新微生物的制作方法

专利名称：新微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新微生物，尤其涉及能够产生氢的新微生物。
背景技术：
氢作为可用于燃料电池等的能源而受到关注。利用产氢孩i 生物进行的氢发酵是产氢方法中的一种(例如专利文献l)。 专利文献l:特开平4-169178号/>才艮

发明内容
拟解决的技术课题以往用于氩发酵的微生物在低pH范围的产氲能力不充 分。此外，以往的氢发酵由于杂菌混入等问题导致产氢率低下。对此，发明人经锐意研究得到了适于产氩的新微生物，从 而完成本发明。
解决课题的技术方案本发明的一个实施方式的微生物的特征在于是2007年3 月2日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物寄托中心 的保藏号为FERM BP-10793 的热解糖热厌氧杆菌 (r力er膨a/7ae/Y 6a"er/咖f力erz7c^cc力aro/7〃c〃迈)菌抹。
本发明的一个实施方式的微生物的特征在于是保藏号为FERM BP-10793的热解糖热厌氧杆菌菌林的突变抹，将其在pH4. 5-pH6. 5 的范围培养时，从lg糖产270mL以上的氢。尤其在pH5. 0-pH6. 0的 范围培养所述微生物时，从lg糖产270mL以上的氢。
另外，本发明的一个实施方式的微生物的特征在于是保藏号为 FERMBP-10793的热解糖热厌氧杆菌菌抹的突变株，当以木糖为糖源，在pH4. 5 - PH6. 5的范围培养时，以相对木糖2. 1以上的摩尔比产氢。 尤其以木糖为糖源，在pH4. 8-pH5. 5的范围培养所述微生物时，以相 对木糖2. 1以上的摩尔比产氢。 技术效果
可根据本发明提供适于产氩的新微生物。
附图简述
示本发明的一个实施方式的微生物在各pH下的产氢率。 示作为对照的一种微生物在各pH下的产氢率。 示作为对照的另一种微生物在各pH下的产氢率。 示本发明的一个实施方式的微生物在pH5.0-pH5.2下的 产氢率。 产氢率。况。
示本发明的一个实施方式的微生物在pH5. 8 - pH6. 0下的
示本发明的一个实施方式的微生物在各温度下的生长情
示本发明的一个实施方式的微生物在各温度下的产氢性。 示本发明的一个实施方式的微生物的自溶性。
实施方式以下说明本发明的一个实施方式的微生物。但本发明的微 生物不局限于此实施方式。本实施方式的微生物(以下称为"本微生物")是保藏号 为FERM BP-10793的热解糖热厌氧杆菌菌林(以下称为"PEH9林") 及其突变抹。本微生物呈革兰式阳性，专性厌氧性，其形态呈杆菌状。本微生物可伴随糖代谢产氩。即，本微生物在培养液过程 中在可从糖生成醋酸、酪酸等有机酸的同时生成含二氧化碳和氬的气 体(以下称为"发酵气")。
对本微生物可用来产氢的糖无特定限制，可有例如植物 源生物质或泔脚所含糖，具体而言，可利用多糖(淀粉、纤维素等)、 寡糖、二糖、单糖(木糖、葡萄糖等)。另外，本微生物可在宽pH范围产氢，且可在低pH范围优 效产氢。即本微生物可在培养液pH为pH4. 5-pH7. 0的范围产氩，优 选在pH4. 8 - pH5. Q的范围，尤其优选在pH5. 0 - pH5. 2的范围优效产 氢。当pH低于4. 5时及pH高于7. 0时，本微生物的产氢效率降低。还可通过利用本微生物在pH5.5以下进行氢发酵来有效
抑制由于其它不产氢的微生物混入所致的污染的发生。例如，当pH 低于7. 0时，曱烷发酵菌的甲烷产生能力大大降低，从而可通过利用 本微生物来抑制甲烷发酵菌对氢发酵的污染。另外，例如，在第一培养罐中进行氢发酵，并在第二培养 罐中利用所述第一培养罐中的氢发酵后的残渣进行甲烷发酵的两步发 酵系统中，在所述第一培养罐中利用本微生物在pH5. 5以下进行氢发 酵。由此，即便有曱烷发酵菌混入第一培养罐，也可有效抑制所述第 一培养罐中所述曱烷发酵菌产生甲烷，从而所述第一培养罐中可产生
