专利名称：环介导恒温扩增检测米氏凯伦藻的方法
技术领域：
本发明涉及赤潮生物米氏凯伦藻的检测。
背景技术：
米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)能产生溶血性(hemolytic)毒素和鱼毒 (ichthyotoxins)，能够溶解鱼类细胞，破坏鱼鳃组织结构，使鱼类无法正常呼吸而窒息死 亡。由米氏凯伦藻引起的赤潮在墨西哥湾、新西兰、韩国、苏格兰、澳大利亚、日本海域都有 发生，2002-2005年在中国福建浙江沿海引发多次赤嘲，对渔业造成巨大经济损失，研究米 氏凯伦藻赤潮，进行赤潮的预测预报，对于减少水产养殖业损失，保护海洋生态环境，有着 重要的实际意义。 对赤潮进行预测首要问题是对引起赤潮的藻类进行检测，传统的藻类鉴定是通过 形态学的观察来划分的，从色素，色素体，贮藏物质等的差别来辨别不同种的藻类细胞，这 是一件费时费力的事，而且不同的种属差别很细微，非长期从事该工作的专业人员难以胜 任这项工作，并且环境对藻类的形态有很大的影响，鉴定到种存在的困难较多。
目前，利用分子生物学手段检测微藻的方法日渐成熟，这些方法从分子水平解 决了某些从形态上难以区分的藻类分类和鉴定问题。自从聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)发明以来，这种技术就被应用到诸多领域。许多学者通过微藻某些基 因片段扩增能够对藻类进行鉴定，例如通过对核糖体rDNA序列分析，核糖体间隔区(ITS) 的PCR扩增和测序，从而完成对微藻类的种类鉴定，然而这种方法对仪器要求较高，而且所 需时间长，一个检测反应需要3小时左右。荧光原位杂交也是近年来微藻鉴定的检测手段， 有学者利用核糖体大亚基(LSU)分子探针对墨西哥湾短凯伦藻进行了鉴定，但是这种技术 实验材料费用较高。实时荧光定量PCR检测也是近年来微藻检测一个方向，这种方法非常
灵敏，所需时间也不长(大约一个多小时)，但是所需的实验仪器(荧光定量PCR仪)价格
曰虫 卬贝0 2000年，日本学者Notomi等开发了一种恒温核酸扩增方法，即环介导等温扩增反 应(Loop-mediated isothermal amplif icatiom， LAMP)，其特点是针对耙基因的6个区域 设计4种特异引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件下保温几 十分钟，即可完成核酸扩增反应。此反应不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电 泳、紫外观察等过程，而且结果判定简单，既可以利用仪器检测或肉眼观察核酸扩增过程中 产生的焦磷酸镁沉淀判定，也可以采用肉眼观察反应液的颜色变化来迅速判定。与以上的 检测方法相比，LAMP虽然需要引物多，实验条件需要摸索，但只要在优化好实验条件的前提 下，因其操作简单快速、对仪器要求不高、特异性强、扩增效率高、结果判定简单等优点适合 快速鉴定和现场检测。这种技术已广泛应用到病原菌检测方面，取得理想的检测效果。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种针对赤潮生物米氏凯伦藻的检测方法。
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本发明的技术方案首先提取微藻基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增，PCR扩增
后对产物进行测序，其特征是针对米氏凯伦藻核糖体间隔区的6个区域设计4条特异性引
物，根据LAMP产物产生白色焦磷酸镁沉淀或根据LAMP产物与SYBR Green I反应呈现绿色
判断为米氏凯伦藻，所述的4条特异性引物序列如下 弓|物Primer 序列Sequence(5， _3，)F3 CTGTCATCTTGTCATGTGC ;B3 CTAACTTCATGTCATGGAAGG ;FIP(Flc+F2) TTCAATGCATCAGGGGCAGG-GCAACTGACAGCAGTGTG ;BIP(Blc+B2) ACACCTTGTGCTTTGTGTGT-TGAAGTGGCAGACAGGAG ; 2个内引物FIP和BIP的浓度均为1.6iiM，两个外引物F3和B3的浓度均为
0. 2线MgS04浓度为6mM， dNTP浓度为0. 6mM， Betaine浓度为0. 6M，反应温度为63°C ，反
应时间60min。 本发明针对米氏凯伦藻核糖体间隔区的6个区域设计了 4条特异性引物，利用这 组引物成功检测到米氏凯伦藻基因组，对米氏凯伦藻进行了 LAMP扩增，得到了扩增产物， 同时以其他8种藻类(环状异帽藻、微小亚历山大藻、塔玛亚历山大藻、链状亚历山大藻、利 玛原甲藻、卡氏前沟藻、角毛藻、赤潮异湾藻)为阴性对照实验，只有米氏凯伦藻为特异扩 增，其他藻类呈现阴性反应。另外，对扩增终产物进一步进行酶切分析，并与以外引物F3和 B3为引物PCR扩增的片段相比较，均与预期结果相吻合，说明所设计引物为米氏凯伦藻的 特异性引物。本发明采用2种判断方法，一种是根据有无LAMP产物产生的白色焦磷酸镁沉 淀，另一种是LAMP产物与SYBR Green I反应是否呈现绿色，判断简单快速，可应用到现场 检测，在赤潮的预测预报中发挥作用。
