表皮葡萄球菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法

专利名称：表皮葡萄球菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种表皮葡萄球菌基因快速 诊断试剂盒及其检测方法。
背景技术：
目前对表皮葡萄球菌有多种检测方法，从以病原微生物分离鉴 定、形态学鉴定和自动生化鉴定[临床医院感染学，湖南科学技术出版社，1998年]，到特异蛋白的免疫学检测技术、核酸探针、聚合酶 链式反应(PCR)技术等分子生物学检测方法[食品安全检测与现代生 物技术，化学工业出版社，2004年]。其中病原核酸检测在快速性、 安全性、准确性和灵敏性等方面都有很大的提高，这些新技术试图突 破传统的形态学、生化反应等微生物学检测旧模式，不需要对微生物 进行分离提纯，而直接用样品或样品的增菌液对其基因及基因产物进 行快速检测，并且与分子生物学技术及生物信息学手段相结合，向准 确、快速、灵敏和自动化的方向发展。以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实 际应用中也存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要 专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光 实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术 中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快 速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确 性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最 新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中等 温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测 技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication of DNA,简禾尔LAMP)具有很 多的优越性，且目前也未见有用环介导等温扩增技术检测表皮葡萄球 菌的基因快速诊断试剂盒。 发明内容本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种检测成本 低、使用方便、检测速度快、特异性高的基于环介导等温扩增技术的 表皮葡萄球菌基因快速诊断试剂盒。本发明的另一个目的是提供上述表皮葡萄球菌基因快速诊断试 剂盒的检测方法。本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的 一、本发明的表皮葡萄球菌基因快速诊断试剂盒，是由两对引物、 BWDNA聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对 照液组成，以上七种液体分别置于容器中，其中 所述的两对引物为外引物F3: CTAAAACWGC AACATTAGGAAAT;外引物B3: AGATACTTTGCTAGCAACTTGT;内引物FIP: AGCAGTGTTATAAACAACATCACCnTTTTATTT AGTTGAAGACTACAATAGCG;内引物BIP: AARGCACCAGTAAAAGTGAATCAnTTTTTGGT GTACCCCAAGGA;上述每lL反应液中含有1.6 2mmo1 dNTP 、 20 25mmo1 Tris-HCl、 10 12.5mmol氯化钾、10 12.5mmol硫酸铵、8 10mmo1 硫酸镁、1 1.25ml TritonX-100、 0.8 lmol甜菜碱、内引物FHVBIP 各1.6 2mol和外引物F3/B3各0.2 0.25mol;优选的比例是每1L反应 液中含有2mmo1 dNTP、 25mmo1 Tris-HCl、 12.5mmol氯化钾、12.5mmo1 硫酸铵、10mmol硫酸镁、1.25ml TritonX-lOO、 lmol甜菜碱、内引物 FIP/BIP各2mol和外引物F3/B3各0.25mo1。上述每1L样品预处理液中含有10 20 mmol pH 8.0的Tris-HCl、 1 2 mmol EDTA和10 12ml Triton X-100。优选的比例是每1L样品预 处理液中含有20mmo1 Tris-HCl (pH 8.0)、 2mmo1 EDTA禾口12ml Triton X画100。上述显色液优选为荧光染料SYBR Green I或EvaGreen;上述稳定液优选为石蜡油。上述阳性对照为表皮葡萄球菌基因组DNA。二、本发明基因快速诊断试剂盒的生产工艺1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；2、 将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；3、 将稳定液无菌分装，抽样质检；4、 将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；5、 组装试剂盒。三、本发明基因快速诊断试剂盒的检测方法1、 样品处理将待测样品经洗脱后，于离心管中离心，去上清，沉淀中加入样 品预处理液并混合均匀，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心后，上清 即为样品模板DNA;2、 环介导等温扩增技术反应过程在反应管中加入反应液38 40体积％， Bst DNA聚合酶大片段 0.9 1.8体积％，稳定液52 54.5体积％，样品模板DNA4.5 9体 积°%， 63 65t:恒温反应45 90min。所述体积百分比是指占四个组 分总体积的体积百分比。3、 反应后处理在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混匀，样品组显 色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。本发明的原理是利用fi^ DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的 两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异 性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DN A区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的MgZ+结合，产生副产物——焦 磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒 温(63 65°C)条件下45 90分钟内完成。这种比较温和的温度条 件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检 测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检 测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂 和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一 种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与P CR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术 在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技 术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而 且检测成本远低于荧光定量PCR技术。国内目前尚未有这方面的试 剂盒出售。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结 合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2 3天，完 成鉴定报告需10 15天；采用本发明的基因快速诊断试剂盒仅需2 小时。并且，本发明的反应液中加入了显色液，鉴定结果更为直观清 晰。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果l.本发明的基因快速诊断试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反 应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.本发明的基因快速诊断 试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性；3.本发明的基因快速诊断试剂盒扩增 快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高；4.本发明的基 因快速诊断试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5.本发 明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与 反应溶液中的M^+结合，产生副产物一焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼 观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高， 更加明显可靠。
