专利名称：甘蓝型油菜种子内不同来源fad2基因表达的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及利用单核苷酸多态性(SNP)技术建立检测甘蓝型油菜种子中来 自A基因组和C基因组FAD2基因表达的有效检测方法，属于生物技术领域。
背景技术：
油菜是世界第三大经济作物，而菜籽油已成为第二大植物油。我国油菜种 植面积1亿多亩，位列全世界首位。目前，油菜育种的主要目标之一是在双低 的基础上选育高油酸品种。在功能上，饱和脂肪酸低于3%、油酸含量接近90 %的油是一种非常有利健康的食用油。高油酸油有很多优点，如高温时不易冒 烟；油酸能降低低密度脂胆固醇和抑制低密度脂氧化，预防冠状动脉疾病的作 用；油酸有杀死乳腺癌的作用，油酸在保健方面比亚油酸更为重要。在能源危 机的今天，油酸(18:1)为十八碳链，与柴油碳链长度相当，是生物柴油的理想 来源。
甘蓝型油菜是全世界主要的栽培油菜，遗传上讲它是异源四倍体(AACC)。 已有的实验证实油菜籽油中油酸含量的高低取决于脂肪酸脱饱和酶2 (FAD2) 活性高低，而FAD2活性的高低直接由FAD2基因的表达量控制。现有检测FAD2 基因的表达的方法为特异引物RT-PCR和特异探针Northern分析方法。但是现 有的特异引物RT-PCR不能区分表达的FAD2基因是来自A基因组还是来自C 基因组，其中A基因组为白菜(^ra^/M caw/^/n;y， AA， 2n-20)的基因组；C基因 组为甘蓝(Braw/ca o/eracw, CC， 2t^l8)的基因组；Northern分析方法不仅不能区 分表达的FAD2基因是来自A基因组还是来自C基因组，而且由于方法本身的原因，无法在育种过程中用于大规模筛。为了进一步研究油菜籽油酸形成的分 子调控机理，加快高油酸油菜品种选育的步伐，非常需要有一种能有效区分表
达的FAD2基因是来自A基因组还是C基因组的检测方法。
发明内容
本发明的目的是建立一种能快速、简便、有效区分种子中表达的FAD2基 因是来自A基因组还是C基因组的检测方法。
本发明的第一发明目的是通过以下技术方案实现的，包括如下步骤
1. FAD2基因的克隆与测序
根据已发表的拟南芥FAD2基因和油菜FAD2基因的全长cDNA序列，通 过生物信息学分析，设计一对FAD2基因全长cDNA的简并引物。由于FAD2 基因的编码区没有内含子，所以利用简并引物直接对甘蓝型油菜(AACC)的基 因组DNA进行高保真PCR扩增。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，胶回 收，获得纯化的目的DNA片段。将目的片段加尾后克隆到T-载体上，然后将带 有目的片段的载体转到感受态的大肠杆菌DH5a中，再将转化后的菌液铺到卡 那霉素的筛选培养基上筛选出抗性克隆。随机挑选30个克隆进行测序。将去掉 载体序列的目标DNA测序通过NCBI上的Blast的比对分析，确定这30条序列 都是来自FAD2基因。
2. SNP位点的筛选
利用DNAStar软件，将来自我们自己测得的FAD2基因的DNA序列连同网 上已经公布的来自白菜(AA)、甘蓝(CC)和甘蓝型油菜(AACC)的FAD2基因 的cDNA序列进行序列比对分析，寻找单核苷酸差异SNP的部位。通过比较， 筛选出了四个SNP位点从FAD2基因的cDNA序列上的起始密码子ATG开始计数，1)在700bp到760bp之间，来自A基因组的5'-CGCrGCr-3，片段上的
第4位点和第8位点的胸腺嘧啶脱氧核苷酸T (斜体标记)与来自C基因组的 5'-CGCCGCC-3，片段上的第4位点和第8位点的胞嘧啶脱氧核苷酸C (斜体标 记)组成两个SNP位点；2)在920bp至U 1000bp之间，来自A基因组的 5，-CACGGAC-3，片段上第1位点的胞嘧啶脱氧核苷酸C (斜体标记)和第4位 点的鸟嘌呤脱氧核苷酸G (斜体标记)与来自C基因组的5'-rACCGAC-3'片段 上第1位点的胸腺嘧啶脱氧核苷酸T (斜体标记)和第4位点的胞嘧啶脱氧核苷 酸C (斜体标记)组成两个SNP位点。这四个SNP位点具体见图1中红色箭头 所指。
