用于预测可与前列腺细胞中蛋白酪氨酸激酶和/或蛋白酪氨酸激酶途径相互作用和/或...的制作方法

专利名称：用于预测可与前列腺细胞中蛋白酪氨酸激酶和 /或蛋白酪氨酸激酶途径相互作用和 /或 ...的制作方法
本申请根据美国法典第35编第119条(e)要求享受分别于2007年1月9日和2007年2月2日提交的美国临时专利申请序列号60/879,374和美国临时专利申请序列号60/899,260的权益。本文通过提述引入上述申请的全部内容。
发明领域 本发明一般性地涉及药物基因组学领域，更具体地说，涉及确定患者(特别是患有前列腺癌的患者)的药物敏感性的新的替代方法和程序。本发明有助于开发个性化的遗传特征谱(individualized genetic profiles)，以便根据患者在分子水平上的应答来治疗疾病和病症。

背景技术：
前列腺癌是西方国家男性中最常见的癌症类型。估计仅美国每年就有大约23万男性被诊断出患有前列腺癌，并且有大约3万人死于此病(1)。尽管靶向治疗为癌症患者带来了希望，但是其在前列腺癌治疗中仍然很少使用。目前前列腺癌患者可以获得的疗法包括用于早期肿瘤的传统外科手术、放射和激素治疗，和用于晚期转移性肿瘤的基于

的化疗(2，3)。显然，开发针对前列腺癌的靶向治疗，以及能够精确预测患者对药物的临床应答性从而便于为每个患者进行个性化治疗的方法学，是医学上亟待满足的需求。
鉴定能够更好地预测患者对治疗或疗法的敏感性的新参数可能是解决这个问题的办法。对患者样品的分类是癌症诊断和治疗的一个关键方面。患者对药物处理的应答与分子和遗传标记的关联，可以为针对无应答患者的药物开发开启新的机会，或者可以因为某种药物的疗效的更可信而从其他的治疗选项中突出选用该药物的必要性。而且，预先选择可能对某种成药、药剂或组合疗法应答良好的患者，可以减少临床研究中需要的患者数量或者加速完成临床开发程序所需的时间(M.Cockett等，Current Opinion inBiotechnology，11602-609(2000))。
药物基因组学研究的主要目的就是鉴定出可精确地预测给定患者对药物的临床应答的遗传标志；这种个性化的遗传评估可大大便于个体化治疗。在癌症治疗和疗法中特别需要具有这种性质的方法，因为普遍使用的药剂对很多患者都无效，并且多有副作用。预测患者的药物敏感性特别具有挑战性，因为药物应答不仅反映靶细胞的内在特性，还反映宿主的代谢特征。本领域研究人员利用遗传信息预测药物敏感性的努力主要集中于具有广泛效应的单个多核苷酸，例如多药耐药性多核苷酸mdr1和mrp1(P.Sonneveld，J.Intern.Med.，247521-534(2000))。
用于大规模表征多核苷酸表达模式的微阵列技术的发展，使得系统搜寻多种分子标志和将癌症分类成通过传统组织病理学方法难以区分的不同亚群成为可能(J.Khan等，Cancer Res.，585009-5013(1998)；A.A.Alizadeh等，Nature，403503-511(2000)；M.Bittner等，Nature，406536-540(2000)；J.Khan等，Nature Medicine，7(6)673-679(2001)；和T.R.Golub等，Science，286531-537(1999)；U.Alon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，966745-6750(1999))。这些技术以及分子工具已使得人们能够监视细胞内大量的转录本在任意给定时间的表达水平(见例如Schena等，Science，270467-470(1995)；Lockhart等，Nature Biotechnology，141675-1680(1996)；Blanchard等，NatureBiotechnology，141649(1996)；和1996年8月29日授予Ashby等的美国专利No.5,569,588)。
多核苷酸的差别表达与健康和疾病是如何关联的，这是功能基因组学的基础之一。功能基因组学的定义是针对一个特定细胞或一群细胞表达的全部多核苷酸，以及它们的表达模式在发育、疾病或环境暴露期间的变化的研究。用于研究多核苷酸表达的杂交阵列，可以通过允许同时检查数以千计的多核苷酸的表达变化，从而为在基因组水平上对多核苷酸表达进行分析提供可能。一般而言，对于杂交阵列，基因特异序列(探针)被固定在固态基质上。然后，用来自生物样品(靶)的核酸的带标记拷贝对这些序列进行询问(query)。其理论基础是，一个基因的表达量越大，标记靶的量就越大，因此信号输出也就越大。(W.M.Freeman等，BioTechniques，291042-1055(2000)) 最近的研究证明，从人肿瘤微阵列分析中产生的多核苷酸表达信息能够预测临床结果(L.J.van′t Veer等，Nature，415530-536(2002)；M.West等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9811462-11467(2001)；T.Sorlie等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9810869-10874(2001)；M.Shipp等，Nature Medicine，8(1)68-74(2002))。这些发现说明通过更好地预测个体肿瘤对治疗的应答可望能够大大改进癌症的治疗。
生物标志(biomarkers)能够指示新型抗癌药物临床开发的成功以及患者能够从这种特异靶向治疗中获得的临床效益。利用HER2表达作为患者选择标准已经成功地开发出了

