专利名称：：一种猪瘟重组亚单位疫苗的制备方法
技术领域：
：本发明涉及猪瘟疫苗的研制领域，特别是可作为猪瘟防治的新型疫苗应用于临床工作中的一种猪瘟重组亚单位疫苗的制备方法。
背景技术：
：猪瘟(ClassicalSwineFever，CSF)是由猪瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus,CSFV)引起的猪的一种烈性、病毒性传染病，被国际兽疫周(0IE)和我国兽医局列位A类传染病，其症状特别严重、传播迅速、无国界，猪瘟的爆发往往造成巨大的经济损失，并且引发严重的公共卫生问题。20世纪70年代后期，猪瘟的流行特点发生了很大变化，持续性感染造成非典型猪瘟的出现，以及免疫失败事件的时有发生，不断地威胁养猪业的健康发展。其中一个主要原因是不能彻底查清猪群是否存在持续性猪瘟病毒感染的情况，导致无法确定猪瘟病毒抗体的来源，从而无法准确的评价疫苗免疫效果。因此，研制符合疫情特点的新型猪瘟疫苗成为形式的需要。国内外的研究已经证实，E2是猪瘟病毒最主要的保护性抗原蛋白，存在4个独特的抗原结构域A、B、C、D，位于E2N末端的690位866位氨基酸处，是病毒诱导产生中和抗体的主要部位，是中和性抗原结构域。利用生物学技术在体外表达的E2蛋白免疫动物可产生高水平的中和抗体，足以保护动物免受致死剂量猪瘟强毒的攻击，因此E2基因是目前研制猪瘟基因工程疫苗的首选抗原基因。体外表达的重组E2蛋白具有抗原性好、表达量大、容易纯化、可规模化生产的优势，制备的基因工程疫苗安全、高效，不存在潜在的危害环境和人类安全的危险因素。同时发展起来的鉴别诊断技术可通过血清抗体检测的方法准确区分基因工程疫苗免疫抗体和野毒感染抗体，及时发现群体中隐性感染猪瘟病毒的个体，从而采取相应的措施，剔出潜在的传染源和导致猪瘟爆发的危险因素，达到净化猪群的目的，将猪瘟的危害降到最小。但是单个E2基因的抗原表位数量有限，影响免疫效果。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种通过增加一个E2基因，能使抗原表位数量增加一倍，弥补抗原表位数量的不足，提高重组E2亚单位疫苗的免疫效果；通过增加氨基酸连接接头，使获得的E2蛋白能够独立形成空间结构，充分展示各自独立的抗原表位的一种猪瘟重组亚单位疫苗的制备方法。为解决本发明的技术问题所采用的技术方法包括下述步骤A.利用逆转录-聚合酶链式反应方法克隆猪瘟疫苗株E2蛋白的编码基因；B.构建融合E2基因利用基因重组技术，将双E2基因串联，在第二个E2基因5'端起始密码子ATG上游增加一个大肠杆菌￡coh'RBS5'-AAGGAG-3、序列；同时在串联的两个E2基因之间增加氨基酸接头——5'-GSAGSAAGSGEF-3';C.构建重组表达载体rE2;D.rE2的诱导表达在LB液体培养基中表达rE2;优化表达条件，促进rE2蛋白的可溶性表达；E.rE2纯化F.Westernblotting方法检测rE2活性。2、根据权利要求1所述的一种猪瘟重组亚单位疫苗的制备方法，其特征在于所述步骤D中E2蛋白表达条件的优化是将含有E2基因的重组菌按2.0%的接种量转接LB液体培养基中，37。C剧烈震荡培养0D600"0.60.8，加入终浓度为0.10mmol/L的IPTG，在24。C条件下诱导表达24小时；超声波冰浴条件裂解菌体，收集上清和沉淀样品，SDS-PAGE凝胶鉴定，获得可溶性的rE2蛋白质。本发明创造性地以双E2基因串联表达方式使E2抗原表位的数量增加一倍，显著提高了重组E2亚单位疫苗的免疫效果；为了提高串联后地E2蛋白表达效率，在第二个E2基因5'端起始密码子(ATG)上游增加一个大肠杆菌co力')特别是在双E2基因串联后的第二个E2基因的5'端起始密码子(ATG)上游增加一个大肠杆菌(fco乃')RBS序列(5'-AAGGAG-3');为了最大限度的降低双基因表达后抗原表位被遮蔽地频率，在串联的两个E2基因之间增加"氨基酸接头"(AminoAcidLinker)5、-GSAGSAAGSGEF-3、(5'-GGCAGCGCAGGCAGCGCAGCAGGCAGCGGCGAATTC-3、)，促进目标蛋白的正确折叠和可溶性表达，使获得的E2蛋白能够独立形成空间结构，完整展示各自得抗原表位。