3. SNP引物对的设计
根据引物延伸的设计策略设计SNP引物对，引物设计软件为PrimerPriemer5。 其中一条引物以上述四个SNP位点的核苷酸之一作为该引物的3'端，设计一条 SNP特异引物；另一条引物的设计是在选定的SNP位点的上下游找到来自A基 因组和C基因组FAD2基因的共同的序列，针对共同序列设计一条共用引物。 由一条共用引物和一条SNP特异引物组成一个SNP引物对。 一个SNP引物对 只能使来自A基因组的FAD2基因有扩增产物，来自C基因组的FAD2基因没 有扩增产物；另一个SNP引物对，只能使来自C基因组的FAD2基因有扩增产 物，来自A基因组的FAD2基因没有扩增产物。最好使这两组SNP引物对的PCR 扩增产物的分子量大小不同。
4. 种子总RNA的分离和反转录
利用总RNA分离试剂盒从油菜种子中分离总RNA。然后以总RNA为模板， 多聚胸腺嘧啶脱氧核苷酸dT (Polydeoxythymidineacid)为引物，根据逆转录试 剂盒的说明，在逆转录缓冲液中，通过逆转录酶合成cDNA。再以cDNA为模板，进行SNP特异引物PCR扩增，检验SNP位点的有效性。 5. SNP位点有效性的验证
从白菜(AA)、甘蓝(CC)和甘蓝型油菜(AACC)发育40天的种子(时间 计算是从开花后开始计时)中分离RNA，通过反转录，得到各自的cDNA，再 以各自的cDNA为模板，进行SNP特异引物PCR扩增。扩增产物通过琼脂糖凝 胶电泳分离和溴化乙锭染色荧光分析。如果来自A基因组和C基因组的FAD2 基因的扩增片段大小不能用琼脂糖凝胶电泳有效分离，则区分来自A基因组和 C基因组的FAD2基因表达的扩增反应分别在不同的PCR管中进行。相反，如 果来自A基因组和C基因组的FAD2基因的扩增片段大小能用琼脂糖凝胶电泳 有效分离，则区分来自A基因组和C基因组FAD2基因表达的扩增反应可在同 一个PCR管中进行。根据有无扩增带和扩增带的大小来确定设计的SNP引物对 是否能区分FAD2基因是来自A基因组还是来自C基因组。对能够区分A基因 组和C基因组FAD2基因的两个SNP引物对，增加白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的 检验材料，进一步检验SNP引物对的有效性。最终获得能区分FAD2基因是来 自A基因组还是来自C基因组的SNP引物对。
在一个实施方案中，如果电泳分离的扩增片段大小约为430bp，说明表达的 FAD2基因是来自A基因组；
在另一个实施方案中，如果电泳分离的扩增片段大小约为630bp，说明表达 的FAD2基因是来自C基因组；
在另一个实施方案中，如果电泳分离的扩增片段同时具有约430bp和630bp 两条扩增片段，说明表达的FAD2基因分别来自A基因组和C基因组。
本发明的第二发明目的是提供用于检测甘蓝型油菜种子内不同来源FAD2基因的SNP位点，其中，从FAD2基因的cDNA序列上的起始密码子ATG开始计 数，1)在700bp到760bp之间，来自A基因组的5，-CGCrGCr-3，片段上的第4 位点和第8位点的胸腺嘧啶脱氧核苷酸T (斜体标记)与来自C基因组的 5'-CGCCGCC-3'片段上的第4位点和第8位点的胞嘧啶脱氧核苷酸C (斜体标 记)组成两个SNP位点；2)在920bp到1000bp之间，来自A基因组的 5，-CACC7GAC-3'片段上第1位点的胞嘧啶脱氧核苷酸C (斜体标记)和第4位 点的鸟嘌呤脱氧核苷酸G (斜体标记)与来自C基因组的5'-rACCGAC-3'片段 上第1位点的胸腺嘧啶脱氧核苷酸T (斜体标记)和第4位点的胞嘧啶脱氧核苷 酸C (斜体标记)组成两个SNP位点。这四个SNP位点具体见图1中红色箭头 所指。
本发明的第三发明目的是提供通过第一发明目的而制备的特异引物组，该 引物组可用于检测甘蓝型油菜种子内不同来源FAD2基因的SNP。其中，弓l物组 由相同的正向引物和两条用于扩增不同SNP的反向引物组成。