一种靶向乳腺癌中HER2的单克隆抗体疗法。被鉴定出过表达HER2并随后接受此疗法的乳腺癌患者显示出相当大的应答率和深远的临床效益(10)。对比地，在新药开发试验中如果不使用稳健的生物标志，例如在吉非替尼(Gefitinib)(一种靶向表皮生长因子受体(EGFR)的小分子)研发中，则会对该药物的临床开发造成阻碍(11，12)，即使其抑制肿瘤细胞生长的效力已在体外和/或动物模型中得到了完全证明(13，14)。在临床开发中，对于能够指导患者的选择并可帮助在分子水平监视药物效力的分子标志的鉴定已变得越来越重要。
达沙替尼(Dasatinib)是一种可以口服的强效小分子抑制剂，靶向多种胞质或膜结合的酪氨酸激酶，包括Src、BCR-Abl、c-kit、PDGFRβ和EphA2(4，5)。由于这种化合物对大量含有BCR-ABL突变的白血病癌细胞系具有强力的作用(6)，并且当前明显且迫切需要克服对伊马替尼(imatinib)的耐药性，因此对其的开发已经被加快到了白血病的研究性试验中。基于在这些试验中证明的深远的临床效益，达沙替尼最近已被批准用于对伊马替尼耐药或不耐受的慢性骨髓性白血病(CML)和费城染色体阳性急性成淋巴细胞白血病(ALL)(7)。Src激酶参与多种细胞过程，例如细胞迁移、粘附和血管新生，Src还参与多种途径，例如EGFR，并且这些酪氨酸激酶靶标在肿瘤发生中具有潜在的作用(8，9)，这些都促使人们去研究达沙替尼在其他类型的恶性肿瘤，包括实体瘤中的潜在应用。
本领域中需要新的替代方法和程序，用于确定患者的药物敏感性，这是根据患者在分子水平上对蛋白酪氨酸激酶抑制剂的应答治疗疾病和病症(特别是癌症例如前列腺癌)所必需的。通过使用培养细胞作为研究体内效应的模型，本发明有利地聚焦于在细胞培养中揭示出的细胞内在性质，并涉及已确认与药物敏感性相关的多核苷酸。本文所描述的在体外测定的细胞系中的多核苷酸/标志多核苷酸(预测子(predictor)多核苷酸和多核苷酸系列)的发现和鉴定可以用来与体内的药物应答进行关联，从而能够进一步应用到这样的临床情境其中使用相同的多核苷酸来预测患者(特别是前列腺癌患者)对药物和/或化疗剂(包括蛋白酪氨酸激酶抑制剂)的应答。
发明概要 本发明描述了标志多核苷酸的鉴定，所述多核苷酸的表达水平与前列腺细胞系的药物敏感性高度相关，所述前列腺细胞系对蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物或是敏感的，或是耐药的。更具体地，根据本发明被抑制的蛋白酪氨酸激酶包括Src酪氨酸激酶家族的成员，例如Src、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、Lck和Lyn，以及其他蛋白酪氨酸激酶，包括Bcr-abl、Jak、PDGFR、c-kit和Eph受体。关于这些及其他蛋白酪氨酸激酶的综述，见例如P.Blume-Jensen and T.Hunter，“Oncopolynucleotide Kinase Signaling”，Nature，411355-365(2001)。这些多核苷酸中的一些也受到酪氨酸激酶抑制剂化合物(特别是src酪氨酸激酶抑制剂化合物)的调节，表明它们参与了蛋白酪氨酸激酶的信号途径。这些多核苷酸或“标志”显示出在预测宿主对药物和/或药物处理的应答方面的用处。
本发明的一个方面是提供一种细胞培养模型，用于鉴定这样的多核苷酸，所述多核苷酸的表达水平与和疾病状态相关的细胞或患有疾病的宿主对药物的敏感性相关。根据本发明，对于一组未处理细胞系，特别是前列腺细胞系，利用寡核苷酸微阵列测量了其中很多多核苷酸的表达水平，并测定了所述细胞系对蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物的药物敏感性。未处理细胞中的多核苷酸表达特征谱的测定使得化学敏感性(chemosensitivity)的预测及标志多核苷酸的鉴定成为了可能，其中所述标志多核苷酸的表达水平与对如下所述的药物或化合物的敏感性高度相关，所述药物或化合物可调节，优选抑制蛋白酪氨酸激酶或蛋白酪氨酸激酶(如src酪氨酸激酶)参与的途径。因此，标志多核苷酸能够用作一种或多种预测子，预测患者对直接或间接影响蛋白酪氨酸激酶活性的药物或药物治疗的应答。
本发明的另一个方面是提供一种方法，用于针对需要用药物或化疗处理(treatment)或疗法(therapy)来治疗某种疾病状态或者特定类型的癌症或肿瘤(例如前列腺癌或前列腺肿瘤)的个体，在施用这样的处理或化疗之前，确定或预测该个体是否会成功地对该药物或化疗处理或疗法作出应答。优选地，该处理或疗法包括蛋白酪氨酸激酶调节剂，例如蛋白酪氨酸激酶活性的抑制剂。可以被根据本发明的抑制剂化合物抑制其活性的蛋白酪氨酸激酶包括，例如，Src酪氨酸激酶家族的成员，例如Src、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、Lck和Lyn，以及其他蛋白酪氨酸激酶，包括Bcr-abl、Jak、PDGFR、c-kit和Eph受体。此外，根据本发明，在用蛋白酪氨酸激酶调节性化合物或药物(优选src酪氨酸激酶抑制剂)处理之前，对来自患者组织样品(例如前列腺肿瘤或癌症活检物)的细胞进行测验，以确定它们的多核苷酸表达模式。将如此得到的测试细胞在暴露于化合物或药物之前的多核苷酸表达模式，与本文描述和显示的多核苷酸预测子系列(表2)的多核苷酸表达模式进行比较。此外，在这种方法中，也可以个别地或以任何组合使用一种或多种预测子多核苷酸的多核苷酸表达模式，即，例如分别在表2、3、4和5中给出的第174、14、10和5号多核苷酸预测子系列的多核苷酸表达模式，和/或uPA、CK5、EPHA2、AR和/或PSA中的多核苷酸表达模式的测量结果。这些多核苷酸得自于对照组的未处理细胞，所述未处理细胞已经被确定对所述药物或化合物耐药或敏感。
药物治疗的成功或失败，可以根据来自测试组织(测试细胞)-例如肿瘤或癌症活检物-的细胞的多核苷酸表达模式与多核苷酸预测子系列的多核苷酸表达模式是相对类似还是不同来加以确定。因此，如果测试细胞显示的多核苷酸表达特征谱与对药物或化合物敏感的对照组细胞的多核苷酸预测子系列的多核苷酸表达模式相对应，那么很可能，或者可以预计，个体的癌症或肿瘤将对该药物或化合物的处理应答良好。对比地，如果测试细胞显示的多核苷酸表达模式与对药物或化合物耐药的对照组细胞的多核苷酸预测子系列的多核苷酸表达模式相对应，那么很可能，或者可以预计，个体的癌症或肿瘤将不会对该药物或化合物作出应答。
本发明进一步的方面是提供一种筛选测定法(screening assays)，用于确定癌症患者对药物或化合物的治疗，特别是对直接或间接参与蛋白酪氨酸激酶活性或蛋白酪氨酸激酶途径的药物或化合物的治疗，将会是敏感的还是耐药的。这些蛋白酪氨酸激酶包括，但不仅限于，Src酪氨酸激酶家族的成员，例如Src，Fgr，Fyn，Yes，Blk，Hck，Lck和Lyn，以及其他蛋白酪氨酸激酶，包括Bcr-abl，Jak，PDGFR，c-kit和Eph受体。
在一个更具体的方面中，本发明提供了一种筛选测定法，用于确定癌症患者对药物或化合物的治疗，特别是对直接或间接参与src酪氨酸激酶活性或src酪氨酸激酶途径的药物或化合物的治疗，将是敏感的还是耐药的。
本发明的另一个方面提供了一种监测患者治疗的方法，其中该患者患有可以用调节蛋白酪氨酸激酶的化合物或作用剂来治疗的疾病，所述蛋白酪氨酸激酶包括Src酪氨酸激酶家族的成员，例如Src，Fgr，Fyn，Yes，Blk，Hck，Lck和Lyn，以及其他蛋白酪氨酸激酶，包括Bcr-abl，Jak，PDGFR，c-kit和Eph受体。这可以通过比较来自患者组织样品(例如肿瘤或癌症活检物，例如前列腺癌或肿瘤样品)的细胞在用抑制蛋白酪氨酸激酶活性的药物或化合物治疗之前以及在用该药物或化合物治疗之后的耐药性或敏感性多核苷酸表达特征谱来实现。对来自患者组织样品的经分离的测试细胞进行测定，来确定它们在暴露于化合物或药物(例如src酪氨酸激酶抑制剂)之前或之后的多核苷酸表达模式。将如此获得的测试细胞在治疗之前和之后的多核苷酸表达特征谱与预测子系列、预测子亚系列、或者任何单个预测子多核苷酸或其任意组合的多核苷酸表达模式进行比较。因此，如果根据预测子多核苷酸表达特征谱的相关性，患者的应答变为对蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物的治疗敏感，那么患者的治疗预后可以定性为有利，并且治疗可以继续。此外，如果在用药物或化合物治疗之后，测试细胞的多核苷酸表达特征谱没有显示出与对所述药物或化合物敏感的对照组细胞相应的变化，这就可以指示目前的治疗需要修正、改变或甚至中止。这种监测过程可以指示药物或化合物对患者治疗的成功还是失败，并且这种监测过程可以根据需要和期望加以重复。
本发明进一步的方面是提供这样的预测子多核苷酸和多核苷酸预测子系列，它们在如下所述的疾病区域中或疾病状态中同时具有诊断和预测价值在所述疾病区域中藉由蛋白酪氨酸激酶或蛋白酪氨酸激酶途径的信号传导具有重要意义，例如在癌症和肿瘤，免疫障碍、免疫性症候或机能障碍中；在所述疾病状态中细胞信号传导和/或增殖控制是失常或异常的。这样的蛋白酪氨酸激酶(它们的直接或间接调节可以与疾病状态或症候关联)包括Src酪氨酸激酶家族的成员，例如Src，Fgr，Fyn，Yes，Blk，Hck，Lck和Lyn，以及其他蛋白酪氨酸激酶，包括Bcr-abl，Jak，PDGFR，c-kit和Eph受体。根据本发明，使用一种或多种预测子多核苷酸，或预测子多核苷酸系列或亚系列(例如分别在表2、3、4和5中给出的第174、14、10和5号多核苷酸预测子系列，和/或uPA，CK5，EPHA2，AR和/或PSA中多核苷酸表达模式的测量结果，单独地或以其任意组合)可以在对生物学系统或细胞应答一无所知的情况下预测或预报后果。
本发明的另一个方面是将一种或多种与对蛋白酪氨酸激酶抑制剂药物或化合物的耐药性或敏感性高度相关的多核苷酸组合(assemble)成预测子多核苷酸系列，用来预测或合理地预报蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物或可影响不同生物系统中的或用于细胞应答的蛋白酪氨酸激酶信号传导途径的化合物的效果；其中所述多核苷酸例如分别在表2、3、4和5中列出的那些，和/或uPA，CK5，EPHA2，AR和/或PSA的多核苷酸表达模式的测量结果，单独地或以其任意组合。所述的预测子多核苷酸系列在测试细胞对药物应答的体外测定中使用来预测体内结果。根据本发明，本文描述的各种预测子多核苷酸系列，或者这些预测子系列与其他多核苷酸或这些多核苷酸的其他共变量(co-variants)的组合，可用来，例如，预测癌症或肿瘤患者对如下所述的化合物的治疗性干预如何进行应答所述化合物可调节蛋白酪氨酸激酶或调节藉由整个蛋白酪氨酸激酶调节途径而实施的信号传导。多核苷酸预测子系列，或这些多核苷酸的共变量，可用于预测癌症或肿瘤患者如何对采用可调节酪氨酸激酶或酪氨酸激酶活性的化合物的疗法进行应答，所述酪氨酸激酶包括例如Src酪氨酸激酶家族的成员，例如Src，Fgr，Fyn，Yes，Blk，Hck，Lck和Lyn，以及其他蛋白酪氨酸激酶，包括Bcr-abl，Jak，PDGFR，c-kit和Eph受体。
本发明的另一个目的是提供一种或多种专用(specialized)微阵列，例如寡核苷酸微阵列或cDNA微阵列，其包括如本文描述的那些多核苷酸或其组合，它们显示与对蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物的敏感性或耐药性相关的表达特征谱。这些微阵列可用于体外测定，来评估微阵列上的多核苷酸在来自例如肿瘤活检物的测试细胞中的表达水平，并确定这些测试细胞对蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物可能是耐药性的还是敏感性的。例如，专用微阵列可以使用下述制备如本文所描述的并且分别在表2、3、4和5中显示的多核苷酸、多核苷酸亚系列或其组合中一些或全部；和/或uPA、CK5、EPHA2、AR和/或PSA的多核苷酸表达模式的测量结果，单独地或以其任意组合。来自组织或器官活检的细胞可以予以分离并暴露于一种或多种抑制剂化合物。在将从未处理和已处理细胞分离的核酸施加到一个或多个专用微阵列之后，可以确定被测细胞的多核苷酸表达模式，并与预测子多核苷酸模式进行比较；所述预测子多核苷酸模式来自用于该微阵列上生成预测子多核苷酸系列的对照组细胞。根据来自接受测试的细胞的多核苷酸表达模式的结果，可以确定细胞显示的是耐药性还是敏感性多核苷酸表达特征谱。然后可以根据从专用微阵列的分析结果收集获取的信息，来确定或评估来自组织或器官活检的测试细胞是否对蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物以及治疗或疗法的过程有应答。
本发明进一步的方面是提供一种试剂盒，用于确定或预测疾病患者对药物的敏感性或耐药性；所述疾病尤其是癌症或肿瘤，如前列腺癌或肿瘤。这些试剂盒例如可在临床条件下用于测试患者的肿瘤或癌症活检样品，以确定患者的肿瘤或癌症对使用药物、化合物、化疗剂或生物作用剂的给定治疗或疗法是耐药的还是敏感的，其中上述药剂直接或间接地参与修饰，优选抑制，蛋白酪氨酸激酶活性或蛋白酪氨酸激酶活性的相关细胞信号传导途径。所述试剂盒中提供一个或多个微阵列、置于合适容器内的用于测试来自患者组织样品或患者样品的细胞的调节剂/化合物、以及使用说明书；所述微阵列(例如寡核苷酸微阵列或cDNA微阵列)包含与对蛋白酪氨酸激酶调节物的耐药性和敏感性相关的多核苷酸，所述蛋白酪氨酸激酶调节物具体包括Src蛋白酪氨酸激酶家族成员如Src，Fgr，Fyn，Yes，Blk，Hck，Lck和Lyn的抑制剂，以及Bcr-abl，Jak，PDGFR，c-kit和Eph受体蛋白酪氨酸激酶的抑制剂。此外，本发明预期的试剂盒可以包括用于在mRNA或蛋白质水平上监测本发明的预测子或标志多核苷酸的表达的试剂或材料，所述监测使用在本领域中应用的其他技术和系统，例如采用根据本文描述的一种或多种预测子多核苷酸所设计的引物的RT-PCR测定，免疫测定如酶联免疫吸附测定(ELISA)，免疫印迹如Western印迹，或原位杂交等，这些在本文中将做进一步的描述。根据本发明的试剂盒还可以包括一种或多种如表2中给出的预测子多核苷酸，包括预测子多核苷酸的亚系列，其包括，但不仅限于例如分别在表3、4和5中给出的174、14、10和5多核苷酸预测子系列中的预测子多核苷酸亚系列，和/或uPA，CK5，EPHA2，AR和/或PSA的多核苷酸表达模式的测量结果的单个或其任意组合。
本发明的另一个方面是提供本文提到的预测子多核苷酸之中的一种或多种多核苷酸，它们可以用作开发用于疾病治疗的药物的靶标。这些靶标能够特别适用于前列腺疾病(例如前列腺癌或肿瘤)的治疗。因为这些预测子多核苷酸在敏感细胞和耐药细胞中的表达不同，所以它们的表达模式与细胞对可以相互作用于和/或抑制蛋白酪氨酸激酶的化合物的治疗的相对内在敏感性相关，所述蛋白酪氨酸激酶包括Src酪氨酸激酶家族的成员，例如Src，Fgr，Fyn，Yes，Blk，Hck，Lck和Lyn，以及Bcr-abl，Jak，PDGFR，c-kit和Eph受体蛋白酪氨酸激酶。因此，在耐药性细胞中高度表达的多核苷酸可以用作开发用于治疗对蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物耐药的肿瘤的新药的靶标。
本发明的另一个目标是提供针对一种或多种由预测子多核苷酸编码的蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽或其肽的多克隆或单克隆抗体。这些抗体可以有多种用途，例如纯化、检测和靶定本发明的蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽，包括体外和体内诊断、检测、筛选和/或治疗方法等。本发明的蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽包括Src酪氨酸激酶家族的成员，例如Src，Fgr，Fyn，Yes，Blk，Hck，Lck和Lyn，以及Bcr-abl，Jak，PDGFR，c-kit和Eph受体蛋白酪氨酸激酶。
本发明的另一个目的是提供针对一种或多种由预测子多核苷酸编码的蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽或其肽的反义试剂，包括siRNA、RNAi和核酶(ribozyme)试剂。这些反义试剂可以有多种用途，例如检测、靶定和抑制本发明蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的表达，包括体外和体内诊断、检测、筛选和/或治疗方法等。本发明的蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽包括Src酪氨酸激酶家族的成员，例如Src，Fgr，Fyn，Yes，Blk，Hck，Lck和Lyn，以及Bcr-abl，Jak，PDGFR，c-kit和Eph受体蛋白酪氨酸激酶。
本发明还涉及反义化合物，其长度为至少8个至30个核苷酸，与编码本发明的人蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的核酸分子特异杂交，其中所述反义化合物抑制该人蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的表达。
本发明进一步涉及抑制本发明的人蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽在人细胞或组织中的表达的方法，包括使所述细胞或组织在体外或体内与本发明的反义化合物接触，使得蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的表达受到抑制。
本发明还涉及鉴定可以调节蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的生物活性的化合物的方法，包括如下步骤(a)在存在可拮抗所述蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的活性的反义分子的情况下，将候选调节化合物与所述蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽混合(combine)；和(b)鉴定可以逆转(reverse)所述肽的拮抗效应的候选化合物。
本发明还涉及鉴定调节蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的生物活性的化合物的方法，包括如下步骤(a)在存在可拮抗所述蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的活性的小分子的情况下，将候选调节化合物与所述蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽混合；和(b)鉴定可以逆转所述肽的拮抗效应的候选化合物。
本发明还涉及鉴定调节蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的生物活性的化合物的方法，包括如下步骤(a)在存在可激动所述蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽活性的小分子的情况下，将候选调节化合物与所述蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽混合；和(b)鉴定可逆转所述肽的激动效应的候选化合物。
本发明还涉及一种预测子系列(predictor set)，其包括多个多核苷酸，所述多核苷酸的表达可以预示(predictive of)细胞对用可调节蛋白酪氨酸激酶活性或蛋白酪氨酸激酶途径中成员的化合物进行的处理的应答；其中所述多核苷酸选自下组表2中提供的多核苷酸；表2中提供的敏感性预测子多核苷酸；和表2中提供的耐药性预测子多核苷酸。
本发明还涉及一种预测子系列，其包括多个多核苷酸，所述多核苷酸表达可以预示细胞对用可调节蛋白酪氨酸激酶活性或蛋白酪氨酸激酶途径中成员的化合物进行的处理的应答；其中所述多核苷酸选自下组表2中提供的多核苷酸；表2中提供的敏感性预测子多核苷酸；表2中提供的耐药性预测子多核苷酸；uPA，CK5，EPHA2，AR和/或PSA中的一个或多个，单独地或以其任意组合，其中所述多个多核苷酸包括选自下组的数目的多核苷酸至少大约1个多核苷酸；至少大约2个多核苷酸；至少大约3个多核苷酸；至少大约4个多核苷酸；至少大约5个多核苷酸；至少大约6个多核苷酸；至少大约7个多核苷酸；至少大约10个多核苷酸；至少大约15个多核苷酸；至少大约20个多核苷酸；至少大约25个多核苷酸；和至少大约30个多核苷酸。
本发明还涉及一种预测子系列，其包括多个多核苷酸，所述多核苷酸的表达可以预示细胞对用可调节蛋白酪氨酸激酶活性或蛋白酪氨酸激酶途径中成员的化合物进行的处理的应答；其中所述多核苷酸选自下组表2中提供的多核苷酸；表2中提供的敏感性预测子多核苷酸；表2中提供的耐药性预测子多核苷酸；uPA，CK5，EPHA2，AR和/或PSA中的一个或多个，单独地或以其任意组合，其中该多个多核苷酸包括选自下组的数目的多核苷酸至少大约1个多核苷酸；至少大约2个多核苷酸；至少大约3个多核苷酸；至少大约4个多核苷酸；至少大约5个多核苷酸；至少大约6个多核苷酸；至少大约7个多核苷酸；至少大约10个多核苷酸；至少大约15个多核苷酸；至少大约20个多核苷酸；至少大约25个多核苷酸；和至少大约30个多核苷酸；其中该多个多核苷酸包括下组中的成员表3中提供的多核苷酸；表3中提供的敏感性预测子多核苷酸；表3中提供的耐药性预测子多核苷酸；表4中提供的多核苷酸；表4中提供的敏感性预测子多核苷酸；表4中提供的耐药性预测子多核苷酸；表5中提供的多核苷酸；表5中提供的敏感性预测子多核苷酸；和表5中提供的耐药性预测子多核苷酸。
本发明还涉及一种预测子系列，包括多个多核苷酸，所述多核苷酸的表达可以预示细胞对用可调节蛋白酪氨酸激酶活性或蛋白酪氨酸激酶途径中成员的化合物进行的处理的应答；其中所述多核苷酸选自下组表2中提供的多核苷酸；表2中提供的敏感性预测子多核苷酸；以及表2中提供的耐药性预测子多核苷酸；其中所述多个多核苷酸包括选自下组的数目的多核苷酸至少大约1个多核苷酸；至少大约2个多核苷酸；至少大约3个多核苷酸；至少大约4个多核苷酸；至少大约5个多核苷酸；至少大约6个多核苷酸；至少大约7个多核苷酸；至少大约10个多核苷酸；至少大约15个多核苷酸；至少大约20个多核苷酸；至少大约25个多核苷酸；和至少大约30个多核苷酸；其中该多个多核苷酸包括下组中的成员表3中提供的多核苷酸；表3中提供的敏感性预测子多核苷酸；表3中提供的耐药性预测子多核苷酸；表4中提供的多核苷酸；表4中提供的敏感性预测子多核苷酸；表4中提供的耐药性预测子多核苷酸；表5中提供的多核苷酸；表5中提供的敏感性预测子多核苷酸；表5中提供的耐药性预测子多核苷酸，和uPA，CK5，EPHA2，AR和/或PSA中单独或其任意组合的一个或多个；其中该化合物选自下组针对所述多核苷酸或针对蛋白酪氨酸激酶途径的一个或多个成员的反义试剂；针对所述多核苷酸或针对蛋白酪氨酸激酶途径的一个或多个成员的RNAi试剂；针对由所述多核苷酸编码的多肽或针对蛋白酪氨酸激酶途径的一个或多个成员的抗体；和小分子化合物。
本发明还涉及一种预测子系列，其包括多个多核苷酸，所述多核苷酸的表达可以预示细胞对用可调节蛋白酪氨酸激酶活性或蛋白酪氨酸激酶途径中成员的化合物进行的处理的应答；其中所述多核苷酸选自下组表2中提供的多核苷酸；表2中提供的敏感性预测子多核苷酸；表2中提供的耐药性预测子多核苷酸；uPA，CK5，EPHA2，AR和/或PSA中单独的或构成任意组合的任何一个或多个；其中该多个多核苷酸包括选自下组的数目的多核苷酸至少大约1个多核苷酸；至少大约2个多核苷酸；至少大约3个多核苷酸；至少大约4个多核苷酸；至少大约5个多核苷酸；至少大约6个多核苷酸；至少大约7个多核苷酸；至少大约10个多核苷酸；至少大约15个多核苷酸；至少大约20个多核苷酸；至少大约25个多核苷酸；和至少大约30个多核苷酸；其中所述多个多核苷酸包括下组中的成员表3中提供的多核苷酸；表3中提供的敏感性预测子多核苷酸；表3中提供的耐药性预测子多核苷酸；表4中提供的多核苷酸；表4中提供的敏感性预测子多核苷酸；表4中提供的耐药性预测子多核苷酸；表5中提供的多核苷酸；表5中提供的敏感性预测子多核苷酸；表5中提供的耐药性预测子多核苷酸；其中该化合物选自下组针对所述多核苷酸或蛋白酪氨酸激酶途径的一个或多个成员的反义试剂；针对所述多核苷酸或蛋白酪氨酸激酶途径的一个或多个成员的RNAi试剂；针对由所述多核苷酸编码的多肽或蛋白酪氨酸激酶途径的一个或多个成员的抗体；和小分子化合物；其中该化合物是BMS-A。
根据本发明的预测子系列，其中所述细胞是下组中的成员癌细胞、前列腺细胞、前列腺癌细胞、乳房细胞、乳腺癌细胞、肺细胞、肺癌细胞。
本发明还涉及一种预测子系列，其包括多个多肽，所述多肽的表达可以预示细胞对用可调节蛋白酪氨酸激酶活性或蛋白酪氨酸激酶途径中成员的的化合物进行的处理的应答。
本发明还涉及一种预测子系列，其包括多个多肽，所述多肽的表达可以预示细胞对用可调节蛋白酪氨酸激酶活性或蛋白酪氨酸激酶途径中成员的化合物进行的处理的应答；其中所述多肽选自下组表2中提供的多肽；表2中提供的敏感性预测子多肽；表2中提供的耐药性预测子多肽；表3中提供的多肽；表3中提供的敏感性预测子多肽；表3中提供的耐药性预测子多肽；表4中提供的多肽；表4中提供的敏感性预测子多肽；表4中提供的耐药性预测子多肽；表5中提供的多肽；表5中提供的敏感性预测子多肽；表5中提供的耐药性预测子多肽；以及uPA，CK5，EPHA2，AR和/或PSA多肽中单独的或构成任意组合的任何一个或多个。
本发明还涉及一种预测子系列，包括多个多肽，所述多肽的表达可以预示细胞对用可调节蛋白酪氨酸激酶活性或蛋白酪氨酸激酶途径中成员的化合物进行的处理的应答；其中所述多肽选自下组表2中提供的多肽；表2中提供的敏感性预测子多肽；表2中提供的耐药性预测子多肽；以及uPA，CK5，EPHA2，AR和/或PSA多肽中单独的或构成任意组合的任何一个或多个；其中所述多个多肽包含选自下组的数目的多肽至少大约1个多肽；至少大约2个多肽；至少大约3个多肽；至少大约4个多肽；至少大约5个多肽；至少大约6个多肽；至少大约7个多肽；至少大约10个多肽；至少大约15个多肽；至少大约20个多肽；至少大约25个多肽；和至少大约30个多肽。
本发明还涉及一种预测子系列，包括多个多肽，所述多肽的表达可以预示细胞对用可调节蛋白酪氨酸激酶活性或蛋白酪氨酸激酶途径中成员的化合物进行的处理的应答；其中所述多肽选自下组表2中提供的多肽；表2中提供的敏感性预测子多肽；表2中提供的耐药性预测子多肽；以及uPA，CK5，EPHA2，AR和/或PSA多肽中单独或构成任意组合的任何一个或多个；其中所述多个多肽包含选自下组的数目的多肽至少大约1个多肽；至少大约2个多肽；至少大约3个多肽；至少大约4个多肽；至少大约5个多肽；至少大约6个多肽；至少大约7个多肽；至少大约10个多肽；至少大约15个多肽；至少大约20个多肽；至少大约25个多肽；和至少大约30个多肽；其中该多个多肽包括下组中的成员表3中提供的多肽；表3中提供的敏感性预测子多肽；表3中提供的耐药性预测子多肽；表4中提供的多肽；表4中提供的敏感性预测子多肽；表4中提供的耐药性预测子多肽；表5中提供的多肽；表5中提供的敏感性预测子多肽；和表5中提供的耐药性预测子多肽。
本发明还涉及一种预测子系列，包括多个多肽，所述多肽的表达可以预示细胞对用可调节蛋白酪氨酸激酶活性或蛋白酪氨酸激酶途径中成员的化合物进行的处理的应答；其中所述多肽选自下组表2中提供的多肽；表2中提供的敏感性预测子多肽；表2中提供的耐药性预测子多肽；以及uPA，CK5，EPHA2，AR和/或PSA多肽中单独的或任意组合的任何一个或多个；其中所述多个多肽包含选自下组的数目的多肽至少大约1个多肽；至少大约2个多肽；至少大约3个多肽；至少大约4个多肽；至少大约5个多肽；至少大约6个多肽；至少大约7个多肽；至少大约10个多肽；至少大约15个多肽；至少大约20个多肽；至少大约25个多肽；和至少大约30个多肽；其中该多个多肽包括下组中的成员表3中提供的多肽；表3中提供的敏感性预测子多肽；表3中提供的耐药性预测子多肽；表4中提供的多肽；表4中提供的敏感性预测子多肽；表4中提供的耐药性预测子多肽；表5中提供的多肽；表5中提供的敏感性预测子多肽；和表5中提供的耐药性预测子多肽；其中该化合物选自下组针对编码所述多肽或蛋白酪氨酸激酶途径的一个或多个成员的多核苷酸的反义试剂；针对所述多肽或蛋白酪氨酸激酶途径的一个或多个成员的抗体；针对所述多肽或蛋白酪氨酸激酶途径中一个或多个成员的抗体；和小分子化合物。
本发明还涉及一种预测子系列，包括多个多肽，所述多肽的表达可以预示细胞对用可调节蛋白酪氨酸激酶活性或蛋白酪氨酸激酶途径中成员的化合物进行的处理的应答；其中所述多肽选自下组表2中提供的多肽；表2中提供的敏感性预测子多肽；表2中提供的耐药性预测子多肽；以及uPA，CK5，EPHA2，AR和/或PSA多肽中单独或构成任意组合的任何一个或多个；其中所述多个多肽包含选自下组的数目的多肽至少大约1个多肽；至少大约2个多肽；至少大约3个多肽；至少大约4个多肽；至少大约5个多肽；至少大约6个多肽；至少大约7个多肽；至少大约10个多肽；至少大约15个多肽；至少大约20个多肽；至少大约25个多肽；和至少大约30个多肽；其中该多个多肽包括下组中的成员表3中提供的多肽；表3中提供的敏感性预测子多肽；表3中提供的耐药性预测子多肽；表4中提供的多肽；表4中提供的敏感性预测子多肽；表4中提供的耐药性预测子多肽；表5中提供的多肽；表5中提供的敏感性预测子多肽；和表5中提供的耐药性预测子多肽；其中该化合物选自下组针对编码所述多肽或蛋白酪氨酸激酶途径的一个或多个成员的多核苷酸的反义试剂；针对所述多肽或蛋白酪氨酸激酶途径的一个或多个成员的抗体；针对所述多肽或蛋白酪氨酸激酶途径中一个或多个成员的抗体；和小分子化合物；其中所述化合物是BMS-A。
本发明还涉及一种用于预测化合物是否能够调节细胞的活性的方法，其包括如下步骤获得细胞样品；确定所述细胞是否表达多个标志；和将所述标志的表达与化合物调节所述细胞的活性的能力相关联。
本发明还涉及一种用于预测化合物是否能够调节细胞的活性的方法，其包括如下步骤获得细胞样品；确定所述细胞是否表达多个标志；和将所述标志的表达与化合物调节所述细胞活性的能力相关联，其中所述多个标志是多核苷酸。
本发明还涉及一种用于预测化合物是否能够调节细胞的活性的方法，其包括如下步骤获得细胞样品；确定所述细胞是否表达多个标志；和将所述标志的表达与化合物调节所述细胞活性的能力相关联，其中所述多个标志是多核苷酸；其中所述多核苷酸、化合物和细胞是在本文公开的多核苷酸、化合物和细胞。
本发明还涉及一种用于预测化合物是否能够调节细胞的活性的方法，其包括如下步骤获得细胞样品；确定所述细胞是否表达多个标志；和将所述标志的表达与化合物调节所述细胞活性的能力相关联，其中所述多个标志是多肽。
本发明还涉及用于鉴定多核苷酸和多肽的多个细胞系，所述多核苷酸和多肽的表达水平与和疾病状态关联(associated with)的细胞对化合物的敏感性或耐药性相关，其中所述多个细胞系是前列腺癌细胞系、乳腺癌细胞系或肺癌细胞系。
本发明还涉及一种用于鉴定可预示(predict)与疾病状态关联的细胞对化合物的敏感性或耐药性的多核苷酸和多肽的方法，其包括如下步骤使多个细胞系接触一种或多种化合物；分析多核苷酸或多肽微阵列(a miroarrayof plynucleotides or polypeptides)的表达模式；以及利用所述微阵列的所述表达模式来选择可预示与疾病状态关联的细胞的敏感性或耐药性的多核苷酸或多肽；其中所述化合物是本文公开的化合物，并且其中所述疾病是前列腺癌、乳腺癌和/或肺癌。
本发明还涉及一种方法，用于预测需要进行疾病状态的治疗的个体是会成功地对所述治疗发生应答，或是不会对所述治疗发生应答，其包括如下步骤从所述个体获得细胞样品；确定所述细胞是否表达多个标志；和将所述标志的表达与个体应答所述治疗的能力相关联。
本发明还涉及一种方法，用于预测需要进行疾病状态的治疗的个体是会成功地对所述治疗发生应答，或是不会对所述治疗发生应答，其包括如下步骤从所述个体获得细胞样品；确定所述细胞是否表达多个标志；和将所述标志的表达与个体应答所述治疗的能力相关联；其中所述多个标志是多核苷酸；其中所述多核苷酸和化合物在本文中公开。
本发明还涉及一种方法，用于预测需要进行疾病状态的治疗的个体是会成功地对所述治疗发生应答，或是不会对所述治疗发生应答，其包括如下步骤从所述个体获得细胞样品；确定所述细胞是否表达多个标志；和将所述标志的表达与个体应答所述治疗的能力相关联；其中所述多个标志是多肽；其中所述多肽和化合物在本文中公开。
本发明还涉及一种方法，用于筛选能够结合蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽和/或调节该多肽的活性的候选化合物，其包括使测试化合物与本文描述的多肽接触；和选择结合该多肽和/或调节其活性的测试化合物作为候选化合物。
本发明还涉及一种治疗受试者中前列腺癌的方法，包括施用一种或多种蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的调节物(a modulator of one or more protein酪氨酸激酶biomarker polypeptides)，其中所述多肽选自下组表2中提供的多肽；表2中提供的敏感性预测子多肽；表2中提供的耐药性预测子多肽；表3中提供的多肽；表3中提供的敏感性预测子多肽；表3中提供的耐药性预测子多肽；表4中提供的多肽；表4中提供的敏感性预测子多肽；表4中提供的耐药性预测子多肽；表5中提供的多肽；表5中提供的敏感性预测子多肽；表5中提供的耐药性预测子多肽；以及uPA，CK5，EPHA2，AR和/或PSA多肽中单独的或任意组合的任何一个或多个。
本发明还涉及一种方法，通过测量患者样品中激肽释放酶3和雄激素受体的表达水平来预测患者是否可能对蛋白酪氨酸激酶抑制剂具有耐药性，所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂例如N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺，其中激肽释放酶3和/或雄激素受体的表达水平相对于在标准样品中观察到的水平有所提高(例如大约比标准高2倍或更高)，则表明对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂的至少部分的耐药性；而激肽释放酶3和/或雄激素受体的表达相对于在标准样品中观察到的水平有所降低(例如大约比标准低2倍或更低)，则表明对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂的敏感性。表达特征谱测量可以是在mRNA水平也可以是在蛋白质水平进行的。
本发明还涉及一种方法，通过测量患者样品中细胞角蛋白5的表达水平预测患者是否对蛋白酪氨酸激酶抑制剂，例如N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺，具有耐药性，其中如果患者样品中细胞角蛋白5的表达水平相对于在标准样品中观察到的水平降低(例如大约比标准低2倍或更低)，则表明对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂至少部分耐受；如果患者样品中细胞角蛋白5的表达水平相对于在标准样品中观察到的水平提高，则表明对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂敏感。表达特征谱测量结果可以是在mRNA水平也可以是在蛋白质水平。
本发明还涉及一种方法，通过确定患者样品是否显示前列腺细胞系的基底细胞型表型的征象，来预测患者是否可能对蛋白酪氨酸激酶抑制剂(如N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺)具有耐药性，其中如果存在这些征象，则表明对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂敏感。这些征象可以构成这种表型的表达特征谱签名(expression profile signature)、细胞形态学、组织化学签名(histochemicalsignature)、或其他本领域已知的与前列腺细胞系的基底细胞型表型相关的征象。
本发明还涉及一种方法，通过测量患者样品中激肽释放酶3、雄激素受体和细胞角蛋白5的表达水平来预测患者是否可能对蛋白酪氨酸激酶抑制剂(如N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺)具有耐药性，其中如果患者样品中激肽释放酶3和/或雄激素受体相对于在标准样品中观察到的水平提高(例如大约比标准高2倍或更高)，同时细胞角蛋白5的表达水平相对于在标准样品中观察到的水平降低(例如大约比标准低2倍或更低)，则表明对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂至少部分耐受；如果患者样品中激肽释放酶3和/或雄激素受体的表达相对于在标准样品中观察到的水平降低(例如大约比标准低2倍或者更低)同时细胞角蛋白5的表达水平相对于在标准样品中观察到的水平提高(例如大约比标准高2倍或更高)，则表明对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂敏感。表达特征谱测量结果可以是在mRNA水平也可以是在蛋白质水平。
本发明还涉及一种方法，通过测量患者样品中SCEL，ANXA3，CST6，LAMC2，ZBED2，EREG，AXL，FHL2，PLAU和/或ARNTL2的表达水平来预测患者是否可能对蛋白酪氨酸激酶抑制剂(如N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺)具有耐药性，其中如果患者样品中SCEL，ANXA3，CST6，LAMC2，ZBED2，EREG，AXL，FHL2，PLAU和/或ARNTL2的表达水平相对于在标准样品中观察到的水平降低(例如大约比标准低2倍或更低)，则表明对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂至少部分地耐受；如果患者样品中SCEL，ANXA3，CST6，LAMC2，ZBED2，EREG，AXL，FHL2，PLAU和/或ARNTL2的表达相对于在标准样品中观察到的水平提高(例如大约比标准高2倍或者更高)，则表明对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂敏感。表达特征谱测量结果可以是在mRNA水平也可以是在蛋白质水平。
本发明还涉及一种方法，通过测量患者样品中EPHA2的表达水平来预测患者是否可能对蛋白酪氨酸激酶抑制剂(如N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺)具有耐药性，其中如果患者样品中EPHA2的表达水平相对于在标准样品中观察到的水平降低(例如大约比标准低2倍或更低)，则表明对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂至少部分地耐受；而如果患者样品中EPHA2的表达相对于在标准样品中观察到的水平提高(例如大约比标准高2倍或者更高)，则表明对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂敏感。表达特征谱测量结果可以是在mRNA水平也可以是在蛋白质水平。
本发明还涉及一种方法，通过测量患者样品中UPA的表达水平来预测患者是否对蛋白酪氨酸激酶抑制剂(例如N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺)具有耐药性，其中若患者样品中UPA的表达水平相对于在标准样品中观察到的水平降低(例如大约比标准低2倍或更低)，则表明对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂至少部分地耐受；如果患者样品中UPA的表达相对于在标准样品中观察到的水平提高(例如大约比标准高2倍或者更高)，则表明对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂敏感。表达特征谱测量结果可以是在mRNA水平也可以是在蛋白质水平。
本发明还涉及一种方法，其利用替代标志(surrogate marker)来预测癌症患者对蛋白酪氨酸激酶抑制剂的应答性，包括如下步骤比较预测多核苷酸或多肽标志在施用蛋白酪氨酸激酶抑制剂(如N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺)之前和之后的表达水平，其中如果在所述施用之后所述预测标志的表达比没有所述施加时降低，则表明所述患者对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂是应答性的，其中所述预测标志的代表是表2、3、4或5中提供的一种或多种敏感性标志，包括但不限于SCEL、ANXA3、CST6、LAMC2、ZBED2、EREG、AXL、FHL2、PLAU和/或ARNTL2。
本发明还涉及一种方法，其利用替代标志来预测癌症患者对蛋白酪氨酸激酶抑制剂的应答性，包括如下步骤比较预测多核苷酸或多肽标志在施用蛋白酪氨酸激酶抑制剂(如N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺)之前和之后的表达水平，其中如果在所述施用之后所述预测标志的表达比没有所述施用时降低，则表明所述患者对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂是应答性的，其中所述预测标志的代表是表2、3、4或5中提供的一种或多种敏感性标志，包括但不限于SCEL，ANXA3，CST6，LAMC2，ZBED2，EREG，AXL，FHL2，PLAU和/或ARNTL2。
本发明还涉及一种方法，用于确定蛋白酪氨酸激酶抑制剂的有效剂量，其包括如下步骤比较预测敏感性多核苷酸或多肽标志在施用蛋白酪氨酸激酶抑制剂(如N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺)之前和之后的表达水平，其中如果所述预测标志的表达降低到标准表达水平之下的规定水平，则表明所述患者达到了所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂的有效剂量，其中所述预测敏感性标志的代表是表2、3、4或5中给出的一种或多种敏感性标志，包括但不限于，SCEL，ANXA3，CST6，LAMC2，ZBED2，EREG，AXL，FHL2，PLAU和/或ARNTL2。
结合本文一并提供的附图来阅读本发明的详细说明，本发明进一步的方面、特征和优势将得到更好的理解。