利用融合双基因E2蛋白制备重组亚单位疫苗，其免疫效果与猪瘟兔化弱毒疫苗免疫保护效果相当，可川于猪瘟的临床免疫工作中。本发明的有益效果在于1.RBS序列对串联地双E2基!大l农达的促进作用。通过蛋白质电泳证实，rE2重组蛋白的大小与预测的大小一致，实现了两个E2基因的共表达，增加的RBS(5'-AAGGAG-3、)提高了下游E2基因的表达效率。2.氨基酸接头的作用。在两个同源E2基闳之问增加的氨基酸接头可以有效地提高目标蛋白的可溶性，促进rE2蛋白形成正确的空间构象，同时减少包涵体的形成。3.rE2亚单位疫苗的安全性。通过rE2亚单位疫苗对供试动物的临床反应、可以肯定的认为猪瘟病毒rE2重组亚单位疫苗对试验动物是安全、可靠的，不会对试验动物造成不良的影响。4.免疫效果。从抗猪瘟病毒抗体的消长规律和免疫效果的试验可以得到如下的结论。(1)原核系统农达的可溶性rE2融合蛋白能够诱导猪产生针对CSFV的中和抗体，足以抵抗致死剂量猪瘟强毒的攻击下。(2)研制的rE2亚单位疫苗基本达到了猪瘟兔化弱毒细胞系疫苗的保护水平，可成为新型的基因工程疫苗应用在未来的猪瘟预防和控制工作当中。具体实施例方式实施例11、E2基因抗原区域的克隆和重组表达载体pCSFV-rE2的构建按照扩增CSFVE2基因的方法，设计两对分别含有限制性酶切位点特异性引物见表一，单个E2基因序列跨度为569bp，串联后为1138bp。表-引物的编号、序列、位赏、长度编号序列位置酶切位点f':2--i5'(;c(;(;ATccc(;GCTA(;c(.:T(;TMG(;AAGAT3'24342462B柳HIE2-l5'GCGMTCCTGTGTAATACACT(;aTCGC3'REcoRIEcoRi<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>备注引物E2-2F:GAATCC酶切位点序列;GGCTTC氨基酸接头序列；ATGGAT为E2基因本序列；RBS序列5'-AAGGAG-3提取疫苗毒株(C-株)总RNA，RT-PCR的方法扩增E2基因主要抗原区片段。双酶切pGEX-6p-l载体和纯化的E2片段，利用共有EcoRI酶切位点将两个基因连接起来，构建重组表达载体，将其转化DH5a感受态细胞，构建策略图谱见图一。重组质粒经核苷酸序列测定，在确保阅读框(ORF)正确后，将阳性重组质粒命名为pCSFV-rE2，并转化到BL21(DE3)感受态细胞中，进行蛋白质表达。2.重组蛋白的诱导表达和产物的SDS-PAGE鉴定LB培养基均为Amp+氨苄青霉素钠，浓度为10(^g/iiiL。将挑取的单菌落接种到5mLLB液体培养基中，37"C过夜培养；按照2.0%的接菌量转接LB液体培养基中，培养0D600L60.8，诱导剂IPTG的终浓度为1.0mol/L，37。C培养诱导6h.取lmL诱导后重组齒液，离心后收集沉淀。SDS-PAGE蛋白质电泳凝胶鉴定表达产物。3.E2蛋白表达条件的优化含有E2基因的重组菌按2.0%的接种量转接1LLB液体培养基中，37。C剧烈震荡培养0D600L60.8，加入终浓度为0.10mmol/L的IPTG，在24。C条件下诱导表达21小时；超声波冰浴条件裂解菌体，收集上清和沉淀样品，SDS-PAGE凝胶鉴定。4.SDS-PAGE和Westernblotting分析目标蛋白试验表明，在58kDa处有-一条明显特异性蛋白带，该蛋白条带可以被猪瘟的阳性血清识别，确定H的蛋白已经表达。5.猪体攻毒保护实验5.1CSFVrE2亚单位疫苗猪体免疫试验5.1.1试验动物未免疫猪瘟疫苗的50n龄断奶仔猪(15-20kg)40头，经检测无猪瘟病毒血清抗体。5.1.2、试验设计实验设rE2亚单位疫苗免疫组30头猪(SYp组)，设C株猪瘟兔化弱毒疫苗免疫对照5头猪(Cp组)，空白对照组5头猪(Bp组)。免疫方法及剂量见表二。两次免疫时间间隔4周。二免4周后进行免疫效果试验，即攻毒试验。5.1.3病毒每株C株猪瘟兔化弱毒疫苗来A商品化的细胞疫苗(40头份/瓶)；攻毒用的猪瘟病毒为石门系血毒。表二试验猪分组及免疫剂量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>备a::—W次免疫E2抗原ffl生理盐水稀释，然后滴加卜.j休枳的弗式佐剂(Sigma公,d产品)，充分乳化，猪/l:颈部肌肉沐射lmL/头.，D对照組汉接种化中位疫苗免疫组相lni剂it的生理盐水.