含氢率高的发酵气体。另外，例如，在氢发酵的上游包括用于通过分解植物源生 物质来生产乙醇等生物燃料的预处理工序的染料生产系统中，为了将 所述生物质所含植物纤维素降解成单糖或二糖，可在所述预处理工序 中使用酸。这时可将含有在预处理工序中酸化的残渣的培养液供于氢 发酵，并可通过在所述氢发酵中使用本微生物来较以往有效降低加入 所述培养液中的中和剂的量。另外，利用本微生物在低pH范围进行氢发酵时，由于氧 化还原，还可促进所述微生物细胞内产生的氢释放到所述细胞外。另外，本微生物尤其可在低pH范围达到高水平的相对所 消费糖的产氢率(产氢量/糖消费量)(以下称为"比糖产率，，)。即， 以木糖作为加入培养液中的糖在pH4. 5 - pH7. 0的范围培养本微生物 时，以相对培养液中所消费木糖1. 6以上的比糖产率(mol-H2/mo卜木
5糖)产氢。尤其在pH4. 5-pH6. 5的范围培养本微生物时，可从培养 液所含lraol木糖产生2. lmol以上的氢。即，本微生物可以2. 1以上 的比糖产率产氢。本微生物还可在宽温度范围产氢，且可在高温度范围优效 产氢。即，本微生物可在37°C - 65。C范围产氢，优选在45°C - 60。C范 围，更有选在50°C - 6(TC范围，尤其优选在55°C - 6(TC范围优效产氢。 当温度低于37。C时，以及温度高于65。C时，本微生物的产氢效率降低。 —方面，在55。C以上的温度范围时可有效抑制由于混入 不产氢的其它微生物所致的污染，从而本微生物可有效进行氢发酵。 另外，在50。C以上的温度范围时可降低在氢发酵的上游工序中产生的 热对所述氢发酵的影响。即，例如，如上所述，在氢发酵的上游具有从生物质制造 生物燃料的预处理工序的燃料生产系统中，在所述预处理工序中，在 酸或碱存在下，可将植物纤维素于80°C - 230'C加热分解。这时可将 含有在预处理工序中加热的残渣的培养液供于氢发酵，并可通过在所 述氢发酵中使用本微生物来省略对所述培养液的冷却操作，或较之以 往有效减少对所述培养液的冷却操作。另外，本微生物可在任意组合宽的pH范围、宽的温度范 围的条件下产氢，尤其可较以往氩发酵用微生物在组合低的pH、高温 度的条件下优效产氢。即，本微生物可在例如pH4. 5 - pH6. 5的范围、且55。C-60。C的温度范围的条件下以2. 1以上的比糖产率产氢。由此，可通过利用本微生物在低pH、高温下进行氬发酵 来如上所述极有效抑制所述氢发酵过程中的杂菌污染，同时可较以往 有效减少为消除设在上游的生物燃料制造工序的影响而进行的对培养 液的中和操作或冷却操作。另外，本微生物易于在特定条件下自溶。即，本微生物的 细胞体可易于在例如培养液所含特定营养成分的浓度降至特定值时破碎。具体而言，例如，当在以木糖作为糖源的培养液中培养本 微生物时， 一旦所述培养液中的木糖浓度降至500mg/L以下，则本微 生物开始自溶。因此，利用本微生物进行氢发酵可有效降低氢发酵结 束后残留的污泥量。以下说明利用本微生物进行氢发酵的具体例。
实施例以下简述PEH9抹和PEH8抹的获得过程。首先，将采自下 水处理设施的高温厌氧消化污泥用酿酒污水驯化约1个月而得到稳定 生产50%-60°/。氢、40%-50°/。二氧化碳的氢发酵菌群。用改性的GAM培 养基(用于厌氧菌分离，日本水产林式会社制造)从所述菌群分离24 种菌抹，从中选取呈最高产氢性的菌林，命名为PEH8林。随后，将所 述PEH8林经紫外照射法获得了突变林。然后，从经诱变处理的10万种菌林中筛选了可在pH5. 0下 生长的12种菌林，再从中选取产氢性优良的l种菌抹，命名为PEH9林。 ATCC7956林则是通过测定PEH8林的16SrDNA全区域序列， 并基于所述序列进行谱系分析而发现与所述PEH8林亲缘关系最近的 已有菌林。为测定PEH8林与ATCC7956林的异同而进行DNA-DNA杂交 形成实验，确证3次实验的平均同一性值为70%以上。随后，在容积为1L的发酵罐(BMJ-Ol， ABLE林式会社制造)内，于500mL培养基中接种PEH9林、PEH8抹或ATCC7956林，并 在厌氧条件下，以0. 2-0. 4的稀释率进行了连续培养。将培养温度稳定于55°C。通过向培养液中自动添加氢氧 化钠水溶液来将所述培养液的pH逐步调至pH4. 5 - pH7. 0的范围。随后评价了在pH4. 5 - pH7. 0的范围内的各值时PEH9林、 PEH8抹或ATCC7956株的产氢量。