图1.与达沙替尼敏感性相关的生物标志的鉴定。(A)鉴定潜在的预测性生物标志和替代生物标志的发现策略。(B)16种前列腺癌细胞系对达沙替尼的IC50测定和敏感性分类。(C)显示174个基因的相对表达模式的聚类分析，这些基因与16种细胞系对达沙替尼的敏感性/耐药性分类高度相关。达沙替尼敏感性细胞系用红色突出显示，三个重要前列腺细胞标志CK5，PSA和AR的位置在热图(heatmap)上标示出来。这些基因在敏感组和耐药组之间有超过3倍的差异表达。(D)CK5，PSA和AR在16种细胞系中的相对基线基因表达。耐药细胞为黑色，敏感细胞为红色。X轴上的数值是以log2为坐标尺度(log2-scale)的表达水平。
图2.EphA2基因表达与达沙替尼敏感性的相关性。(A)16种细胞系中，EphA2表达水平(●)与IC50(◆)值负相关。Pearson相关系数为-0.66，表明高度反相关。(B)EphA2蛋白在5种敏感性和3种耐药性细胞系中的表达。总体上，这些细胞系中的蛋白表达水平与用微阵列检测到的mRNA水平的相关性良好。
图3.在mRNA和蛋白水平上分析的PLAU基因的表达以及达沙替尼对其的调节。(A)PLAU基因在耐药(R，黑色)和敏感(S，红色)细胞系之间的差异基线表达。X值是以log2为坐标尺度的表达水平。表达高水平PLAU的耐药细胞系是WPMY1，表达低水平PLAU的敏感细胞系是LNCaP。(B)在5种敏感细胞系中，达沙替尼处理导致PLAU mRNA水平下调。细胞用100nM达沙替尼(+D)或DMSO(Ctrl)处理48小时。配对t-检验中p值为0.048，表明PLAU mRNA在达沙替尼处理后显著减少。(C)达沙替尼诱导的PLAU mRNA下调与细胞系对达沙替尼的敏感性之间的相关性。除了这5种敏感细胞之外，另外三种达沙替尼耐药细胞系22Rv，MDAPCa2b和VcaP也与图3B所示相同地用达沙替尼进行处理。PLAU被达沙替尼下调的程度(Y轴)与这8种细胞系的log2IC50值(X轴)负相关。(D)PC3细胞中PLAUmRNA表达的剂量依赖性下调。细胞用不同浓度的达沙替尼处理4或24小时，或者不处理。PLAU相对于对照的表达水平在Y轴上显示。(E)PC3细胞中，分泌的uPA蛋白质被达沙替尼而非