以IDEXX公司生产的"猪瘟病毒抗体诊断ELISA试剂盒"检测猪瘟病毒抗体阻断率，阻断率》40%抗体阳性，阻断率《30%为阴性，介于两者之间为可疑。5.2、E2亚单位疫苗对猪的临床反应和病理变化5.2.l猪的临床反应5.2.1.1E2亚单位疫苗免疫猪组(1)试验组购买的40头试验猪按照试验设计随机分组，在试验场地饲养7天，每天测量体温，结果表明试验用的动物体温在38.(TC40.(TC之间，属于猪的正常体温范闱，符合试验要求。饲养期间试验动物精神状态良好，食欲旺盛，没有异常的临床反应，符合试验要求.(2)免疫期间的临床反应rE2亚单位疫苗免疫猪后每天测量体温。rE2亚单位疫苗免疫组、C株疫苗免疫组和空白对照组的猪体温在38.(TC40.0。C之间变化，属于正常体温范围.在此期间动物精神状态良好，采食」H常，生长正常.未出现异常的临床反应.5.3rE2亚单位疫苗在猪体内的抗体消长规律和攻毒保护实验5.3.l抗体消长规律第二次亚单位疫苗后4周进行攻毒保护试验。统计攻毒试验前宰杀的8头SYp组猪、2头Cp组猪和2头Bp组的血清抗体消长规律(见表三)。表三部分试验猪的抗体阻断率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>判断标准:阻断率240W猪瘟病&抗体m性，阻断率530%为阴性，介丁'两者之间为可疑。丧中黑体部分为阳性依。通过表三数据统计的结果可知，所有rE2亚单位疫苗免疫组(SYp组)猪的血洁抗体在首次免疫14天后全部为阳性.SYp组与弱毒疫苗免疫组(Cp组)和空白对照组(Bp组)比较发现，rE2亚单位疫苗可以刺激机体产生特异性抗猪瘟病毒抗体，其效果基本达到了与Cp组相同的效果，并且在猪体内，亚单位疫苗产生的猪瘟病毒抗体稳定的、持续性的存在.5.3.免疫效果试验5.3.1攻毒方法参考"猪瘟兔化弱毒疫苗n型"的猪效力保护试验方法，进行攻毒保护试验。剩余28头试验猪在相同条件下分别在颈部皮下注射石门血毒lmL(l(f感染剂量)，每H观察试验猪的精神状态、食欲等临床反应。5.3.2结果攻毒5天后，对照猪Bpl死亡，8天后Bp3死亡，10天最后1头空白对照猪死亡。在此期间，rE2亚单位疫苗免疫猪和弱毒疫苗免疫猪未出现异常临床反应和猪瘟的临床症状。根据"猪瘟兔化弱毒疫苗II型"的猪效力保护试验的要求"如果设4(3头)头攻毒对照猪全部发病至少死亡3(2头)头，而效检猪(E2亚单位疫苗免疫组和弱毒疫苗免疫组)全部键活或稍有体温反应，但无猪瘟临床症状出现，为免疫合格"的判断标准，可以判定在攻毒后，亚单位疫苗免疫组和弱毒疫苗免疫组的猪全部被保护。试剂和材料1、毒株由中国农业科学院兰州兽医研究所保存。2、引物和测序由Takara公司合成。3、Sigma公司:辣根过諷化物酶标记的兔抗IgG、TMB、IPTG、核酸电泳、弗式佐剂和蛋白电泳所用试剂。4、Takara公司组织总DNA提取试剂盒、扩增用单核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、高保真的Taq酶、限制性核酸内切酶(BamHI、Xholl、EcoRI)、T4DNA连接酶。5、安玛两亚琼脂糖4B填料、超滤浓縮管。6、IDEXX公司提供"猪瘟病毒抗体诊断ELISA试剂盒"。序列表OrganizationApplicantStreet:盐场路徐家坪1City:兰州State:甘肃Country:中华人民共和国PostalC。de:730046PhoneNumber:0931-8342706FaxNumber:0931-8342052EmailAddress:yinshuanghuikangr置63.com<110>OrganizationName:中国农业科学院兰州兽医研究所ApplicationProject〈120〉Title:—种猪瘟重组亚单位疫苗的制备方法〈130>AppFileReference:M.M.Hulst，D.FWestra，G.Wensvoort，R.J.M.Moormann,GlycoproteinElofhogcholeravirusexpressedininsectcellsprotectsswinefromhogcholera,J.Virol.67(1993)5435-5442.