣，滤渣按重量体积比l: 4的比例加 入氯仿和正丁醇的混合液，氯仿与正丁醇的体积比为4: 1，洗滤渣 4次，然后滤渣按重量体积比1: 4的比例用丙酮冲洗后，滤渣按重 量体积比l: 4的比例再用水冲洗，自然风干，干物质按重量体积比 1: 6的比例加入浓度为10 %三氟乙酸，沸水浴酸解1.5小时，水解
物过滤，取滤液，用NaOH中和至pH为7，在5'C下静置12小时， 过滤除菌，制成真菌诱导子，冷冻保存； (2)灵芝的液体发酵培养-
将斜面保藏的灵芝菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培 养，培养温度28"C，培养时间8天，然后用打孔器在菌落边缘打取
直径0.4cm的菌块4块，接种于液体发酵培养基中进行发酵培养，每 500mL三角瓶装培养基150mL，，摇床转速150 r/min，温度28。C， 时间7天；
液体发酵培养基组成:葡萄糖35 g/L、酵母膏5 g/L、蛋白胨5 g/L、 磷酸二氢钾lg/L、硫酸镁0.5 g/L、维生素B, 0.05 g/L，余量为蒸馏水;
(3) 灵芝与真菌诱导子共培养-在灵芝液体发酵培养第3天，加入真菌诱导子，使真菌诱导子终
浓度达到8(Hig/mL，然后继续培养5天，得到灵芝菌丝体。
(4) 灵芝酸的提取和检测
将灵芝菌丝体烘干，取0.8g样品(干重)研成粉末，加40mL 甲醇超声提取3小时，过滤，上清蒸干，加甲醇定容至4mL，紫外比 色法测定灵芝酸含量为2.3mg/100mg菌丝(干重)。
本发明真菌诱导子菌种还可采用其他同类菌种，灵芝菌种也可采 用其他普通栽培品种。
权利要求
1、一种利用真菌诱导子提高灵芝酸含量的灵芝菌丝体液体发酵方法，其特征在于包括如下步骤(1)真菌诱导子的制备①真菌诱导子菌株的培养将真菌诱导子菌种接种于PDA斜面培养基上活化后，转接到PDA平板培养基上，25～30℃培养3～5天，取菌块接种于装有PDA液体培养基的三角瓶中，于25～30℃、100～180r/min摇床中培养5～7天后，过滤得到菌丝体备用；②真菌诱导子制备将真菌诱导子菌丝体于60～70℃下烘干，研磨破碎，按重量体积比1∶2～1∶5的比例加入浓度为65～85％乙醇，在室温下浸泡10～15小时，减压抽滤，收集滤渣，滤渣按重量体积比1∶2～1∶5的比例加入氯仿和正丁醇的混合液，氯仿与正丁醇的体积比为3∶1～5∶1，洗滤渣3～5次，然后滤渣按重量体积比1∶3～1∶5的比例用丙酮冲洗后，滤渣按重量体积比1∶3～1∶5的比例再用水冲洗，自然风干，干物质按重量体积比1∶5～1∶7的比例加入浓度为5～15％三氟乙酸，沸水浴酸解0.5～2小时，水解物过滤，取滤液，用NaOH中和至pH为4～7，在3℃～8℃下静置10～15小时，过滤除菌，制成真菌诱导子，冷冻保存；(2)灵芝的液体发酵培养将斜面保藏的灵芝菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度25～30℃，培养时间5～10天，然后取菌块接种于装有液体发酵培养基的中三角瓶进行发酵培养，摇床转速100～180r/min，温度25～30℃，时间5～8天；液体发酵培养基组成葡萄糖20～50g/L、酵母膏2～8g/L、蛋白胨2～8g/L、磷酸二氢钾0.5～2.0g/L、硫酸镁0.1～1.0g/L、维生素B10.01～0.10g/L，余量为蒸馏水；(3)灵芝与真菌诱导子共培养在灵芝液体发酵培养第1～5天，加入真菌诱导子，使真菌诱导子浓度达到40～120μg/mL，然后继续培养2～7天，得到灵芝菌丝体。
2、根据权利要求1所述的一种利用真菌诱导子提高灵芝酸含量 的灵芝菌丝体液体发酵方法，其特征在于所述的真菌诱导子菌种为枝 顶孢属真菌顶头孢(Are附om'wm s/n'c^/w)，菌种编号CGMCC No.3.2058;或木霉属真菌木素木霉(7h'c/2ocferw" v/nVfe)，菌种编号 为CGMCC No. 3.2196;或轮枝菌属真菌蘑燕轮枝孢(Kr//c////ww 戸a〃/otoe)，菌种编号为CGMCC No. 3.4423 。
3、 根据权利要求1所述的一种利用真菌诱导子提高灵芝酸含量 的灵芝菌丝体液体发酵方法，其特征在于所述的发酵用灵芝菌种为普 通栽培品种(G^^fem7"/wc/^m)，购自中国普通微生物菌种保藏中 心，编号为CGMCC No. 5.644。
4、 根据权利要求1所述的一种利用真菌诱导子提高灵芝酸含量 的灵芝菌丝体液体发酵方法，其特征在于所述的真菌诱导子菌株的培 养步骤中取直径0.3~0.6cm的菌块3~5块，接种于PDA液体培养基 中，每500mL三角瓶装PDA液体培养基100~200mL。
5、 根据权利要求1所述的一种利用真菌诱导子提高灵芝酸含量 的灵芝菌丝体液体发酵方法，其特征在于所述的灵芝的液体发酵培养 步骤中取直径0.3 0.6cm的菌块3~5块，接种于液体发酵培养基中， 每500mL三角瓶装PDA液体培养基100~200mL。
6、 根据权利要求1所述的一种利用真菌诱导子提高灵芝酸含量 的灵芝菌丝体液体发酵方法，其特征在于所述的灵芝与真菌诱导子共 培养步骤中真菌诱导子加入浓度为8(Vg/mL。
7、 根据权利要求1所述的一种利用真菌诱导子提高灵芝酸含量 的灵芝菌丝体液体发酵方法，其特征在于所述的灵芝与真菌诱导子共 培养步骤中真菌诱导子于灵芝发酵培养的第1天加入，然后与灵芝共 同培养。
8、 根据权利要求1所述的一种利用真菌诱导子提高灵芝酸含量 的灵芝菌丝体液体发酵方法，其特征在于所述的灵芝与真菌诱导子共 培养步骤中真菌诱导子于灵芝发酵培养的第3天加入，然后与灵芝共 同培养。
9、 根据权利要求1所述的一种利用真菌诱导子提高灵芝酸含量 的灵芝菌丝体液体发酵方法，其特征在于所述的灵芝与真菌诱导子共 培养步骤中真菌诱导子于灵芝发酵培养的第5天加入，然后与灵芝共 同培养。
全文摘要
本发明涉及了一种利用真菌诱导子提高灵芝酸含量的灵芝菌丝体液体发酵方法，其包括真菌诱导子的制备，灵芝的液体发酵培养，灵芝与真菌诱导子共培养步骤，本方法工艺简单、成本低、效果显著，灵芝酸含量高，是一种极具工业化前景的生产方法。
文档编号C12R1/645GK101353676SQ20081013857
公开日2009年1月28日 申请日期2008年7月21日 优先权日2008年7月21日
发明者刘林德, 张秋胜, 杨润亚, 玥 王, 凯 韩, 高兴喜 申请人:鲁东大学