剂量依赖性抑制。细胞用不同剂量的达沙替尼、

或DMSO处理24小时。由50,000个活细胞分泌到培养基中的uPA蛋白量用ELISA试验进行估计。
图4.一个5基因模型在前列腺细胞系和肿瘤中的表达模式。(A)5个基因AR，PSA，CK5，PLAU和EphA2在前列腺细胞系中的层次聚类。AR和PSA是两种腔内(luminal)细胞标志，CK5(KRT5)是基底细胞标志。这5个基因将耐药细胞系与占大部分的敏感细胞(标记为红色)区分开来。注意在敏感细胞中的高CK5表达和/或PLAU、EphA2表达，而在耐药细胞中则几乎为相反的表达模式。(B)这5个基因在52例前列腺肿瘤中的表达模式。在

HG-U95基因芯片对此公开数据系列的基因表达进行特征谱分析(profile)。在芯片上有两个AR探针系列、三个PSA探针系列和一个CK5、PLAU和EphA2探针系列可用，检索(retrieve)它们来进行聚类分析。用红色突出显示的肿瘤样品显示达沙替尼敏感模式，即具有低的AR和PSA表达，以及高的KRT5和/或PLAU，EphA2表达。
图5.使用uPA表达水平作为肿瘤对BMS-A的敏感性预测的替代物。在存在和不存在达沙替尼的条件下，测量带有PC3异种移植肿瘤的小鼠的血浆中的uPA蛋白水平。在nu/nu无胸腺小鼠中皮下建立异种移植肿瘤。在肿瘤达到大约200mg后，将小鼠分为3组，每组8只。对两组分别用15或30mg/kg的达沙替尼进行处理，第三组不接受达沙替尼，作为对照。达沙替尼按照给药5天然后停药2天的程式进行给药，给药时一天口服给药2次，总共给药20剂。在处理之前以及在处理开始后的两周内每周对肿瘤大小进行测量，并采集血样。如图所示，BMS-A依赖的uPA表达水平调制与肿瘤异种移植生长具有一致性。实验如实施例2所述来实施。
表格说明 表1是根据IC50结果给出的16个前列腺细胞系对蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物BMS-A的耐药性/敏感性表型分类。用实施例1(“方法”)中描述的MTS试验法评估每个细胞系的IC50。平均IC50值以及标准偏差(SD)是从对所示每个细胞系的2-5次单独测定中计算出的。IC50的单位是μM。每个细胞系的平均IC50通过对数转换为log10(IC50)，计算16个乳腺细胞系对BMS-A的平均log10(IC50)，并利用它来将每个细胞系的IC50数据标准化。将IC50低于0.2μM的细胞系定义为对化合物敏感，而IC50高于0.2μM的细胞系则认为是耐药性。粗体给出的细胞系被用于本文所描述的药物诱导研究。
表1 表2显示了由三种分析算法获得的多核苷酸列表，显示在表达模式与对BMS-A的耐药性/敏感性分类之间存在高相关性。对于每个基因，表2中SEQ ID NO所代表的DNA和所编码的氨基酸序列在“序列列表”中给出。基因根据倍数改变(fold change)进行排列。











表3 在前列腺和乳腺临床前模型中鉴定的通用预测标志 ***基因编号175(EPHA2)、176(POPDC3)和177(GPD1L)的多核苷酸和多肽序列的SEQ ID NO分别是SEQ ID NO9和10，SEQ ID NO353和354，以及SEQ ID NO355和356。
表4列举了10个多核苷酸的预测子系列。这10个多核苷酸是根据从三种分析方法和药物处理研究中获得的数据从表2所示的174个多核苷酸中选出的。
表4 表5列举的是5个多核苷酸的预测子系列。
表5
表6列出了用于每一个本发明蛋白酪氨酸激酶生物标志多核苷酸的代表性RT-PCR引物系列。给出了每个RT-PCR引物的SEQ ID NO(SEQ IDNO357-887)。
表6












发明详细说明 本发明描述了多核苷酸的鉴定，所述多核苷酸与未处理细胞系的药物敏感性或耐药性相关，从而确定或预测细胞对药物、化合物或生物作用剂的敏感性。这些多核苷酸在本文称作标志(marker)或预测子(predictor)多核苷酸，可用于预测药物应答。标志多核苷酸是在一种体外测定中被确定的，该体外测定采用微阵列技术同时监测未处理细胞中数以千计的离散多核苷酸的表达模式，测试这些细胞对化合物或药物，特别是对可调节(例如抑制)蛋白酪氨酸激酶或蛋白酪氨酸激酶活性的化合物的敏感性。与对药物、化合物或生物作用剂的应答相关的蛋白酪氨酸激酶或其活性包括，例如，Src蛋白酪氨酸激酶家族的成员，例如Src，Fgr，Fyn，Yes，Blk，Hck，Lck和Lyn，以及Bcr-abl，Jak，PDGFR，c-kit和Eph受体蛋白酪氨酸激酶。(见例如P.Blume-Jensen and T.Hunter，“Oncopolynucleotide Kinase Signaling”，Nature，411355-365(2001))。
借助本发明的测定法已经鉴定了本文称作蛋白酪氨酸激酶生物标志的标志多核苷酸，它们在细胞中的表达水平与细胞显示的药物敏感性高度相关。这些标志多核苷酸包括上面列出的编码蛋白酪氨酸激酶的多核苷酸，并可作为分子工具用于预测对药物、化合物、生物作用剂、化疗剂等的应答，优选地对那些可通过直接或间接抑制或拮抗蛋白酪氨酸激酶功能或活性而影响蛋白酪氨酸激酶活性的药物和化合物的应答。
在其优选方面，本发明描述了这样的多核苷酸，它们与前列腺细胞系对用本文描述的蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物例如BMS-A的处理的敏感性或耐药性相关(图1和表2)。用于鉴定本发明的多核苷酸预测子系列的蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物BMS-A，在WO 00/62778中有描述，其于2000年10月26目公布，在此通过提述纳入其全部内容。BMS-A对多种蛋白酪氨酸激酶，例如Src蛋白酪氨酸激酶家族成员，包括Src，Fgr，Fyn，Yes，Blk，Hck，Lck和Lyn，以及Bcr-abl，Jak，PDGFR，c-kit和Eph受体蛋白酪氨酸激酶，具有强抑制活性。更具体地，对于所分析的BMS-A蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物，发现有176个预测子多核苷酸的表达与前列腺细胞系对化合物的耐药性/敏感性相关。
本文使用的术语“BMS-A”是指具有如下结构(I)的化合物
根据IUPAC系统命名法，化合物(I)也可以称作N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺，或称N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-((6-(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基)-2-甲基-4-嘧啶基)氨基)-1，3-噻唑-5-甲酰胺。术语“N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺”的使用包括(除非另外指出)化合物(I)或其盐的溶剂化物(包括水合物)和多晶型物(例如USSN11/051,208中描述了(I)的一水合物，USSN 11/051,208于2005年2月4日递交，在此通过提述纳入其全部内容用于所有目的)。N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺的药物组合物包括所有包含N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺和一种或多种稀释剂、溶媒和/或赋形剂的药学上可接受的组合物，例如在USSN 11/402,502中描述的那些组合物，USSN 11/402,502于2006年4月12日递交，在此通过提述纳入其全部内容用于所有目的。包含N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺的药物组合物的一个实例是

(Bristol-Myers Squibb公司)。

包括作为活性成分的N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺，也称作达沙替尼(dasatinib)，并包括作为非活性成分或赋形剂的一水乳糖、微晶纤维素、交联羧甲纤维素钠(croscarmellose sodium)、羟丙基纤维素和硬脂酸镁，并制成包含羟丙甲纤维素(hypromellose)、二氧化钛和聚乙二醇的药片。
根据本发明发现了一种方法，借助该方法已经鉴定了这样的多核苷酸和多核苷酸组合，它们在一部分(a subset of)细胞系中的表达与对用一种如下所述的化合物或一系列此类化合物之组合的治疗或疗法的细胞应答相关，并可用作所述细胞应答的体外预测子这些化合物已知可抑制或激活某种直接或间接参与细胞增殖、细胞对外来刺激(例如配体结合)或信号传导的应答的蛋白、酶或分子(例如受体)，例如蛋白酪氨酸激酶，的功能。优选的是给定蛋白(例如酪氨酸激酶)的功能的拮抗剂或抑制剂。
在一个优选方面，利用BMS-A蛋白酪氨酸激酶抑制剂确定一组前列腺细胞系在暴露于该化合物之后的药物敏感性。一些细胞系被确定对该抑制剂化合物的治疗耐药，而其他的则被确定对该抑制剂敏感。(表1)。一部分被检测的细胞系提供了这样的多核苷酸和多核苷酸组合的表达模式或特征谱，其与细胞对抑制剂化合物及具有相似作用模式和/或结构的化合物的应答相关，并因此用作所述细胞应答的预测子。(表2、3、4-5)。
此类具有与细胞在暴露于药物或药物组合之后的敏感性或耐药性相关的表达模式的多核苷酸预测子系列提供了一种有用的工具，用于在用药物或药物组合进行治疗之前，对癌症、肿瘤、或患者测试样品进行筛选。借助该筛选技术，可以根据预测子系列的多核苷酸表达结果，对那些暴露于药物或药物组合的癌症、肿瘤或测试样品的细胞进行预测，以预测这些癌症、肿瘤或测试样品，以及带有该癌症和/或肿瘤的患者，是否会对该药物或药物组合作出应答。此外，预测子多核苷酸或预测子多核苷酸系列还可以如本文所述地用于监视正在用蛋白酪氨酸激酶(例如src酪氨酸激酶)抑制剂化合物或化疗剂对疾病(例如前列腺癌)进行治疗的患者的疾病治疗或疗法的进展情况。
根据本发明的一个特定实施方案，使用寡核苷酸微阵列对一组16个未经处理的前列腺细胞系中的超过22,000个探针系列的表达水平进行测量，确定这些细胞系对蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物的药物敏感性。进行这项分析是为了确定未处理细胞的多核苷酸表达签名是否足以预测化学敏感性。通过数据分析鉴定了这样的标志多核苷酸，其表达水平被发现与药物敏感性高度相关。此外，用BMS-A蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物对细胞进行处理也提供了可以预示对化合物的敏感性的多核苷酸表达签名。因此，在其一个实施方案中，本发明提供了这些多核苷酸，即多核苷酸“标志”或“生物标志”或“预测子”，其可用于预测细胞对药物处理或暴露后的药物应答。特别地，标志或预测子多核苷酸是编码蛋白酪氨酸激酶生物标志蛋白/多肽(如src酪氨酸激酶抑制剂生物标志)的蛋白酪氨酸激酶生物标志多核苷酸。
在下文中更详细地描述了本发明所涵盖的多核苷酸表达和标志多核苷酸鉴定分析的实施，但不构成限制。
本发明提供了用于确定患有BCR-ABL相关疾患的个体对特定治疗方案的应答性的方法，以及治疗患有BCR-ABL相关疾患的个体的方法。
本文使用的术语“BCR-ABL”包括野生型和突变体BCR-ABL。
“BCR-ABL相关疾患”是由于BCR-ABL活性包括突变体BCR-ABL活性所导致，和/或被BCR-ABL包括突变体BCR-ABL的表达和/或活性的抑制所缓解的疾患。染色体9和22之间的相互易位(reciprocal translocation)产生致癌的BCR-ABL融合蛋白。术语“BCR-ABL相关疾患”包括“突变体BCR-ABL相关疾患”。
本发明范围内包含的疾患包括例如白血病，包括例如慢性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病和费城染色体阳性急性淋巴母细胞白血性病(Ph+ALL)，鳞状细胞癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，神经胶质瘤，胃肠癌，肾癌，卵巢癌，肝癌，结直肠癌，子宫内膜癌，肾癌，前列腺癌，甲状腺癌，神经母细胞瘤，胰腺癌，多形性胶质母细胞瘤，子宫颈癌，胃癌(stomach cancer)，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌(colon carcinoma)，头颈癌，胃癌(gastric cancer)，生殖细胞肿瘤，儿科肉瘤(pediatric sarcoma)，鼻腔-鼻窦自然杀伤细胞(sinonasal natural killer)，多发性骨髓瘤，急性髓细胞性白血病，慢性淋巴细胞白血病，肥大细胞增多症(mastocytosis)，以及任何与肥大细胞增多症相关的症状。此外，疾患包括色素性荨麻疹，肥大细胞增多症，例如弥散性皮肤肥大细胞增多症、人孤立肥大细胞瘤(solitarymastocytoma)、以及犬肥大细胞瘤，和一些罕见亚型例如大疱性、红皮病性和毛细管扩张性肥大细胞增多症，具有相关血液疾患如骨髓增殖性或骨髓增生异常性综合征或者急性白血病的肥大细胞增多症，与肥大细胞增多症相关的骨髓增殖性疾病，和肥大细胞白血病。各种其他癌症也包含在蛋白酪氨酸激酶相关疾患的范围内，包括例如下列癌，包括如下器官的癌膀胱、乳腺、结肠、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、胃、子宫颈、甲状腺、睾丸(特别是睾丸精原细胞瘤)、和皮肤；包括鳞状细胞癌、胃肠间质肿瘤(“GIST”)；淋巴谱系的造血系统肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和Burketts淋巴瘤；骨髓谱系的造血系统肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病和前髓细胞性白血病；起源于间质的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤(rhabdomyoscarcoma)；其他肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、神经母细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和外周神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤(schwannoma)；起源于间质的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；和其他肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病(xenoderma pigmentosum)、角化棘皮瘤(keratoactanthoma)、精原细胞瘤、滤泡性甲状腺癌(thyroid follicularcancer)、畸胎癌、化疗难治愈的非精原细胞生殖细胞肿瘤(chemotherapyrefractory non-seminomatous germ-cell tumors)，和卡波西肉瘤。在某些优选实施方案中，所述疾患是白血病、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、黑素瘤和实体瘤。在某些优选实施方案中，白血病是慢性骨髓性白血病(CML)，Ph+ALL，AML，伊马替尼耐药性CML、伊马替尼不耐受性CML、加速型(accelerated)CML、淋巴系急变期(lymphoid blast phase)CML。
“实体瘤”包括例如肉瘤、黑素瘤、癌、或其他实体肿瘤癌症。
术语“癌症”(cancer)、“癌性”(cancerous)或“恶性”是指或描述哺乳动物中以不受节制的细胞生长为典型特征的生理状况。癌的实例包括，例如，白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、癌和肉瘤。这些癌症的更具体的实例包括慢性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞白血病、费城染色体阳性淋巴母细胞白血病(Ph+ALL)、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、胃肠癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤，子宫颈癌，胃癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，头颈癌，胃癌，生殖细胞肿瘤、儿科肉瘤(pediatric sarcoma)，鼻腔-鼻窦自然杀伤细胞(sinonasal naturalkiller)，多发性骨髓瘤，急性髓细胞性白血病(AML)，和慢性淋巴细胞白血病(CML)。
“白血病”是指造血器官的进行性、恶性疾病，一般的特征是在血液和骨髓中的白细胞及其前体的增殖和发育紊乱。白血病的一般临床分类是根据；(1)疾病的持续时间和特性——急性或慢性；(2)所涉及的细胞类型；骨髓(骨髓性)、淋巴(淋巴性)、或单核细胞性；和(3)血液中异常细胞的数目是增加还是不增加——白血性或非白血性(亚白血性)。白血病包括，例如，急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性前髓细胞白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病、白血性白血病(leukocythemic leukemia)、嗜碱性粒细胞白血病、母细胞性白血病、牛白血病、慢性骨髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚细胞性白血病(embryonal leukemia)、嗜酸性粒细胞性白血病、格罗斯氏白血病(Gross’sleukemia)、毛细胞白血病、成血细胞性白血病、成血细胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病(lymphatic leukemia)、淋巴母细胞白血病、淋巴细胞性白血病(lymphocytic leukemia)、淋巴细胞白血病(lymphogenous leukemia)、淋巴系白血病(lymphoid leukemia)、淋巴肉瘤白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、小原粒型白血病、单核细胞白血病、成髓细胞白血病、髓细胞性白血病(myelocytic leukemia)、骨髓性粒细胞性白血病、粒单核细胞性白血病(myelomonocytic leukemia)、内格利型(Naegeli)白血病、浆细胞白血病、浆细胞性白血病、前髓细胞性白血病(promyelocytic leukemia)、Rieder细胞白血病、Schilling白血病、干细胞白血病、亚白血性白血病、和未分化细胞性白血病。在某些方面中，本发明提供对慢性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞白血病、和/或费城染色体阳性急性淋巴母细胞白血病(Ph+ALL)的治疗。
本发明涵盖了基于如下证据的治疗方法带有不同BCR-ABL突变的患者对伊马替尼和N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺分别具有不同程度的耐药性和/或敏感性。因此，本发明的方法可用于，例如，确定是否用N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物对个体进行治疗；是否用更积极的剂量方案的N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物对个体进行治疗；或者是否用组合疗法对个体进行治疗，所述组合疗法即酪氨酸激酶抑制剂如N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，与其他BCR-ABL抑制剂(例如伊马替尼、AMN107、PD180970、GGP76030、AP23464、SKI 606、NS-187和/或AZD0530)的组合；N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物与微管蛋白稳定剂(例如紫杉醇、埃坡霉素、紫杉烷等)的组合；N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物与法尼基转移酶抑制剂的组合；N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺与其它蛋白酪氨酸激酶抑制剂的组合；N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺与ATP非竞争性抑制剂ONO 12380的组合；N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺与极光激酶(Aurora kinase)抑制剂VX-680的组合；N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺与p38MAP激酶抑制剂BIRB-796的组合；以及任何其他在本文中公开的组合。
本文中使用的术语“治疗”和“疗法”是指治愈性疗法、防病性(prophylactic)疗法、预防性(preventive)疗法、或减缓疾病性(mitigating disease)疗法。
在一些实施方案中，本发明提供了一种方法，用于鉴定患者是否被预测对蛋白酪氨酸激酶活性的抑制(例如N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺对BCR-ABL激酶活性的抑制)具有耐性，该方法包括确定患者或组织样品或哺乳动物细胞中的一个或多个预测子多核苷酸的表达水平。哺乳动物细胞可以是人癌细胞。人癌细胞可以是从患有BCR-ABL相关疾患的受治患者获得的。
用于本文时，BCR-ABL抑制剂是指任何能够部分地抑制BCR-ABL或突变体BCR-ABL活性或表达的分子或化合物。它们包括Src家族激酶的抑制剂，例如BCR/ABL，ABL，c-Src，SRC/ABL的抑制剂，和其他形式包括但不限于JAK，FAK，FPS，CSK，SYK，和BTK的抑制剂。已经鉴定了一系列基于2-苯氨嘧啶族(phenylaminopyrimidines)药效团的抑制剂，它们对Ab1具有异常高的亲和力和特异性(见例如Zimmerman等，Bioorg，Med.Chem.Lett.，7187(1997))。所有这些抑制剂均被术语“BCR-ABL抑制剂”所涵盖。其中一种抑制剂，伊马替尼(imatinib)，也称作STI-571(以前称作Novartis测试化合物CGP 57148，也称作