〈140〉CurrentAppNumber:10003.2006.7〈141>CurrentFilingDate:2000-06_30Sequence〈213>OrganismName:classicalswinefevervirusE2gene〈400〉PreSequenceString:gaagattacaggtacgcaatatcgtcaaccgatgagatagggctacttggggccggaggt60ctcaccaccacctggaaggaatacaaccacgatttgcaactgaatgacgggaccgtcaag120gccagttgcg180ttggcgtcat240gggaccaacc300gatacgagtc360tatcttgtct420actctgagga480gattgtgtga540tggacatgtg600cacaaagtga660tctggcg卿720catcaccatg780gccgg郷tc840accgtcaagg900aggaggtatt960ctgttcgacg1020tggcaggttctgcataagaacatcaactgactgttgttaagcccaataggca,gtggtccaccatagttg肌aggcgaggaatgaagtatgccctgttaagattacagtcaccaccacccagttgcgttggcgtcattggaccaacccctttaaagtcggctttacccggaaatgggagggaaagtacgtggacgggtaaagaccttcggaaaatgaBattcaaggagaatggtccgcagtagccttagtacgcaatactggaaggaaggcaggttccgcataagaagatcaactgagacagcacttaacttccgtgagatgacttcaaatacgacctgtcatagagtaggagagacagatttattctatggctggcttggtttggtgttcggctacgtcgtcaaccgtacaaccscgtttaaagtcagctttacccagaaatgggagatgtggtcagcattcgagctggtccgggcttgttgaacgggcacagcagtagccctttccattgtaagttccgctgctggacgctggctctaggatatcaatg卿taggatttgcaactcagcacttaacttccgtgacatgacttcagtaggaggtatcctgttcgacgtgcccgttttaatgctttcgagcccaacagcacagaatgggggggc朋cttctggcaaacgctgctggtgcaccatcacgctacttggggaatgacgggtgtggtcagtattcgagctcgtccgggctgtgcccgtttgatacgagtcctgttgttaagggaaagtacaatacgaccttgttgaacggt1080aatgctttctatcttgtctgcccaatagggtggacgggtgtcatagagtgcacagcagtg1140agcccaacaactctgaggacagaagtggtaaagaccttcaggagagacaagccctttccg1200cacagaatggattgtgtgaccaccatagtggaaaatgaagatttattctattgtaagttg1260gggggcaactggacatgtgtgaaaggc1287〈212〉Type:腿<211〉Length:1287SequenceName:rE2vaccineSequenceDescription:FeatureSequence:rE2vaccine:〈221〉FeatureKey:E2gene<222〉LocationFrom:1〈222〉LocationTo:558OtherInformation:第一个E2基因CDSJoin:NoFeatureSequence:rE2vaccine:〈221〉FeatureKey:CDS<222〉LocationFrom:1<222〉LocationTo:1286OtherInformation:CDSJoin:NoFeatureSequence:rE2vaccine:<221〉FeatureKey:EcoRI〈222〉LocationFrom:559〈222〉LocationTo:564OtherInformation:限制性酶切位点EcoRICDSJoin:NoFeatureSequence:rE2vaccine:〈221〉FeatureKey:ABS<222〉LocationFrom:565〈222〉LocationTo:570OtherInformationCDSJoin:NoFeatureSequence:rE2vaccine:〈221〉FeatureKey:ATG<222〉LocationFrom:571〈222〉LocationTo:573OtherInformation:CDSJoin:No大肠杆菌核糖体识别位点起始密码子FeatureSequence:rE2vaccine:<221〉FeatureKey:AminoAcidLinker<222〉LocationFrom:574<222〉LocationTo:729OtherInformation:增加的氨基酸接头序列CDSJoin:NoFeatureSequence:rE2vaccine:<221>FeatureKey:E2gene<222>LocationFrom:730<222〉LocationTo:1286OtherInformation:串联的第二个E2基因序列CDSJoin:NoThesisSequence:rE2vaccine:<301〉Authors:vanRijnPA.，MiedemaGKW.，WensvoortG.，etal.<302>Title:Classicalswinefevervirus(CSFV)envelopeglycoproteinE2containingonestructuralantigenicunitprotectspigsfromlethalCSFVchallenge<306〉PageRange:2737-2745〈307〉Date:1996-—-—<308〉DBAccessionNumber:〈309〉DBEntryDate:_-—-—<313>From:<313>To:权利要求1、一种猪瘟重组亚单位疫苗的制备方法，其特征在于包括下述步骤A.利用逆转录-聚合酶链式反应方法克隆猪瘟疫苗株E2蛋白的编码基因；B.构建融合E2基因利用基因重组技术，将双E2基因串联，在第二个E2基因5′端起始密码子ATG上游增加一个大肠杆菌E.coliRBS5`-AAGGAG-3`序列；同时在串联的两个E2基因之间增加氨基酸接头——5`-GSAGSAAGSGEF-3`；C.构建重组表达载体rE2；D.rE2的诱导表达在LB液体培养基中表达rE2；优化表达条件，促进rE2蛋白的可溶性表达；E.rE2纯化F.Westernblotting方法检测rE2活性。2、根据权利要求1所述的一种猪瘟重组亚单位疫苗的制备方法，其特征在于所述步骤D中E2蛋白表达条件的优化是将含有E2基因的重组菌按2.0%的接种量转接LB液体培养基中，37'C剧烈震荡培养0D600^0.60.8，加入终浓度为0.10ramol/L的IPTG，在24"C条件下诱导表达24小时；超声波冰浴条件裂解菌体，收集上清和沉淀样品，SDS-PAGE凝胶鉴定，获得可溶性的rE2蛋白质。全文摘要一种猪瘟重组亚单位疫苗的制备方法，包括下述步骤A.利用逆转录-聚合酶链式反应方法克隆猪瘟疫苗株E2蛋白的编码基因；B.构建融合E2基因C.构建重组表达载体rE2；D.rE2的诱导表达E.rE2纯化。F.Westernblotting方法检测rE2活性。本发明创造性地以双E2基因串联表达方式使E2抗原表位的数量增加一倍，显著提高了重组E2亚单位疫苗的免疫效果；为提高双E2蛋白表达效率，在第二个E2基因5′端起始密码子(ATG)上游增加一个大肠杆菌RBS序列(5′-AAGGAG-3′)；同时在串联的E2基因之间增加氨基酸接头5′-GSAGSAAGSGEF-3′，使获得的E2蛋白能够完整展示其抗原表位。本发明的E2蛋白重组亚单位疫苗，免疫保护效果与猪瘟兔化弱毒疫苗相当。文档编号C12N15/70GK101418303SQ20081015030公开日2009年4月29日申请日期2008年7月6日优先权日2008年7月6日发明者刘湘涛,刘艳红,孙世琪,尚佑军,尹双辉,宏田,韩雪清申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所