附图表示的是LAMP引物设计示意图(箭头方向指示的是引物延伸方向，方框内的 序列是HcoI酶识别位点)。
具体实施例方式
首先提取微藻基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增，以核糖体DNA转录单元 内间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)为目标基因序列，扩增引物为LH2 : 5' AGGTGAACCTGCGGAAGGATC 3'和D1am : 5' CCTGCAGTCGACA (TG)ATGCTTAA(AG)TTCAGC(AG) GG 3'。 PCR扩增后对产物进行测序，对测定序列进行Blast分析，利用CLUSTAL X软件 与其他藻类的相应序列进行比对后，找到转录单元内间隔区ITS1和ITS2，分别以ITS1 和ITS2区为耙序列设计引物，由在线软件PrimerExplorerV4(http:〃primerexplorer. jp/el卿4. 0. 0/index. html)设计引物(见附图)。反应体系为25uL，包括2. 5uL 10 Xbuffer (内含2mM of MgS04)，内引物FIP和BIP的浓度均为1. 6 ii M，夕卜弓l物F3禾口 B3 的浓度均为0. 2 ii M， 6mM MgS04， 0. 6mM dNTP， 0. 6M Betaine (Sigma—Alodrich)，反应 益度为 63"C，反应时间60min。
LAMP产物特异性验证 可用2种方法检测扩增片段的特异性，(1)利用米氏凯伦藻的1对外引物F3和B3进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳后观察，扩增产物条带在DNA分子量标准的250bp处，与 预期249bp片段相符；(2)利用Ncol限制性内切酶酶切LAMP产物，酶切反应温度37"C，温 浴过夜，电泳后酶切片段为2条带，位于DNA分子量标准的lOObp和200bp之间，与预期得 到137bp和112bp两条带相符。
LAMP产物检测方法 反应后的LAMP产物，取2uL于1. 5%的琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统观察， 可见梯状条带出现；由于LAMP反应产生白色焦磷酸镁沉淀，可肉眼直接观察，在本方法中 阳性反应管内可见到大量白色沉淀产生；加100XSYBR Green I 2 y L于反应管中，阳性反
应管呈现绿色，而阴性反应管内颜色不变。
阴性对照实验 本发明以环状异巾冒藻(Heterocapsa circularisquama)，赤潮异湾 藻(Heterosigma akahiwo)， 卡氏前沟藻(Amphidinium carterae)，禾U玛原甲藻 (Prorocentrum lima)，角毛藻(Chaetocerossp)，微小亚历山大藻(Alexandrium mi皿tum)，链状亚历山大藻(Alexandriumcatenella)，塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)的基因组DNA为模板进行阴性对照实验，经琼脂糖凝胶电泳可见米氏凯伦藻呈 现梯状条带，其他微藻没有扩增条带。
权利要求
环介导恒温扩增检测米氏凯伦藻的方法，首先提取微藻基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增，PCR扩增后对产物进行测序并比对，其特征是针对米氏凯伦藻核糖体间隔区的6个区域设计4条特异性引物，根据LAMP产物产生白色焦磷酸镁沉淀或LAMP产物与SYBRGreen I反应呈现绿色判断为米氏凯伦藻，所述的4条特异性引物序列如下引物Primer序列Sequence(5’-3’)F3CTGTCATCTTGTCATGTGC；B3CTAACTTCATGTCATGGAAGG；FIP(F1c+F2) TTCAATGCATCAGGGGCAGG-GCAACTGACAGCAGTGTG；BIP(B1c+B2) ACACCTTGTGCTTTGTGTGT-TGAAGTGGCAGACAGGAG；内引物FIP和BIP的浓度均为1.6μM，外引物F3和B3的浓度均为0.2μM，6mM MgSO4，0.6mM dNTP，0.6M Betaine，反应温度为63℃，反应时间60min。
全文摘要
环介导恒温扩增检测米氏凯伦藻的方法，涉及米氏凯伦藻检测，本发明取微藻DNA进行PCR扩增，测序，其目的是对米氏凯伦藻设计4条特异性引物，4条引物序列如下引物Primer 序列Sequence(5’-3’)F3 CTGTCATCTTGTCATGTGC；B3 CTAACTTCATGTCATGGAAGG；FIP(Flc+F2) TTCAATGCATCAGGGGCAGG-GCAACTGACAGCAGTGTG；BIP(Blc+B2) ACACCTTGTGCTTTGTGTGT-TGAAGTGGCAGACAGGAG。
文档编号C12Q1/68GK101736079SQ20081020251
公开日2010年6月16日 申请日期2008年11月10日 优先权日2008年11月10日
发明者张凤英, 徐兆礼, 马凌波 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所