)，已经在临床试验中作为CML的治疗剂测试成功。AMN107是另一种BCR-ABL激酶抑制剂，其被设计为吻合到BCR-ABL蛋白的ATP结合位点，其亲和力比伊马替尼更高。除了对野生型BCR-ABL具有比伊马替尼更高的效力(IC50＜30nM)之外，AMN107对32/33例伊马替尼耐药性BCR-ABL突变体也具有显著的活性。在临床前研究中，AMN107已经在体外和体内显示对野生型和伊马替尼耐药性BCR-ABL表达细胞具有活性。在I/II期临床试验中，AMN107在最初不应答伊马替尼或产生了伊马替尼耐药性的CML患者体内产生了血液学和细胞遗传学应答(Weisberg等，British Journal of Cancer，941765-1769(2006))，在此通过提述纳入其全部内容用于所有目的)。SKI-606，NS-187，AZD0530，PD180970，CGP76030，和AP23464都是可以用于本方法的激酶抑制剂的实例。SKI-606是Abl的4-苯胺-3-氰基喹啉抑制剂，已证实对CML细胞具有强力的抗增殖活性(Golas等，Cancer Research，63375-381(2003))。AZD0530是一种双重Abl/Src激酶抑制剂，对其正在进行治疗实体瘤和白血病的临床试验(Green等，Preclinical Activity of AZD0530，a novel，oral，potent，and selective inhibitor of the Src family kinases.2004年9月28日在瑞士日内瓦举行的EORTC-NCI-AACR中提供的海报3161)。PD180970是一种吡啶并[2，3-d]嘧啶衍生物，已显示其可以在表达BCR-ABL的白血病细胞中抑制BCR-ABL并诱导细胞凋亡(Rosee等，Cancer Research，627149-7153(2002))。CGP76030是双特异性Src和Abl激酶抑制剂，已显示其可抑制表达伊马替尼耐药性BCR-ABL激酶的细胞的生长和存活(Warmuth等，Blood，101(2)664-672(2003))。AP23464是基于ATP的激酶抑制剂，已经显示其可以抑制伊马替尼耐药性BCR-ABL突变体(O’Hare等，Clin.Cancer Res.，11(19)6987-6993(2005))。NS-187是选择性双Bcr-Abl/Lyn酪氨酸激酶抑制剂，已显示可以抑制伊马替尼耐药性BCR-ABL突变体(Kimura等，Blood，106(12)3948-3954(2005))。
可以根据患者或样品或细胞是否被预计对蛋白酪氨酸激酶抑制剂(包括BMS-A)具有耐药性来建立治疗方案。例如，本发明包括对来自可能患有或者正在经受某种通常用激酶抑制剂治疗的疾患(包括BCR-ABL相关疾患)的患者的细胞进行筛选。这类疾患包括骨髓性白血病或与之相关的疾病，或者在本文中描述的癌症。用本领域已知的方法对个体的细胞进行筛选，测量多核苷酸或多肽的表达水平。
本文中使用的术语“大约”，在指示预测性生物标志多核苷酸和/或多肽的增加的表达水平时，是指生物标志相对于标准水平的正常表达水平，或者是指比标准水平提高至少0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5，10倍或者更高的表达水平。
本文中使用的术语“大约”，在指示预测性生物标志多核苷酸和/或多肽的降低的表达水平时，是指比标准水平降低至少0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5，10倍或者更低的表达水平。
如果患者、样品或细胞被预测对蛋白酪氨酸激酶抑制剂具有耐药性，则可以适当地创建治疗方案。例如，与标准相比，样品中CK5(KRT5)，PLAU和/或EphA2的表达水平降低或者AR和/或PSA的表达水平提高，则可能表明个体中的细胞对激酶抑制剂如N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺的治疗是至少部分耐药的或者预期会成为至少部分耐药的。如本文公开的，在这样的情况下，治疗可以包括使用更高给药频率或更高剂量的N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺或其盐、水合物或溶剂化物；N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺或其在药学上可以接受的盐、水合物或溶剂化物与其他激酶抑制剂药物如伊马替尼、AMNl07、PD180970、GGP76030、AP23464、SKI 606和/或AZD0530的组合；N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺与微管蛋白稳定剂(例如紫杉醇、埃坡霉素(epothilone)、紫杉烷(taxane)等)的组合；N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺与法基尼转移酶抑制剂的组合；本文公开的任何其他组合；和本文公开的任意其他包含N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺的组合或给药方案。在一个方面，N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺的水平可以比对特定适应证或个人而言的典型N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺剂量多大约10，20，30，40，50，60，70，80，90或95％，或者是较特定适应证或个人的典型N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺剂量的大约1.5x，2x，2.5x，3x，3.5x，4x，4.5x，5x，6x，7x，8x，9x或10x多的N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺。
治疗有效量的N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺或其在药学上可以接受的盐、水合物或溶剂化物可以作为N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺的酸式盐口服给药。所用的实际剂量可以根据患者的要求和所治疗病症的严重程度加以改变。用于特殊情况的合适剂量的确定是本领域技术范围之内的。N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺或其在药学上可以接受的盐、水合物或溶剂化物(和化合物I盐)的有效量可以由本领域的普通技术人员来确定，其包括用于成年人的示例剂量，每天大约0.05-大约100mg/kg体重的N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺或其在药学上可以接受的盐、水合物或溶剂化物，其可以单剂给药也可以以个别分割的剂量的形式给药，例如每天1、2、3或4次。在特定实施方案中，N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺或其在药学上可以接受的盐、水合物或溶剂化物每天给药2次，每次70mg。或者，可以每天一次给药例如50，70，90，100，110或120BID，或者100，140或180。应当理解，对任何特定对象的特定剂量水平和给药频率是可以改变的，并将依赖于多种因素，包括所用的具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时长、对象的物种、年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、给药的模式和时间、排泄速度、药物组合、和特定病症的严重程度。优选的治疗对象包括患有蛋白酪氨酸激酶相关疾患的动物，最优选的是哺乳动物例如人，和家养动物，例如狗、猫等。对于化合物II或化合物I和II的任意组合或者本文公开的任意组合也是如此。
本文公开了一种用于确定罹患蛋白酪氨酸激酶相关疾患的个体对激酶抑制剂组合，例如N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺和伊马替尼，的应答性的方法。例如，根据突变体BCR-ABL激酶的存在，可以确定个体是特定激酶抑制剂的阳性应答者(或来自所述个体的细胞预期可对所述抑制剂具有一定程度的敏感性)。如本文公开的，在样品中显示CK5(KRT5)，PLAU和/或EphA2的表达水平比标准降低或者AR和/或PSA的表达水平比标准升高的细胞，可能对N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺或其在药学上可以接受的盐、水合物或溶剂化物产生至少部分的耐药性。因此，若患有蛋白酪氨酸激酶相关疾患的个体的细胞显示这种特征以及本文公开的其他特征，则该个体是，或者预期会是对N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺或其在药学上可以接受的盐、水合物或溶剂化物的特定治疗方案的部分阴性应答者，但却是对更积极的N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺或其在药学上可以接受的盐、水合物或溶剂化物的治疗方案的阳性应答者，或者是对N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺或其在药学上可以接受的盐、水合物或溶剂化物与伊马替尼或其他疗法构成的组合疗法的阳性应答者。
治疗方案是对罹患蛋白酪氨酸激酶相关疾患的个体施加的治疗过程，可以包括用一种或多种激酶抑制剂以及其他疗法，例如放射和/或其他药剂(即组合疗法)，进行治疗。当使用多于一种疗法时，这些疗法可以同时地或者连续施加(例如，多于一种的激酶抑制剂可以在不同的方案中可以一起给药或者根据不同的时间表在不同时间给药)。多于一种疗法可以在不同时间施加(即连续地)，而仍然是同一治疗方案的一部分。如本文公开的，例如，可能会发现来自患有蛋白激酶相关疾患的个体的细胞对N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺产生至少部分的耐药性。根据本发明的发现，即这些细胞可能对N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺或其在药学上可以接受的盐、水合物或溶剂化物的组合疗法或更积极的剂量或定量给药方案敏感，可以建立这样治疗方案，其包括用该组合进行治疗，该组合可以作为单一疗法，或者与其他激酶抑制剂组合，或者与本文公开的其他药剂组合。此外，该组合可以与放射或其他已知的治疗一起施加。
因此，本发明包括一种方法，用于为患有蛋白酪氨酸激酶相关疾患的个体建立治疗方案，或者对受蛋白酪氨酸激酶疾病困扰的个体进行治疗，该方法包括确定从个体获得的生物样品是否被预测为对蛋白酪氨酸激酶抑制剂，包括BMS-A，具有耐药性，并根据是否存在突变向对象施加合适的治疗方案。该确定可以用本领域已知的任何方法实现，例如，通过测量本发明的至少一种预测子多核苷酸或多肽的表达水平。
在实施本发明的多个方面时，生物样品可以从多种来源选择，例如活检物(包括细胞样品或从其培养的细胞；骨髓或实体组织的活检物，例如来自实体瘤的细胞)、血液、血细胞(红细胞或白细胞)、血清、血浆、淋巴、腹水、囊液(cystic fluid)、尿、痰、大便、唾液、支气管抽取液、CSF或毛发。可以使用来自样品的细胞，或者可以使用细胞样品的裂解物。在某些实施方案中，生物样品是组织活检细胞样品或者从其培养的细胞，例如从实体瘤移出的细胞或者细胞样品的裂解物。在某些实施方案中，生物样品包括血细胞。
用于本发明的药物组合物可以包括如下的组合物，其包括可以实现预期目的之有效量的一种BCR-ABL激酶抑制剂或BCR-ABL激酶抑制剂的组合。本发明药物组合物有效剂量的确定完全在本领域技术人员的能力范围之内。有效治疗剂量是指可以减轻症状或状况的活性成分的量。治疗效力和毒性可以按照标准药学程序在细胞培养物或实验动物中确定，例如ED50(对群体的50％治疗上有效的剂量)和LD50(对群体的50％致死的剂量)。
可用于实施本发明的涉及N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺的剂量方案在如下文献中有描述2003年3月24日提出申请的美国专利系列号10/395,503；和Blood2004年104卷摘要20(ASH年会摘要)，″Hematologic and CytogeneticResponses in imatinib-Resistant Accelerated and Blast Phase Chronic MyeloidLeukemia(CML)Patients Treated with the Dual SRC/ABL Kinase InhibitorN-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazolecarboxamideResults from a Phase I DoseEscalation Study.″，作者为Moshe Talpaz等；在此通过提述引用其全部内容用于所有目的。
BCR-ABL抑制剂的“治疗有效量”可以是患者、样品或细胞是否被预测对蛋白酪氨酸激酶抑制剂具有耐药性的函数。例如，如果预测患者、样品或细胞对某种蛋白酪氨酸激酶抑制剂具有耐药性，就可能有理由提高所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂的剂量，或者有理由使用更积极的定量给药方案，例如提高定量给药频率，或者有理由将所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂与其它本文描述的药剂组合给药，或者有理由将提高剂量、增加给药频率、和/或与其它药剂组合等手段任意组合加以使用。本领域的技术人员会理解BCR-ABL激酶细胞的敏感性差异并相应确定治疗有效剂量。
基于BCR-ABL激酶与野生型BCR-ABL激酶相比对N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺的敏感性，N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺的可能合理的预期治疗有效剂量的实例，可以用各种体外生化测定(包括表达特征谱分析、细胞增殖、BCR-ABL酪氨酸磷酸化、肽底物磷酸化、和/或自身磷酸化)来加以确定。例如，N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺的近似有效治疗剂量，可以根据用典型剂量乘以在上述任何一项或多项测定中患者样品对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂的敏感性的倍数改变加以计算。例如，如果发现一个样品比敏感性细胞或组织样品的耐药性高2倍，则施加大约高2倍水平的所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂可能是合理的。因此，对任何已发现对蛋白酪氨酸激酶抑制剂至少部分耐药的样品，N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺的治疗上有意义的剂量可以比处方或典型剂量高例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，125，150，175，200，225，250或300倍。或者，N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺的治疗上有意义的剂量也可以是处方剂量例如0.9x，0.8x，0.7x，0.6x，0.5x，0.4x，0.3x，0.2x，0.1x，0.09x，0.08x，0.07x，0.06x，0.05x，0.04x，0.03x，0.02x或0.01x。
根据本发明，调整对剂量方案以提供最佳的期望应答(例如治疗性应答)。例如，可以施加单次推注，在一段时间内施加数个分割的剂量，或者，视治疗状况的迫切性的需要，剂量可以按比例减少或增加。本发明药物组合物中活性成分的实际剂量可以改变，以便获得活性成分这样的量其可以有效地为特定的患者、组合物和给药方式的实现期望的治疗应答，而对患者无毒。所选的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所用的具体的本发明组合物或者其酯、盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，所用具体化合物的排泄速度，治疗的持续时间，与所用具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗的患者的年龄、性别、体重、状态、一般健康情况和先前用药历史，和类似的因素。见例如最新的Remington(Remington′s Pharmaceutical Science，Mack Publishing Company，Easton，PA)。
与BMS-A敏感性相关的标志的鉴定 在本研究中，我们的目的是鉴定能够潜在帮助临床开发BMS-A用于前列腺癌治疗的预测和替代生物标志。如图1A所概述的，我们的策略是首先鉴定基线表达水平与药物敏感性相关，且通过(pass)了附加变量要求(additional variation requirement)的基因，以获得候选预测标志的列表。然后在药物处理研究中鉴定表达受BMS-A调节的基因，并将它们与候选预测生物标志列表进行比较，获得不仅与药物敏感性相关而且受药物处理调节的基因列表。
确定了16个前列腺细胞系对BMS-A的IC50值，如图1B所示。根据IC50，将细胞系分成两组11个细胞系的IC50低于200nM，指定为敏感组，5个细胞系的IC50至少大于2μM，被看作耐药组。这两个组的分离相当良好，且敏感性/耐药性划分限200nM处于接受接近最大耐受剂量的剂量治疗的患者中BMS-A血浆浓度的峰值范围内。
用