用Tedlar包收集产生的发酵气，并 测定了经24小时产生的发酵气的量。用带有热导率检测器(TCD)的 气相色谱装置(GC-14B，抹式会社岛津制作所制造)分析了发酵气的 组成，并根据所述发酵气所含氢的比例计算了产氢量。将高纯度氩气 用作载气，将分子筛5A及Polapack Q用作柱载体，并在入口温度为 60°C，检测器温度为80°C,柱加热炉温度为60'C下进行了所述气相色 语分析。随后，通过将培养基和培养液经离心(15000rmp、 IO分钟) 后的上清经膜过滤(孔径0.2 jam)得到的样品用带有荧光检测器的高 速液相色i普(还原糖分析系统，林式会社岛津制作所制造)进行分析 来测定了所述培养基和培养液所含木糖的量。用柱(Shim-pack ISA-07/S2504,长250mm x直径4. Omm，林式会社岛津制作所制造)， 于65。C温度下，用从100%的溶液A ( 0. 1M的硼酸钾緩沖液)至100% 的溶液B( 0. 4M的硼酸钾緩冲液)的梯度洗脱液作为流动相，以0. 6mL/ 分钟的流速进行了所述高速液相色谱分析。用含1% (w/v)精氨酸和 3% (w/v)硼酸的反应试剂，在所述反应试剂的流速为0. 5mL/分钟， 反应温度为15(TC，荧光检测器的激发波长(Ex)为320nm、荧光波长 (Em)为430nm下进行了木糖检测。测定产氢量时培养液中的菌体密 度约为106- 1()7细胞/mL。

图1、图2、图3分别显示了 PEH9抹、PEH8抹或ATCC7956 林的产氢性测定结果。图l-图3中，横轴为培养液的pH、纵轴为比 糖产率(mo卜H2/mo卜木糖)。如图l所示，将PEH9林用含以木糖作为糖源的培养液培 养时，在pH4. 5-pH7. 0的宽范围良好生长，同时以1.6mo卜H2/mo卜 木糖-3. 2mol-H2/mo卜木糖的高比糖产率产氢。PEH9林尤其在pH4. 8-pH5. 5的低范围也可以2. 1以上的较高比糖产率产氢。具体而言，PEH9林在pH4. 86、 pH5. 02、 pH5. 06、 pH5. 08、 pH5. 10、 pH5. 14、 pH5. 15、 pH5. 36、 pH5. 38时分别可以2. 13、 2.23、 2.23、 2.38、 2.62、 2.61、 2.24、 2.40、 2. 31的比糖产率产氢。PEH9 林在pH5. 86 - pH6. 25时可以2.13-3.16的比糖产率产氢，而在 pH6. 54时可以1. 78的比糖产率产氢。与此相比，如图2所示，PEH8林的比糖产率在pH5. 5以 下显著降低，例如，在pH5. 50时的比糖产率为0.81。还如图3所示， ATCC7956林的比糖产率在pH5. 5、 pH5. 32时分别为0.73、 0.36。由 此证实，PEH9林可在低pH范围(例如至少pH4. 8以上、pH6.3以下的 范围)优效产氩。将培养温度稳定于55°C。通过向培养液中自动添加氢氧 化钠水溶液来将所述培养液的pH调至pH5. 0-pH5. 2的范围。确认PEH9株在培养液中稳定增殖后，如同实施例1通过 气相色谱测定了 5日培养期间的每24小时产生的发酵气的量及所述发 酵气的组成，并从所述测定结果计算出产氢量。此外，由于本实施例 中使用的培养基除木糖之外还含麦芽提取物源糖(麦芽糖、葡萄糖等)， 通过苯酚硫酸法对培养基和培养液进行全糖分析而求出了糖消费量。 另外，氢的比糖产率以标准状态(标准环境温度与压力温度25。C、 气压1巴)下每消费lg糖时的产氢体积表示。
图4显示PEH9抹的产氢性测定结果。图4中，横轴表示培养天数(日)，左纵轴表示各培养日1日间产生的发酵气的量(mL/日)，右纵轴表示所述发酵气中所含氢的体积比(％),白色柱表示发酵气产量，三角标记表示氢体积比。如图4所示，PEH9抹可连续5天稳定产生含氢发酵气。具体而言，5天的平均发酵气产量是1312mL/日，平均氢体积比是56.4%，平均产氢量是740mL/日，平均培养液供给量是154mL/日，所供给培养液中所含平均糖全量是16200mg/L、排出的培养液中所含平均糖全量是466rag/L。所以，PEH9抹可在pH5. 0-pH5. 