在一个具体实施方案中，所述的引物组中，共同的正向(forward)引物(FFP) 序列SEQIDNO: 1为5，-CCACGCCTTCAGCGACCACCAG-3，；所述的引物组 中，用于检测A基因组中的SNP的反向(reverse)引物FRAP430的序列SEQ ID NO:2为5，-CATCGAGGCAACTCCTTGGACAGCA-3，，而用于检测C基因组 中的SNP的反向(reverse)引物FRCP630的序列SEQ ID NO:3为 5,-TGCGCCACGTGCGTGTCGGTA画3 。
本发明的优势禾U用SNP特异引物组进行PCR，能够简便、快速地检验表 达的FAD2基因是来自A基因组还是来自C基因组，或这两类FAD2基因同时 表达，解决了当前对油菜油酸代谢调控研究和高油酸品种选育过程中的一个瓶 颈问题。
图l四个SNP位点标示图，其中箭头所示SNP位点。
图2甘蓝、白菜和甘蓝型油菜SNP特异引物PCR扩增产物凝胶电泳图。
具体实施例方式
下面结合附图和实例对本发明作进一步描述，但不意味限制本发明的范围。 实施例
1) 引物设计。在这四个已知的SNP位点的5'端选取一段在A基因组和C 基因组上共有相同的22nt长的片段5'-CCACGCCTTCAGCGACCACCAG-3，作 为正向(forward)引物FFP(SEQIDNO:l)。在700bp到760bp之间，针对来自 A基因组的5'-CGCTGCT-3，片段上的两个胸腺嘧啶脱氧核苷酸T设计反向
( reverse ) 弓| 物 FRAP430(SEQ ID NO:2) : 5，誦CATCGAGGCAACTCCTTGGACAGCA-3，； 在920bp到lOOObp之间，针对 来自C基因组的5'-rACCGAC片段上的一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸T (斜体)和 一个胞嘧啶脱氧核苷酸C (斜体)设计反向(reverse)引物FRCP630(SEQ ID NO:3): 5，-TGCGCCACGTGCGTGTCGGTA-3，。
2) PCR反应体系总体积30pl，三种引物同时加入一个PCR反应管中， 具体浓度组成如下
1 Ox Buffer: 3.0jxl dNTPs IO拜 Taq 2.5U FFP 0.1,
10FRAP430 FRCP630 模板DNA ddH20
0.1 nM 0.1 pM 80ng
加至
3) PCR热循环程序:
第一步预变性-
第二步变性 第三步退火和延伸 循环35次 后延伸
94°C 3分
94 °C 40秒
72°C l分20秒
72°C 7分
4)琼脂糖凝胶电泳检测
PCR扩增产物在浓度为1.5%的，并加有溴化乙锭的琼脂糖凝胶上进行 电泳分离，然后通过凝胶分析系统进行拍照和分析(图2)。其中1-3电泳道模 板cDNA为来自3个不同的白菜种子，扩增得到大小约为430bp的片段，说明表 达的FAD2基因是来自A基因组；4-6电泳道模板cDNA为来自3个不同的甘蓝种 子，扩增得到大小约为630bp的片段，说明表达的FAD2基因是来自C基因组； 7-9电泳道模板cDNA为来自3个不同的甘蓝型油菜种子，扩增得到大小约为 430bp和630bp这两个片段，说明来自A基因组和C基因组的FAD2基因同时表 达；IO电泳道为空白对照。结果清楚说明，这样设计的一组3条引物能有效区 分甘蓝(CC)、白菜(AA)和甘蓝型油菜(AACC)基因组的FAD2基因。
权利要求