基因芯片对16个细胞系的基线基因表达进行特征谱分析。进行两种统计检验(单向(1-way)ANOVA和log2IC50值关联分析)，以分别鉴定在敏感和耐药组之间有差异表达的基因(p＜0.05的5961个探针系列)，以及与IC50高度相关的基因(p＜0.05的4575个探针系列)。总共4248个探针系列在这两种分析中有重叠，表明敏感和耐药组的分类良好地反映了细胞对BMS-A的敏感性(IC50)。以在所有样品中CV为10％并且在敏感和耐药组之间的表达至少相差3倍作为必要条件对它们进一步过滤，结果选出了213个探针系列。进一步除去表达序列标签(EST)和重复的(duplicate)探针系列，生成了174个基因的候选预测标志列表(表2)。
利用聚类分析使174个基因在16个细胞系中的表达模式可视化。如图1C所示，这16个细胞系被分成2个大组，对BMS-A敏感的细胞系被突出显示。有趣的是，左边集群中的细胞系都对BMS-A敏感；右边集群中，虽然相对靠近于耐药性细胞系聚集，但是DU145、PC3和LNCaP细胞也对BMS-A高度敏感。DU145和PC3可能进一步代表一个与右边集群中的其余细胞截然不同的小亚群。在这174个基因中，～70％(124/174)在敏感细胞系中的表达高于在耐药细胞系中的表达，而～30％(50/174)的基因在耐药性细胞系中的表达更高。
表2中存在许多有趣的基因。例如，双调蛋白(amphiregulin)和上皮调节蛋白是EGF-EGFR途径中的成分；TGFα、TGFβ2和TGFβRII是转化生长因子途径基因；还有其他受体酪氨酸激酶例如met原癌基因和成纤维细胞生长因子受体2。这些基因在敏感细胞系中表达更高。最引人注意的是，几种重要的前列腺细胞标志例如激肽释放酶3(KLK3或前列腺特异抗原，PSA)和雄激素受体(AR)在耐药性细胞系中过表达，而细胞角蛋白5(CK5/KRT5)在敏感细胞系中高表达，如图1C所标明的。
图1D中进一步了显示CK5、PSA和AR在这16个细胞系中的相对表达水平。很明显，耐药细胞系均表达极低水平的CK5，而敏感细胞系均表达高水平的CK5，除了DU145，PC3和LNCaP细胞之外(见图1C)。因为CK5是前列腺细胞谱系的基底细胞型(basal cell type for the prostatic cell lineage)的标志，该数据提示，呈现基底表型的细胞对BMS-A敏感，而表达低水平CK5的细胞趋向于耐药。两种腔内(luminal)细胞标志PSA和AR的表达模式互补地支持了上述观察结果。PSA和AR的更高表达与药物敏感性相关，而这两个基因的低表达与BMS-A敏感性高度相关。LNCaP细胞系是唯一与此观察结果不符的，该细胞系对BMS-A敏感却表达高水平的PSA和AR。
亦被BMS-A处理调节的标志的鉴定 用BMS-A处理了5个BMS-A敏感细胞系，包括两个表达CK5的细胞系PWR1E和RWPE2，和三个不表达CK5的细胞系PC3、DU145和LNCaP。用配对t-检验比较用BMS-A和模拟处理的相同细胞系之间的基因表达特征谱，结果显示1628个探针系列显著受到药物处理的调节(p＜0.05)。将这1628个探针系列与候选预测标志列表(表2)进行比较，表明有10个基因同时出现在这两个列表中。这10个基因可能用于预测对BMS-A的敏感性并用作药物应答的替代物(surrogates)，将它们在表2的第三列中标示为“降低”。有趣的是，所有这10个基因都在敏感细胞系中高表达，而在BMS-A处理后表达下降。这些基因包括上皮调节蛋白，EGF-EGFR途径中的一个组分，FHL2和AXL激酶，和纤维蛋白溶酶原激活因子尿激酶(PLAU)。这10个基因中的3个，LAMC2，EREG和PLAU，编码分泌于细胞外基质的蛋白。该基因系列可能代表这样的基因，它们的表达受BMS-A的靶基因的调节。
在前列腺和乳腺临床前研究中鉴定的共通生物标志 为了便于BMS-A用于乳腺癌的临床开发，本实验室进行了一项类似的临床前生物标志研究(5)。鉴定了可预测乳腺细胞系对BMS-A敏感性的生物标志，并且目前正在临床试验中对它们进行评估。因为大部分乳腺肿瘤也是上皮来源的，所以我们比较了在当前前列腺癌研究中发现的生物标志与在所述乳腺癌研究中鉴定的那些生物标志。为此目的，除了前述的174个基因之外，我们还引入了(在10％CV步骤之后，但在进行变化倍数＞3过滤步骤之前)所述1475个探针系列的列表中显著受到BMS-A的调节、即存在于所述1628个探针的列表中的探针系列，作为候选前列腺生物标志，并将它们与161个基因的乳腺癌生物标志列表进行了比较(5)。确定了14个基因是两种组织类型的共通生物标志(表3)。值得注意的是，BMS-A的一个靶标——EphA2，在前列腺和乳腺癌细胞系中均与BMS-A敏感性显著相关。如表3所示，EphA2在敏感细胞系中的平均表达显著高于在耐药细胞系中的表达(2.69倍，t-检验中的p＝0.005)。
如图2A所示，根据微阵列基线特征谱分析的检测结果，EphA2的表达水平与前列腺细胞系的IC50值相关(EphA2表达越高，IC50越低或者敏感性越高，Pearson相关系数＝-0.66)。作为验证，我们还进行了Western印迹分析以检查EphA2蛋白在5种敏感性和3种耐药性细胞系中的表达(图2B)。总的来说，具有高水平EphA2mRNA的细胞系表达相对高水平的EphA2蛋白，表明EphA2的基因和蛋白表达之间有良好的一致性。我们对PC3，DU145和LNCaP细胞中EphA2蛋白的Western印迹结果与先前的报道一致(15)。由于EphA2在这些细胞系中的表达与BMS-A敏感性具有相关性，并且是药物的靶标，EphA2似乎是前列腺癌中BMS-A的一个强候选生物标志。
uPA表达受BMS-A下调 因为PLAU基因编码一种受Src调节的分泌型蛋白uPA(16)，我们进一步评估了PLAU基因的表达和BMS-A对其的调节。如图3A所示(以及表2)，PLAU基因在敏感细胞系中的表达水平显著高于在耐药细胞系中的表达水平。另一个PLAU探针系列也显示了相似的表达模式。此外，PLAU功能上的伙伴——PLAU受体的3个探针系列在这些细胞系中也显示出与PLAU相似的表达模式(数据未显示)。这些结果与在乳腺癌细胞系中PLAU的表达与BMS-A敏感性的相关性(5)一道强烈地暗示PLAU的表达，可能还有其功能的调节，与细胞对BMS-A的敏感性高度相关。
观察到了PLAU mRNA的表达被达沙替尼下调(表3B)。与PLAU表达在两种CK5表达细胞(PWR1E和RWPE2)中的相对温和的下降相比，在PC3和DU145细胞中的减少则强烈得多(大约50％)。PLAU表达水平低得多的LNCaP细胞也显示了减少。当我们将同样的药物处理研究延伸到另外3种耐药性细胞系22Rv、VCaP和MDAPCa2b时，有趣地发现，如图3C所示，PLAU被BMS-A降低的幅度与细胞对BMS-A的敏感性良好地相关(r＝0.72)，最大的降低出现在最敏感的细胞系中。这表明PLAU是一个潜在的BMS-A生物学效应替代生物标志。而且，在一项使用PC细胞的多剂量处理研究中，我们发现未处理对照相比，在所有剂量下PLAU mRNA水平被达沙替尼降低的程度在4h是都最小的，但在24h则呈剂量依赖方式急剧变化(图3D)。
在蛋白水平上也见到了PLAU的表达受BMS-A的下调。借助ELISA测定，我们在一项时间过程实验(time course experiment)中发现PC3细胞向培养基中分泌的uPA蛋白的量被BMS-A处理所降低，并且被分泌的uPA蛋白水平减少的程度是剂量依赖性的，如使用24h数据的图3E所示。作为对照，在使用细胞毒试剂

时，我们没有发现被分泌的uPA蛋白水平有剂量依赖的降低，表明BMS-A特异性地下调PLAU的表达。
在BMS-A前列腺癌试验中对患者分层(stratification)的理论根据 根据它们的差异表达，我们详细论述了CK5，PSA，AR可以作为预测性生物标志，用于鉴定可以对BMS-A作出应答的前列腺癌细胞或肿瘤亚型。我们还详细论述了PLAU和EphA2可能可以用作替代标志，用于监视BMS-A应答，因为它们与药物敏感性相关，并与药物作用机制有联系。这5个基因在16种细胞系中的表达模式如图4A所示。5个BMS-A耐药细胞系WPMY1，MDAPCa2b，22Rv，VCaP和DUCaP均表达高水平的AR、PSA和低水平的CK5(KRT5)，PLAU和EphA2。对比地，敏感细胞系表达低水平的AR和PSA(除了LNCaP之外)和高水平的PLAU、EphA2和/或CK5。
使用先前已公开的包含52个肿瘤样品的前列腺肿瘤数据(17)对这5个基因表达的动态范围(dynamic range)和呈现BMS-A应答表达模式的近似患者群体(approximate patient population)进行了检查。如图4B中的聚类分析所示，接近44％(23/52，样品ID用红色标记)的患者群体显示BMS-A应答性表达模式，即低AR和PSA及高PLAU、EphA2和/或CK5。在其余～56％的患者中，AR和PSA的表达一致地相对较高，而PLAU和EphA2的表达相对较低。在这些数据系列中，AR和CK5不但有互斥性表达，还有一定程度的共表达，这让人联想到这两个基因在正常前列腺上皮的基底、中间和腔内细胞中的表达模式(18，19)。AR和CK5的共表达也可以另外解释为在所收集的样品中同时存在正常或患病的两种类型上皮细胞(这反映了前列腺肿瘤和/或样品的异质性)的结果。我们的数据提示，从临床前模型中鉴定的5种生物标志可能帮助人们基于表达模式来鉴定患者群体。这种基因表达模式可能可用于临床试验的患者分层。
讨论 对于临床开发药物的生物标志的鉴定而言，理想的情境是使用从正在接受特定治疗的患者获得的样品，并在患者应答数据的背景下分析基因表达数据。因为BMS-A是一种正在进行早期开发的新药，使用临床前模式鉴定潜在生物标志来帮助临床开发似乎是最佳的选择。在本研究中，我们使用了16种前列腺细胞系来鉴定与细胞的敏感性和药物作用的机制相关的生物标志。这些生物标志可能可以用于预测和监视BMS-A的应答。具体地，我们鉴定了5个基因，包括AR，PSA，CK5，PLAU和EphA2，它们与药物敏感性/耐药性高度相关，和/或受药物处理的调节。与乳腺癌一样，表达低水平AR和PSA和高水平CK5，或者具有基底型基因表达模式的前列腺癌，似乎与BMS-A应答相关。PLAU和EphA2的高表达水平也可有助于定义潜在的BMS-A应答者。此外，发现PLAU的表达受到BMS-A的特异性调节，这种调节与细胞对BMS-A的敏感性高度相关，提示PLAU的表达可能可以用作跟踪药物作用的替代标志。
在我们的数据分析中，我们使用了这样的方法，其同时强调统计的显著度和在亚组之间高倍数差异的基因表达。由于我们只有16个细胞系，这个集合可能不够大到足以在统计分析中获得严格的p值截止(cutoff)，所以我们纳入了其他要求，包括10％的变异系数和在两组间有3倍的表达变化等严格的过滤条件。值得注意地，我们所采用的方法与最近的一篇公开出版物(其来源于由美国食品和药品管理局牵头的MicroArray Quality Control项目)中报道的方法基本上一致，该文显示，按照倍数变化分级、并经过非严格但统计上显著的检验法过滤的基因列表，与用其他统计策略产生的列表相比，在不同平台间的可重复性更大(20)。我们所得的结果具有生物学意义，因为我们鉴定了反映正常和/或发病前列腺生物学的BMS-A敏感性细胞亚型，以及反映BMS-A靶标功能的基因。此外，在乳腺癌研究中也观察到了许多已鉴定的生物标志(7)。
在正常前列腺上皮中，存在两种主要的上皮细胞类型，基底上皮细胞和腔内上皮细胞。近年来的研究提示，上皮细胞可能可以进一步划分成不同亚型，这些亚型在功能上更加特化，并且可能处于细胞分化过程的不同阶段。这些亚型包括前列腺干细胞、传递放大细胞(transit amplifying cell)、中间细胞和分泌型腔内细胞(secretary luminal cell)，可以根据它们对特定细胞标志的表达模式来区分它们。我们的研究发现，具有低AR、PSA表达和高CK5表达的细胞代表了一个对BMS-A敏感的亚群。这种表达模式与位于基底区室内、可能是前列腺干细胞和传递放大细胞的上皮细胞所具有的表达模式一致。由于这两种类型的细胞能够自我更新并快速增殖而产生新的或更分化的细胞，这种一致性可能提示BMS-A靶标(包括Src和其他Src家族成员例如LYN)的表达和功能与这些细胞的增殖有内在关系(8)。事实上，发现LYN在基底层中的表达高于在腔内层中的表达，并且在肿瘤中，LYN往往在分化较低的区域内更高(21)。
相比于与已经获得确立和验证，并已经在临床中用于辅助患者分层(22，23)的乳腺癌亚型分类，采用全基因组特征谱分析的前列腺癌分子分类虽已有探索(24)，但缺少用独立的肿瘤群体进行验证。这可能无疑是部分地由于前列腺肿瘤的异质性和难以从前列腺癌患者获得活检造成的。尚待确定的是，被鉴定的前列腺癌的分子亚型对正常前列腺上皮中所见的上皮亚型的模拟，是否能够达到在乳腺癌中见到的那种程度(22，23)。根据我们对Singh等(17)公开的的数据系列的分析，似乎存在表达较低水平的AR。PSA和较高水平的CK5(即模拟基底型)的亚型，以及具有相反表达模式(即模拟腔内型)的亚型。前列腺细胞系如MDAPCa2b，VCaP，DUCaP和LNCaP的获得，也清楚地证实腔内型前列腺癌的存在。PC3和DU145中PSA/AR以及CK5的低表达水平也提示存在除腔内亚型和基底亚型之外的亚型。需要注意，在我们的研究中见到的高表达CK5和低表达AR和PSA的亚型主要是基于永生化的前列腺细胞系。然而，最近一项研究显示，在表达AR的LAPC-4/LAPC-9人癌症异种移植模型和PC3或DU145癌细胞群体中，均同时存在具有不同分化程度的亚细胞群体。表达另一种基底细胞标志CD44(25)的亚群显示最高的致瘤性(26)。这些强烈提示，在前列腺肿瘤中存在一种具有正常基底细胞表型的细胞亚型，该亚型可能在肿瘤恶性的确定中发挥主要作用。随着对更多的肿瘤样品进行特征谱分析(理想的是在同一平台上)以及能够改进样品获取、处理和/或信号放大的技术的进步，前列腺肿瘤的分子亚型分类将得到更好的理解，并可以最终帮助向患者输送个性化药物。
我们在研究中发现，LNCaP细胞(一种雄激素敏感的前列腺细胞系)显示的对BMS-A的敏感性与包括22Rv、MDAPCa2b、VCaP和DuCaP在内的其他对雄激素敏感的细胞截然不同。在转录上，这5个细胞系在AR/PSA的表达、174个已鉴定基因的表达以及总体基因表达方面彼此类似(图1C，其他数据未显示)。还不清楚LNCaP细胞产生了什么机制而导致BMS-A易感性。AR基因突变可能是一个引人注目的机制，但不一定是直接机制，因为LNCaP细胞具有一个T877A突变，而其他细胞或者没有突变(VCaP和DuCaP)，或者具有其他类型(22Rv，H874Y)或更多类型的突变(MDAPCa2b，L701H和T877A)(27)。AR表达或序列的改变可能在下述方面影响AR的功能与雄激素的结合(28)或与生长因子和受体途径的串话(crosstalk)，例如AR通过信号级联被磷酸化(29)。BMS-A对生长因子和受体途径的抑制还可以诱导细胞重新建立AR的信号网络平衡和调节AR的作用模式。还有可能的是，BMS-A的一个或多个靶标的功能是LNCaP细胞生长不可缺少的。
通过鉴定表达受药物处理而改变的基因，我们发现了一系列可能与BMS-A的作用机制相关的基因。这在两个方面对药物开发是理想的。首先，尽管基于不同基因表达的预测子之间的一致性已经在乳腺癌中得到确认(30)，但是在具体药物的临床试验中使用生物标志时，与作用机制相关的标志可以提高置信度水平。其次，通过敏感的分子测试获得的药物功效的知识有助于防止由于在患者人数少的早期试验中病理应答低而过早地中断临床研究。尤其是尽管BMS-A抑制细胞粘着、迁移和侵袭的效力强，但它似乎是抑细胞生长性(cytostatic)而非细胞毒性(cytotoxic)的。因此，在早期试验中，敏感的替代标志对于评估药物效力具有关键意义。在我们的研究中，我们发现uPA，Src激酶的一种下游靶标，受到BMS-A的显著调节，并且这种下调特异性地被BMS-A，而非其他细胞毒剂如