2范围，以277 - 326 (5天的平均值是306 ) ffiL-H2/g-糖的比糖产率优效产氢。即证实了 PEH9抹可在pH5. 0-pH5. 2范围，以至少270mL-H2/g-糖的比糖产率产氢。图5显示PEH9抹的产氢性测定结果。图5中，横轴表示培养天数(日)，左纵轴表示各培养日1日间产生的发酵气的量(mL/日)，右纵轴表示所述发酵气中所含氢的体积比(％)，白色柱表示发酵气产量，三角标记表示氢体积比。如图5所示，PEH9株可连续5天稳定产生含氬发酵气。具体而言，5天的平均发酵气产量是1676mL/日，平均氢体积比是58.8°/。，平均产氢量是985mL/日，平均培养液供给量是179mL/日，所供给培养液中所含平均糖全量是16200mg/L、排出的培养液中所含平均糖全量是372mg/L。所以，PEH9抹可在pH5. 8-pH6. 0范围，以312 - 393 (5天的平均值是348 ) inL-lWg-糖的比糖产率优效产氢。即证实了 PEH9株可在pH5. 8 - PH6. 0范围，以至少270mL-H2/g-糖的比糖产率产氩。实施例4
在实施例4中，于各温度下进行了氢发酵。本微生物则使用了 PEH9株。培养基则使用了含0. 5。/。(w/v)木糖、1.6。/。(w/v)胰蛋白胨、1.0%(w/v)酵母提取物及0.4% (w/v)氯化钠的水溶液。随后在容积20mL的培养瓶内，于10mL培养液中接种PEH9林，密闭所述培养瓶后，在厌氧条件下，分别于3(TC、 37°C、 45°C、55°C、 60°C、 65。C或70。C的温度下进行了分批培养。从培养开始20小时和90小时后，将注射器剌入各瓶以计算发酵气产量，再如同实施例1通过气相色谱测定了所述发酵气的组成，并从所述测定结果计算出产氢量。此外，为评价培养液中PEH9林的菌密度，在气体分析结束后，用分光光度计测定了培养液的浊度(波长660nm的吸光度)。另外，实施例4的培养液pH于培养开始时是pH6. Q-pH6. 5的范围，在培养期间逐渐降低，到90小时的时间点时至pH4. 5-pH5. 0。图6显示在各温度培养时培养液的浊度的结果。图6中，横轴表示培养时间(小时)，纵轴表示浊度，白色空心圆标记表示在30'C的测定结果，白色空心方标记表示在37。C的测定结果，黑色空心方标记表示在45。C的测定结果，白色空心三角标记表示在55。C的测定结果，黑色空心三角标记表示在60。C的测定结果，白色空心菱形标记表示在65。C的测定结果，黑色空心菱形标记表示在7(TC的测定结果。如图6所示，PEH9林在45。C、 55°C、 60°C、 65。C的各温度培养20小时和90小时的各时间点良好生长，尤其在45。C、 55°C、60。C良好生长，在55。C和60。C最佳生长。此外，PEH9林即便在37°C，在至少培养90小时的时间点也与在其他温度下的培养呈相同程度的良好生长。但PEH9林在3(TC和7(TC培养20小时和90小时的任意时间点均未良好生长。图7显示产氢量的测定结果。图7中，横轴表示培养温度(。C )，纵轴表示每lmL培养液的产氢量(mL-H2/mL-培养基)，黑色柱表示培养开始20小时时间点期间的产氢量测定结果，白色柱表示培养开始90小时时间点期间的产氢量测定结果。而在培养90小时的时间点的产氢量则在37。C和65X:培养时大体相同，在6(TC培养时较之高，在45。C培养时更高，在55。C培养时最高。在30。C和7(TC培养时，在培养20小时和90小时的时间点均基本上无氢产生。由此，PEH9林可在37°C-65。C的宽温度范围优效产氢。另外，PEH9株在45°C - 6(TC的温度范围呈高产氢能力，尤其在55°C呈高产氢能力。实施例5