具体实施方式
实施例l试剂盒的制备(1) 按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物 夕卜弓I物F3: CTAAAACWGCAACATTAGGAAAT;外引物B3: AGATACTTTGCTAGCAACTTGT; 内引物FIP: AGC AGTGTTATAAACAAC ATC ACCTTnTTATTT AGTTGAAGACTAC AATAGCG;内弓i物BIP: AARGCACCAGTAAAAGTGAATCATTTTT TTGGTGTACCCC AAGGA;(2) 购置DNA聚合酶fofDNApolymerase (大片段)，置于容器。(3) 配制反应液反应液的配方按每1L溶液含有2mmo1 dNTP、 25mmo1 Tris-Cl、 12.5mrno1氯化钾、12.5mmo1硫酸铵、lOmmol硫 酸镁、1.25ml TritonX-100、 lmol甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mo1 和外引物F3/B3各0.25mol配制，置于容器。(4) 配制样品预处理液样品预处理液的配方按每1L溶液含有20 mmol Tris-HC1 (pH8.0) 、 2 mmol EDTA禾口 12ml TritonX-100配制，置于容器。(5) 购置稳定液石蜡油，置于容器；(6) 购置显色液SYBR Green I，置于容器。(7) 提取阳性对照表皮葡萄球菌基因组DNA，置于容器。(8) 将上述7个容器装成试剂盒，封装。 制备工艺简述如下1、 将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制， 浓度检测，抽样质检；2、 将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；3、 将稳定液分装，抽样质检；4、 将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；5、 组装试剂盒。实施例2试剂盒的制备 反应液的配方为每1L反应液中含有1.6mmo1 dNTP、 20mmo1 Tris-HCl、 10mmol氯化钾、10mmol硫酸铵、8mmol硫酸镁、lml Tr itonX-lOO、 0.8mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6mol和外引物F3/B 3各0.2mol;样品预处理液的配方为每lL样品预处理液中含有10mmo1 pH 8.0的Tris-HCl、 lmmol EDTA和10ml Triton X-100 。显色液为EvaGreen 。 其他同实施例l。实施例3表皮葡萄球菌基因快速诊断试剂盒的应用 1、样品处理(模板DNA提取)(1) 采用无菌操作技术棉拭子取分泌物样品，在约10ml生理盐水 中涮洗；(2) 取5ml洗脱样品液，lOOOOrpm离心2min，获得菌体沉淀；(3) 在上述菌体沉淀中加入10(^1样品预处理液混合均匀，沸水中 煮10分钟后立即置于冰上冷却10分钟，10000rpm离心2分钟，上清 即为样品模板DNA。2、 环介导等温扩增技术的反应过程1) 在200^1反应管配制反应体系反应液22^1， DNA聚合 酶0.5jxl (4U)，模板DNA2-5pl。2) 将配制好的反应管于64。C恒温反应lh。3、 反应后处理向上述PCR反应产物中加入2^1 SYBRGreenI，混匀，同时也向 阳性对照管(表皮葡萄球菌基因组DNA)中加入SYBRGreen I混匀，若反应管与对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管显现橙色则为阴
权利要求
1、一种表皮葡萄球菌基因快速诊断试剂盒，其特征在于由BstDNA聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液组成，以上五种液体分别置于容器中，反应液内两对引物为外引物F3CTAAAACWGCAACATTAGGAAAT；外引物B3AGATACTTTGCTAGCAACTTGT；内引物FIPAGCAGTGTTATAAACAACATCACCTTTTTTATTTAGTTGAAGACTACAATAGCG；内引物BIPAARGCACCAGTAAAAGTGAATCATTTTTTTGGTGTACCCCAAGGA；每1L反应液中含有1.6～2mmol dNTP、20～25mmol Tris-HCl、10～12.5mmol氯化钾、10～12.5mmol硫酸铵、8～10mmol硫酸镁、1～1.25ml TritonX-100、0.8～1mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6～2mol和外引物F3/B3各0.2～0.25mol；每1L样品预处理液中含有10～20mmol pH 8.0的Tris-HCl、1～2mmol EDTA和10～12ml Triton X-100；上述阳性对照为表皮葡萄球菌基因组DNA。
2、 根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述的显色液为SYBR Green域EvaGreen。
3、 根据权利要求l所述试剂盒，其特征在于所述每1L样品预处理 液中含有20 mmol pH 8.0的Tris-HC1、 2mmo1 EDTA和12ml TritonX-IOO。
4、根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述每1L反应液中 含有2mmo1 dNTP、 25mmo1 Tris-HCl、 12.5mmo1氯化钾、12.5mmo1 硫酸铵、lOmmol硫酸镁、1.25ml TritonX-100、 lmol甜菜碱、内引 物FTP/BIP各2mo1和外引物F3/B3各0.25mol。
5、 根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述稳定液为石蜡油。
6、 一种检测表皮葡萄球菌的方法，其特征是使用权利要求l所述 试剂盒，按下列步骤进行(1) 将待测样品经洗脱后，于离心管中离心，去上清，沉淀中 加入样品预处理液并混合均匀，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心后， 上清即为样品模板DNA;(2) 在反应管中加入反应液38 40体积％， Bst DNA聚合酶 0.9 1.8体积％，稳定液52 54.5体积％，样品模板DNA4.5 9体 积％，恒温反应；(3) 在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混匀，样 品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。
7、 根据权利要求6所述检测方法，其特征在于步骤(2)中，恒 温反应的反应条件为温度63 65°C ，反应时间45 90min。
全文摘要
本发明公开了表皮葡萄球菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒由两对引物、DNA聚合酶、稳定液、反应液、样品预处理液、显色液和阳性对照液组成，以上七种液体分别置于容器中。本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性。本发明的基因快速诊断试剂盒快速、高效、灵敏度高，只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低。本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物—焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，更加明显可靠。
文档编号C12Q1/68GK101403003SQ20081019880
公开日2009年4月8日 申请日期2008年9月26日 优先权日2008年9月26日
发明者曹以诚, 李志勇, 杜正平, 王志强, 谭惠媚, 洵 陈 申请人:广州华峰生物科技有限公司