所导致。此外，药物诱导的uPA减少的幅度与细胞系对BMS-A的敏感性相关性非常好，敏感细胞系中减少较多，而耐药细胞系中则很少或者没有变化。这些数据提示，uPA可能可以用作监视BMS-A效果的替代生物标志。更令人兴奋的是，uPA已经在大量研究中被证实在前列腺肿瘤发生中发挥重要作用。例如，它在高级别前列腺肿瘤和转移中高表达(31)，当肿瘤向雄激素不依赖性进展时，uPA的表达水平会提高(32)。在临床上，已证明uPA或uPA受体密度的提高与较差的前列腺癌生存率相关(33)，并且其作为诊断标志的价值已经在乳腺癌中得到确立(34，35)。
BMS-A是一种针对数种细胞质或受体酪氨酸激酶的强力抑制剂。已经有报道其在前列腺癌细胞系中抑制Src激酶中的作用通过黏着斑激酶途径抑制细胞粘着、迁移和侵袭(36)。有趣的是，EphA2，另一种酶IC50处于纳摩尔范围的BMS-A靶标(5)，也与前列腺癌进程相关(15)。除了其与细胞对BMS-A的敏感性的相关性之外，EphA2还在前列腺细胞(数据未显示)和乳腺癌细胞系(5)中受BMS-A下调。而且，EphA2可能也在Src激酶的下游起作用，因为siRNA抑制Src可降低EphA2的表达(5)。EphA2在前列腺肿瘤发生中的确切作用，以及EphA2的活性抑制对BMS-A诱导的细胞生长抑制的贡献，还需要进一步的确认。
在候选的预测生物标志基因列表中，有若干基因是对细胞生存和增殖重要的信号途径(例如EGF-EGFR，TGF-TGFR，FGFR和Met途径)的成员。作为一种胞内酪氨酸激酶，Src可以作为这些受体酪氨酸激酶下游的信号传导子(8，9，37)。或者，Src激酶可能独立于一种或多种途径发挥作用。尽管在前列腺癌中这些途径与Src介导的途径之间的协作或串话的机制还不很清楚，但这些途径仍然可以作为用于组合治疗以实现加和或协同效果的候选靶途径。这个假说应当得到检验，并可能为将来的临床开发策略提供有益见解。
高度相关的多核苷酸用于预测的用处 可以利用与某生物系统的特定性质相关的多核苷酸作出有关该生物系统和其他生物系统的预测。可使用Genecluster软件或者其他程序，通过“加权表决交叉验证算法”(weighted-voting cross-validation algorithm)(T.R.Golub等，Science，286531-537(1999))选择能够用来预测性质的多核苷酸和多核苷酸组合。具体地，利用Genecluster软件构建了预测子，这些预测子演示了与药物敏感性和耐药性相关的多核苷酸的用处。如本文中使用的，术语“预测子”或“预测子系列”作为如下使用预测子或预测子系列是指这样的单个基因，或者多核苷酸组合其表达模式或性质可以用来以不同的误差率(error rate)预测任何给定生物系统的性质或特性。
使用一种“加权表决交叉验证算法”对多核苷酸表达模式预测耐药性/敏感性分类的能力了进行进一步的研究，上述算法使用如T.R.Golub等，Science，286531-537(1999)所述的留一交叉验证策略(leave one outcross-validation strategy)。该程序被设计成选择最佳数目的这样的多核苷酸可以利用所述多核苷酸的表达模式，以最佳的准确度来预测某个细胞系基于针对给定蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物(例如BMS-A)的耐药性或敏感性的分类。本文描述了对该程序交叉验证策略的简单说明。
因此，根据本发明，已经开发了一种方法，其中发现了多核苷酸和多核苷酸的组合，所述多核苷酸和多核苷酸的组合表达模式在一部分细胞系中与对抑制蛋白酪氨酸激酶的化合物的处理的应答相关，并可用作所述应答的预测子。
用于演示效用的预测子系列、误差率和算法 在任何给定的预测子或预测子系列中，多核苷酸的数目可以影响预测子系列在交叉验证实验中以及其他数学算法的误差率。数据显示，预测子的误差率在一定程度上取决于预测子系列中多核苷酸的数目、在给定预测子系列中每一个单独的多核苷酸的贡献、以及交叉验证实验中测试的细胞系的数目。例如，在一个给定的预测子系列中，一个多核苷酸对预测的贡献可能比其他多核苷酸更显著。
非常有可能的是，如果某种多核苷酸对某个预测子系列具有显著贡献，那么可以把它和其他多核苷酸组成不同的组合来使用，以便在不同预测子系列中获得不同的误差率。例如，单独的多核苷酸A可给出30％的误差率。在与多核苷酸B、C和D组合时，误差率变成10％；在与多核苷酸B、D和E组合时，误差率变成12％；而多核苷酸A与多核苷酸E-X的组合则可以给出8％的误差率，等等。如图5中演示的，预测子系列中多核苷酸的不同选择和组合可以在交叉验证试验中实现不同的误差率。
利用预测子系列对同一组织类型的测试数据进行预测 如本文描述的，176个多核苷酸(表2中列举的)在16个前列腺癌细胞系中被证实其表达水平与对蛋白酪氨酸激酶抑制剂BMS-A的敏感性相关。然后，在与用于鉴定这些多核苷酸的测试样品不同的测试样品中，对这176个多核苷酸(或者个别地，或者与一个或多个构成组合，或者以多核苷酸亚系列作为代表)预测细胞系对BMS-A的敏感性和/或耐药性的能力进行了评估。用这些测试样品进一步证明这176个多核苷酸、这些多核苷酸中一个或多个的组合、和/或预测子多核苷酸亚系列的准确地预测特定试验细胞系对BMS-A的敏感性或耐药性的能力。
根据表2中显示的标志的与蛋白酪氨酸激酶(特别是与信号传导途径有关的src家族激酶)相关的生物学功能，并根据其表达水平受BMS-A处理调节的变化，选出了如表5中列举的5种多核苷酸构成一个多核苷酸预测子系列，然后用于对前列腺细胞系测试样品进行敏感性预测。
多核苷酸预测子系列预测不同组织类型的测试数据的用处 如本文描述的，从前列腺癌细胞系中鉴定出了如表2中列举的多核苷酸。而且，如本文描述的结果所证明的，预测子多核苷酸能够准确地预测前列腺癌细胞系测试样品对暴露于BMS-A的敏感性和/或耐药性。然而，同样重要的是要证明这些预测子多核苷酸也能够预测来自非前列腺组织的其他组织类型的癌细胞系测试样品对暴露于BMS-A的敏感性和/或耐药性。
因此，根据本发明开发了一种策略，其中发现了这样的预测子多核苷酸和/或预测子多核苷酸的组合它们在一部分(a subset of)前列腺细胞系中的表达模式与对可抑制蛋白酪氨酸激酶功能的化合物的处理的应答相关，并可以用于预测同一组织类型(乳腺)以及不同组织类型(肺)等的其它样品。可以预期，这些预测子多核苷酸可用于预测其他组织类型(包括但不限于结肠和前列腺组织，特别是结肠癌和前列腺癌组织)的敏感性和/或耐药性。
预测子系列的应用 具有不同误差率的预测子系列可用于不同的应用。预测子系列可以从表2中列举的多核苷酸的任意组合来创建预测子系列，或者可以从在表2、3、4和5中分别显示的14、10和5个多核苷酸的预测子多核苷酸亚系列来创建预测子系列，用来预测蛋白酪氨酸激酶调节剂化合物(例如BMS-A)、蛋白酪氨酸激酶抑制剂、以在不同生物系统中影响蛋白酪氨酸激酶信号途径的化合物的可能效果。这里描述的各种预测子系列，或者这些预测子系列与其他多核苷酸或这些多核苷酸的其他共变量(co-variant)的组合，可具有广泛的用处。例如，预测子系列可以用作疾病管理中的诊断或预报指标；它们可用来预测癌症患者对可调节蛋白酪氨酸激酶家族(例如src酪氨酸激酶家族)的化合物的治疗干预如何应答；并且它们可用于预测患者对如下所述的治疗干预会如何应答所述治疗干预调节通过整个蛋白酪氨酸激酶调节途径(例如src酪氨酸激酶调节途径)进行的信号传导。
尽管本文描述的数据是在常规用于筛选和鉴定可能可以用于癌症治疗的化合物的细胞系中产生的，但是这些预测子在通过蛋白酪氨酸激酶或蛋白酪氨酸激酶途径的信号传导具有重要作用的其他疾病领域中，例如在免疫学中，或者在信号传导和/或增殖控制出错的癌症或肿瘤中，也具有诊断和预后价值。这些蛋白酪氨酸激酶及其途径包括，例如，Src酪氨酸激酶家族，例如Src，Fgr，Fyn，Yes，Blk，Hck，Lck和Lyn，以及其他蛋白酪氨酸激酶，包括Bcr-abl，Jak，PDGFR，c-kit和Eph受体。尽管本文描述的数据是使用具体例示的蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物——BMS-A产生的，但是我们也测试了BMS-A之外其它的三种蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物，并发现它们在被评估的23种乳腺细胞系中具有相似的敏感性和耐药性分类。因此，这些预测子对于其他抑制剂分子，以及对于任何影响蛋白酪氨酸激酶(例如Src酪氨酸激酶)或者蛋白酪氨酸激酶信号途径(例如Src酪氨酸激酶途径)的分子或治疗干预，也具有诊断和预后价值。
本领域的技术人员会理解，蛋白酪氨酸激酶途径，例如Src酪氨酸激酶途径，在除乳腺组织细胞系之外的细胞类型中也存在并发挥功能。因此，所描述的多核苷酸预测子系列或预测子系列中的多核苷酸的组合，可用于预测在来自与疾病状态相关的其他组织或器官的细胞或者从其他组织或器官类型产生的癌症或肿瘤中对可以与蛋白酪氨酸激酶活性相互作用或者抑制蛋白酪氨酸激酶活性的化合物的药物敏感性或耐药性。这些细胞、组织或器官的非限制性实例包括结肠、乳腺、肺、心脏、前列腺、睾丸、卵巢、子宫颈、食道、胰腺、脾、肝、肾、肠、胃、淋巴和脑，这样就为本文描述的预测子多核苷酸系列提供了广泛而有利的用途。用于分析的细胞可以通过本领域已知的常规程序获得，例如组织或器官的活检，抽吸(aspiration)，脱落的细胞，例如结肠细胞，临床或医学组织或细胞采样程序。
构成预测子系列的多核苷酸的功能性 预测子或预测子系列(例如预测子多核苷酸或者多核苷酸的预测子系列)使得人们有可能在获知有关生物学系统的任何信息之前对结果进行预测。从根本上说，预测子可以看作是一种工具，可以用来预测生物学系统分类所用的表型。在本发明提供的具体实施方案中，“耐药性”或“敏感性”的分类是根据每个细胞系对某种化合物(例如本文例示的蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物BMS-A)的IC50值。
作为一个具体的实例，已知有多种本文描述(表2)的多核苷酸是src酪氨酸激酶家族的底物，例如小窝蛋白-1和小窝蛋白-2(M.T.Brown and J.A.Cooper，Biochemica et Biophysica Acta，1287121-149(1996))。EphA2是一种酪氨酸激酶受体。本文提供的数据证明EphA2在敏感细胞系中高表达，其表达水平和活性被蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物BMS-A的处理所下调。这是预料之中的，因为对预测子的高准确度有贡献的多核苷酸很可能在被调节的途径中扮演功能性角色。例如，当Her2多核苷酸过表达时，表明需要进行