实施例5中证实了本微生物的溶解性。本微生物则使用了 PEH9林。作为对照，使用了用于排水处理的甲烷菌(甲烷发酵微生物群)。培养液则使用了将10. OOg木糖、4. OOg酵母提取物、2. 50gMOPS、0. 91gK2HP04、 0. 30g NaH2P04、 0. 20g MgCl2 . 6H20、 0. 10g CaCl2 . 2H20、 0. 30g(NH4)2S04、 0. 02g FeS04 . 7H20、 0. 40g L-半胱氨酸及1. 10mg刃天青(resazurin)溶于1L纯水的GBG培养基。随后在溶剂5L的连续培养装置(ABLE林式会社制造)内，于2. 5LGBG培养基中接种PEH9抹，并在pH5. 8 - pH6. 0，温度55。C下进行培养。作为对照的曱烷菌则在pH7. 4 - pH7. 6，温度37。C下进行了培养。从培养液中取样测定全糖值，以营养源(糖)枯竭的时间点(木糖浓度至500mg/L以下的时间点)作为培养第l天，随后测定了第2天、第7天的培养液中的菌体量。菌体量的测定如下取300mL的培养液样品，将所述样品以6000rpm (转/分钟)离心20分钟，除去上清后，用蒸馏水洗净菌体，并再于相同条件下离心，将所得菌体于150。C过夜加热后测定重量。菌体量以将第1天的菌体量作为100时的相对值(以下称为"残留率")表示。
图8显示菌体量的测定结果。图8中横轴表示培养天数(日)，纵轴表示残留率(％)，三角标记表示PEH9林的结果，方标记表示甲烷菌的结果。如图8所示，PEH9林在培养第2天和第7天的菌体量减少较甲烷菌大，证实其易自溶。具体而言，曱烷菌的残留率在培养第2天为94%、培养第7天为77%,与此相比，PEH9林的残留率在培养第2天为72%，培养第7天为48%。实施例6
实施例6中以各种糖作为单一糖源加入而进行了氢发酵。本微生物则使用了 PEH9抹。培养基则使用了含0. 5。"w/v)木糖、1. 6%(w/v)胰蛋白胨、1.0% (w/v)酵母提取物、0.4% (w/v)氯化钠、及添加了2% (w/v)选自葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、麦芽糖、蔗糖、纤维素、可溶性淀粉的中的任一种的7种水溶液。随后在容积20mL的培养瓶内，于10mL各培养基中接种PEH9林，密闭所述培养瓶后，在厌氧条件下，于60。C温度下分别进行了培养。从培养开始48小时后，将注射器刺入各瓶以计算发酵气产量，再如同实施例1通过气相色谦测定了所述发酵气的组成，并从所述测定结果计算出产氢量。结果，由lOmL使用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、麦芽糖、蔗糖、纤维素、可溶性淀粉作为糖源的培养液培养48小时时的产氢量分别为7.00 mL、 6.66 mL、 1.75 mL、 6.32 mL、 7.00 mL、 6.70 mL和4.10 mL。不含糖源的培养液的产氢量为0. 08mL。由此证实PEH9林可消费糖源产氢。本微生物不局限于上述例子。本微生物还可为例如PEH9抹的突变抹。用于获得突变抹的诱变处理方法可有通过紫外线照射的诱变处理、通过在含N-曱基-N，-硝基-N-硝基胍的培养基中培养的诱变处理等。突变株可优选使用继承了如上述PEH9林具备的可在低pH范围、高温度范围优效产氢的能力的突变抹。
权利要求
1.微生物，其为保藏号为FERM BP-10793的热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)菌株。
2. 微生物，其为权利要求1的微生物的突变抹，将其在pH4. 5-pH6. 5的范围培养时，从lg糖产270niL以上的氢。
3. 权利要求2的微生物，将其在pH5. 0-pH6. 0的范围培养时， 从lg糖产270mL以上的氩。
4. 微生物，其为权利要求1的微生物的突变林，当以木糖为糖源， 将其在pH4. 5 - pH6. 5的范围培养时，以相对木糖2. 1以上的摩尔比产 氢。
5. 权利要求4的微生物，当以木糖为糖源，将其在pH4. 8-pH5. 5 的范围培养时，以相对木糖2. 1以上的摩尔比产氢。
全文摘要
本发明提供适于产氢的新微生物。本发明的微生物是保藏号为FERM BP-10793的热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)菌株，或其突变株。
文档编号C12N1/20GK101641434SQ20088000832
公开日2010年2月3日 申请日期2008年1月25日 优先权日2007年3月29日
发明者三谷优, 冲泰弘 申请人:日本札幌啤酒株式会社