1.一种甘蓝型油菜种子内不同来源FAD2基因表达的快速检测方法，其特征是1)根据芸薹属植物甘蓝、白菜和甘蓝型油菜的FAD2基因的序列进行序列比对分析，结果筛选出四个SNP位点。从FAD2基因的cDNA序列上的起始密码子ATG开始计数，在700bp到760bp之间，来自A基因组的5’-CGCTGCT-3’片段上的第4位点和第8位点的胸腺嘧啶脱氧核苷酸T(斜体标记)与来自C基因组的5’-CGCCGCC-3’片段上的第4位点和第8位点的胞嘧啶脱氧核苷酸C(斜体标记)组成两个SNP位点；在920bp到1000bp之间，来自A基因组的5’-CACGGAC-3’片段上第1位点的胞嘧啶脱氧核苷酸C(斜体标记)和第4位点的鸟嘌呤脱氧核苷酸G(斜体标记)与来自C基因组的5’-TACCGAC-3’片段上第1位点的胸腺嘧啶脱氧核苷酸T(斜体标记)和第4位点的胞嘧啶脱氧核苷酸C(斜体标记)组成两个SNP位点。2)以上述四个SNP位点为基础，任意选取一个或两个SNP位点设计两条SNP特异引物，一条为A基因组FAD2基因的特异引物，另一条为C基因组FAD2基因的特异引物，同时在选用的SNP位点的5’或3’端选取一段在A基因组和C基因组的FAD2基因上序列相同的片段作为共有引物；3)从甘蓝型油菜的发育种子中分离总RNA，分别反转录后，进行SNP特异引物PCR反应；4)PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭为染料，电泳后用凝胶分析系统进行图像分析，根据SNP引物特异性与电泳带的有无或大小不同，确定表达的FAD2基因是来自哪个基因组。
2.如果来自A基因组和C基因组的FAD2基因的扩增片段大小不能用琼脂糖凝 胶电泳有效分离，则区分来自A基因组和C基因组的FAD2基因表达的扩增反应 分别在不同的PCR管中进行；如果来自A基因组和C基因组的FAD2基因的扩增 片段大小能用琼脂糖凝胶电泳有效分离，则区分来自A基因组和C基因组FAD2 基因表达的扩增反应可在同一个PCR管中进行。
3. 权利要求1或2中所述的方法，其中在步骤4)中如果电泳分离的扩增片段大小约为430bp，说明表达的FAD2基因是来自A基 因组；如果电泳分离的扩增片段大小约为630bp，说明表达的FAD2基因是来自C基 因组；如果电泳分离的扩增片段同时具有约430bp和630bp两条扩增片段，说明表 达的FAD2基因分别来自A基因组和C基因组。
4. 权利要求1-3中任意一项所述的用于检测甘蓝型油菜种子内不同来源FAD2基 因的SNP位点。
5. 权利要求4中所述的SNP位点，其特征在于从FAD2基因的cDNA序列上的 起始密码子ATG开始计数，1)在700bp到760bp之间，来自A基因组的 5'-CGCrGCr-3，片段上的第4位点和第7位点的胸腺嘧啶脱氧核苷酸T(斜体标 记)与来自C基因组的5'-CGCCGCC-3'片段上的第4位点和第8位点的胞嘧啶 脱氧核苷酸C (斜体标记)组成两个SNP位点；2)在920bp到1000bp之间， 来自A基因组的5'-CACC GAC-3'片段上第1位点的胞嘧啶脱氧核苷酸C (斜 体标记)和第4位点的鸟嘌呤脱氧核苷酸G (斜体标记)与来自C基因组的 5'-rACCGAC-3，片段上第1位点的胸腺嘧啶脱氧核苷酸T (斜体标记)和第4位点的胞嘧啶脱氧核苷酸C (斜体标记)组成两个SNP位点。
6. 权利要求1-3所述的方法或权利要求4-5所述的SNP位点，用于检测甘蓝型 油菜种子内不同来源FAD2基因表达的用途，以及推测未知材料中的基因组类型 是带A基因组还是C基因组。
7. 权利要求6所述的用途，其中利用上述SNP位点作为SNP分子标记，用于基 因定位和分子标记辅助育种。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，公开了一种甘蓝型油菜种子内不同来源FAD2基因表达的快速检测方法。本发明通过比较不同来源的芸薹属FAD2基因的DNA序列，筛选出能够区分A基因组和C基因组FAD2基因的单核苷酸多态性(SNP)位点四个。再根据四个SNP位点设计特异的SNP引物。结合RT-PCR，对种子中表达的FAD2基因类型进行鉴定。这一方法对进一步研究油菜籽油酸形成的分子调控机理，加快高油酸油菜品种选育的步伐有积极意义。
文档编号C12Q1/68GK101629206SQ20081014400
公开日2010年1月20日 申请日期2008年7月19日 优先权日2008年7月19日
发明者刘春林, 琦 彭, 颖 阮 申请人:刘春林;阮 颖;彭 琦