治疗(即可结合Her2受体并通过内化阻止其功能的抗体)。如果靶酶没有表达，则治疗方法不大可能具有治疗效果，虽然不是没有可能。
然而，尽管一些构成预测子系列的多核苷酸及其功能性产物(蛋白和mRNAs)的全部功能目前还不知道，但某些多核苷酸可能直接或间接参与了蛋白酪氨酸激酶信号途径，例如Src酪氨酸激酶信号途径。此外，预测子系列中的一些多核苷酸可能在对所测试化合物特异的代谢或其他耐药途径中发挥作用。尽管如此，根据本发明的实践的预测子，关于多核苷酸功能的知识并不是确定该预测子的准确性所必需的。
如本文描述的，发现了与前列腺细胞系对可与蛋白酪氨酸激酶(例如Src酪氨酸激酶)相互作用并抑制蛋白酪氨酸激酶的化合物处理的相对内在敏感性或耐药性相关的多核苷酸。通过加权表决、留一法、交叉验证程序，已证明这些多核苷酸对预测前列腺细胞系对这些化合物的内在耐药性和敏感性是有用的。
本发明的一个实施方案涉及一种方法，用于在对需要接受药物或化疗处理或疗法来治疗某种疾病(例如前列腺癌或前列腺肿瘤)的个体进行所述处理或化疗之前确定或预测该个体是否能够成功地对药物或化疗剂作出应答。该药物或化疗剂可以是调节蛋白酪氨酸激酶活性或涉及蛋白酪氨酸激酶的信号传导的药物或化疗剂。这些蛋白酪氨酸激酶的非限制实例包括Src酪氨酸激酶家族的成员，例如Src，Fgr，Fyn，Yes，Blk，Hck，Lck和Lyn，以及其他蛋白酪氨酸激酶，包括Bcr-abl，Jak，PDGFR，c-kit和Eph受体。根据本发明的所述方法，在用化合物或药物(优选蛋白酪氨酸激酶抑制剂)处理之前，对来自与疾病相关的组织或器官(例如肿瘤或癌症的患者活检物，优选前列腺癌或肿瘤的活检物)的细胞进行如本文所述的体外测试，以确定它们的标志多核苷酸的表达模式(来自表2的多核苷酸和/或表3、4或5的预测子多核苷酸亚系列)。将所得的药物处理之前细胞的多核苷酸表达特征谱，与相同多核苷酸在对药物或化合物耐药或敏感的细胞中的多核苷酸表达特征谱(如本发明提供的)进行比较。
在另一个相关的实施方案中，本发明包括一种方法，用于在施加处理之前预测、预后、诊断和/或确定需要药物治疗某种疾病状态或用化疗治疗癌症(例如前列腺癌)的个体是否对治疗有应答。治疗或疗法优选地包括蛋白酪氨酸激酶调节性作用剂、化合物或药物，例如蛋白酪氨酸激酶活性的抑制剂。蛋白酪氨酸激酶包括但不限于，Src酪氨酸激酶家族的成员，例如Src，Fgr，Fyn，Yes，Blk，Hck，Lck和Lyn，以及其他蛋白酪氨酸激酶，包括Bcr-abl，Jak，PDGFR，c-kit和Eph受体。优选的是src酪氨酸激酶及其抑制剂。根据本实施方案，在用蛋白酪氨酸激酶调节性作用剂、化合物或药物进行处理之前，对来自患者组织样品(例如前列腺肿瘤或癌症活检物)的细胞进行测试，以确定其多核苷酸表达模式。将这样得到的测试细胞在暴露于化合物或药物之前的多核苷酸表达特征谱，与如本文描述且分别显示于表2、3、4或5中的包含174、14、10或5个多核苷酸的一个或多个多核苷酸预测子亚系列的多核苷酸表达特征谱进行比较。
用药物对患者癌症或肿瘤进行治疗的成功或失败，可以根据被测试的患者细胞的多核苷酸表达模式与已暴露于药物或化合物并进行了本文中详细说明的预测子多核苷酸分析的耐药或敏感组中的预测子多核苷酸的多核苷酸表达模式进行比较来加以确定。因此，如果在暴露于药物之后，测试细胞显示的多核苷酸表达模式与对药物或化合物敏感的对照组细胞预测子多核苷酸系列的多核苷酸表达模式对应，那么非常有可能，或者可以预测，该个体的癌症或肿瘤会对该药物或化合物的处理作出有利的应答。相反，如果在药物暴露之后，测试细胞显示的多核苷酸表达模式与对药物或化合物耐药的对照组细胞预测子多核苷酸系列的多核苷酸表达模式对应，那么非常有可能，或者可以预测，该个体的癌症或肿瘤不会对该药物或化合物的处理作出应答。
在一个相关的实施方案中，提供了筛选测试法，用于确定患者癌症或肿瘤是否对或者将对药物或化合物的处理敏感或耐药，具体地，该药物或化合物是直接或间接参与蛋白酪氨酸激酶活性或蛋白酪氨酸激酶途径(例如Src酪氨酸激酶活性或途径)的药物或化合物。
本发明还提供了监视测试法，用于监视涉及与蛋白酪氨酸激酶活性相互作用或抑制蛋白酪氨酸激酶活性的药物或化合物的药物治疗的进展。这些监视测试中包含的蛋白酪氨酸激酶包括Src酪氨酸激酶家族的成员，例如Src，Fgr，Fyn，Yes，Blk，Hck，Lck和Lyn，以及其他蛋白酪氨酸激酶，包括Bcr-abl，Jak，PDGFR，c-kit和Eph受体。这种体外测试能够监视患有可以用能够调节蛋白酪氨酸激酶或与蛋白酪氨酸激酶相互作用的化合物或作用剂治疗的疾病的患者的治疗。该监视通过下述方式进行将来自患者组织样品(例如肿瘤或癌症活检物，优选前列腺癌或肿瘤样品)的细胞在用可抑制蛋白酪氨酸激酶活性的药物或化合物处理之前以及在用该药物或化合物处理之后的耐药性或敏感性多核苷酸表达模式，与本文所述的一个或多个预测子多核苷酸系列或其组合的表达模式进行比较。对来自患者的分离细胞进行测试，以确定其在暴露于化合物或药物之前和之后的多核苷酸表达模式(优选地，该化合物或药物是蛋白酪氨酸激酶抑制剂)，确定多核苷酸表达特征谱是否发生了变化以至于应当用其他药物或药剂进行治疗或中止当前的治疗。将所得的测试细胞在治疗之前和之后的多核苷酸表达特征谱与本文已描述并已证明在对药物或化合物耐药或敏感的细胞中高表达的多核苷酸预测子系列的多核苷酸表达模式进行比较。或者，可以仅在患者接受了某种给定药物或治疗化合物的治疗之后如上所述地获得多核苷酸表达特征谱，来监视患者的药物治疗或疗法相关的进展。在这种方式下，没有必要在药物或化合物治疗之前测试患者样品。
这种监视过程可以指示患者用药物或化合物治疗的成功还是失败，指示的根据是从患者样品(例如肿瘤或癌症活检物)分离的细胞的多核苷酸表达模式与耐药或敏感组细胞(所述耐药或敏感组细胞已经暴露于该药物或化合物并在暴露后对它们的多核苷酸表达特征谱进行了评估)的多核苷酸表达模式是相对一致还是不同。因此，如果在用药物或化合物处理之后，测试细胞的多核苷酸表达特征谱显示从处理前所见的特征谱变化为与对药物或化合物耐药的对照组细胞的预测子多核苷酸系列的多核苷酸表达模式一致的特征谱，则它可以作为一种指示，表明当前的治疗应当需要修改、改变、或者甚至中止。同样，如果基于对药物表现敏感的细胞的预测子多核苷酸的表达模式与来自正在接受治疗患者的细胞的多核苷酸表达特征谱的相关性，患者的应答对蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物(例如Src酪氨酸激酶抑制剂)的治疗显示敏感性，那么患者的治疗预后可以定性为是良好的，治疗可以继续。进一步，如果患者在药物治疗之前没有测试过，那么根据其多核苷酸表达特征谱与预测子多核苷酸系列的比较结果，在治疗之后获得的结果可以用于确定细胞对药物的耐药性或敏感性。
在相关实施方案中，本发明包括一种方法，用于监视患有可以用调节蛋白酪氨酸激酶的化合物或药剂治疗的疾病，即前列腺癌的患者的治疗。该治疗监视测试法包括的蛋白酪氨酸激酶包括Src酪氨酸激酶家族的成员，例如Src，Fgr，Fyn，Yes，Blk，Hck，Lck和Lyn，以及其他蛋白酪氨酸激酶，包括Bcr-abl，Jak，PDGFR，c-kit和Eph受体。对于这些测试方法，在暴露于蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物或药物之前和之后，对来自患者的测试细胞进行测定，确定它们的多核苷酸表达模式。将所得的在处理之前和之后测试的细胞的多核苷酸表达特征谱与本文已经描述并已在对药物或化合物耐药或敏感的细胞中显示高表达的预测子多核苷酸系列的多核苷酸表达模式进行比较。因此，如果根据预测子多核苷酸的表达特征谱的相关性，患者的应答是或者变成对蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物的处理敏感的应答，那么患者的治疗预后则可以定性为良好，并且治疗可以继续。同样，如果在用药物或化合物处理之后，测试细胞的多核苷酸表达特征谱并未显示出变成与对药物或化合物敏感的对照组细胞的表达特征谱一致的特征谱，这种情况可以作为一种指示，表明当前的治疗应当修改、变化、或者甚至中止。这种监视过程可以根据需要或期望重复进行，并能够根据从患者样品分离的细胞的多核苷酸表达模式，指示用药物或化合物对患者进行治疗的成功或失败。患者对给定药物治疗的应答的监视还可以仅在用药物或活性化合物治疗之后，而非在所述治疗之前和之后，用所描述的测定法对患者细胞进行测试。
在一个优选实施方案中，本发明包括一种方法，用于监视患有能够用调节src酪氨酸激酶的化合物或作用剂治疗的疾病即前列腺癌的患者的治疗。在暴露于src酪氨酸激酶抑制剂化合物或药物之前和之后，对来自患者的测试细胞进行测定，确定它们多核苷酸表达模式。将所得的测试细胞在处理之前和之后的多核苷酸表达特征谱与本文已经描述的并已在对该药物或化合物耐药或敏感的细胞中显示高表达的预测子系列多核苷酸的多核苷酸表达模式进行比较。因此，如果根据预测子多核苷酸的表达特征谱的相关性，患者的应答是，或者成为对src酪氨酸激酶抑制剂化合物的处理敏感的应答，那么患者的治疗预后则可以定性为良好，且治疗可以继续。同样，如果在用药物或化合物处理之后，测试细胞的多核苷酸表达特征谱并未显示出变成与对药物或化合物敏感的对照组细胞的表达特征谱一致的特征谱，这种情况可以作为一种指示，表明当前的治疗应当修改、变化、或者甚至中止。这种监视过程可以根据需要或期望加以重复，并能够根据从患者样品分离的细胞的多核苷酸表达模式，指示用药物或化合物对患者进行治疗的成功或失败。患者对给定药物治疗的应答的监视还可以仅在用药物或活性化合物治疗之后，而非在所述治疗之前和之后，用所描述的测定法对患者细胞进行测试。
在另一个实施方案中，本发明包括一种方法，用于区分生物学系统(优选地来自患病个体的组织、器官、肿瘤或癌症的细胞)对调节该系统的化合物将会是耐药的还是敏感的。在本发明的一个优选方面中，确定了细胞(例如从肿瘤或癌症获得的细胞)对蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物或化合物系列(例如Src酪氨酸激酶抑制剂)的敏感性或耐药性。抑制剂可以包括那些可以直接地或间接地抑制先前在上文描述的蛋白酪氨酸激酶的化合物、药物或生物作用剂。根据该方法，细胞在暴露于蛋白酪氨酸激酶抑制剂药物或化合物后的耐药性/敏感性特征谱，可以通过本文提出的多核苷酸表达特征谱分析程序来加以确定。这种细胞耐药性/敏感特征谱分布反映了细胞对化合物的IC50值，该IC50值可以用合适的测定法加以确定，例如实施例1中描述的体外测定法。可以使用多种细胞类型以及可在蛋白酪氨酸激酶信号途径中与该蛋白酪氨酸激酶相互作用或者影响其活性的化合物来实施这种程序。
在其另一个实施方案中，本发明包括制备一个或多个由预测子多核苷酸系列构成的专用微阵列(例如寡核苷酸微阵列或cDNA微阵列)，包括表2、3、4或5中的全部多核苷酸或其组合，所述预测子多核苷酸系列已经被证实与对蛋白酪氨酸激酶调节物(特别是src酪氨酸激酶抑制剂)的敏感性(或耐药性)最相关。优选地，预测子多核苷酸系列可通用于预测多于一种蛋白酪氨酸激酶调节物(例如蛋白酪氨酸激酶抑制剂，如Src酪氨酸激酶抑制剂)的敏感性，如本文中显示的。根据本发明的这个方面，寡核苷酸序列或cDNA序列包括任何如本文中描述的预测子多核苷酸或多核苷酸组合，它们在敏感或耐药细胞中高表达，并且包含在微阵列(例如寡核苷酸微阵列或cDNA微阵列)上，与任何支持材料结合或被引入到其上，支持材料例如载玻片、尼龙滤膜、玻璃或聚合物珠、芯片、平板或其他类型的合适基底材料。
从暴露于可以和本文描述的蛋白酪氨酸激酶或其信号途径相互作用的药物或化合物之后正在接受测试的细胞，或者从正在接受测试以便初步确定或预测细胞对药物或化合物的敏感性并最终预测药物或化合物的处理结果的细胞，分离细胞核酸，例如RNA。将分离的核酸恰当地标记后，施加到一个或多个专用微阵列上。按照本文描述的且本领域已知的方法对专用微阵列上的多核苷酸表达模式进行分析。通过例如与图1所示的暴露于本文测试的蛋白酪氨酸激酶抑制剂的细胞组的多核苷酸表达模式进行比较，可以确定与对药物或化合物敏感性或耐药性相关的多核苷酸表达模式。
根据本发明的专用微阵列的实施方案，该微阵列包括与前列腺细胞类型的药物敏感性或耐药性高度相关的一个或多个预测子多核苷酸系列或亚系列的多核苷酸，或其组合，或表2、3、4或5中的所有多核苷酸。如果从测试细胞(例如肿瘤或癌症细胞，优选地前列腺癌或肿瘤细胞)分离的核酸靶标与对照相比，与药物敏感性预测子系列多核苷酸显示高水平的可检出的结合，则可以预测患者细胞将对药物或药物系列作出应答，并且患者对药物或药物系列的应答是良好的。
这种结果预示该肿瘤或癌症细胞是可以用该药物或药物系列成功处理或治疗的优良候选。或者，如果分离自测试细胞的核酸靶标与对照相比，显示高水平的可检出的与药物耐药性预测子系列多核苷酸的结合，则可以预测患者很可能不会对药物或药物组合作出应答，并且患者对药物或药物系列的应答不大可能是良好的。这种结果预示该肿瘤或癌症的细胞不是用于该药物或药物系列处理或治疗的良好候选。
微阵列技术的使用在现有技术中是已知并通用的。简单地讲，为了用微阵列技术确定多核苷酸表达，用本领域中通用的程序或技术将多核苷酸(例如RNA、DNA、cDNA，优选RNA)从生物样品(例如细胞)中分离出来，如本文关于前列腺细胞的描述。将分离的核酸可检测地标记，例如用荧光、酶、放射性核素或化学发光标记，并施加到微阵列，例如本发明提供的专用微阵列。然后洗涤阵列以除去未结合的材料，并根据所用标记物的类型通过染色或荧光或其他本领域已知的方法将其可视化。
在本发明的另一个实施方案中，预测子多核苷酸(表2)，或者构成预测子多核苷酸系列的一个或多个多核苷酸亚系列(例如表3、4或5)，可以用作细胞对蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物(例如Src酪氨酸激酶抑制剂)的耐药性或敏感性的生物标志。有了预测子多核苷酸，就能够进行筛选和检测分析来确定给定的化合物(优选蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物如Src酪氨酸激酶抑制剂化合物)在暴露于细胞(例如从肿瘤或癌症活检样品获得的细胞，如前列腺癌细胞样品)之后，是否引发对化合物的敏感或耐药表型。因此，本发明包括筛选、监视、检测、预后和/或诊断方法，确定细胞对其所接触的可与蛋白酪氨酸激酶或蛋白酪氨酸激酶途径相互作用的药物或化合物(优选抑制剂化合物)的耐药性或敏感性。
这些方法包括多种程序和测试法，用于确定和评估多核苷酸，特别是本文所描述的预测子或src生物标志多核苷酸和预测子多核苷酸亚系列(表2、3、4或5)，在细胞中的表达，其中该细胞已暴露于可与蛋白酪氨酸激酶或蛋白酪氨酸激酶途径相互作用或影响蛋白酪氨酸激酶或蛋白酪氨酸激酶途径的药物或化合物，其中所述蛋白酪氨酸激酶包括Src酪氨酸激酶家族的成员，例如Src，Fgr，Fyn，Yes，Blk，Hck，Lck和Lyn，以及其他蛋白酪氨酸激酶，包括Bcr-abl，Jak，PDGFR，c-kit和Eph受体。合适的方法包括在核酸水平上例如在DNA，RNA，mRNA水平上检测和评估多核苷酸的激活和表达，并检测和评估被编码的蛋白。例如，可以用如本领域已知和通用的PCR测定来定量正在检测对药物处理(例如蛋白酪氨酸激酶抑制剂)的易感性的细胞中的RNA或DNA(见实施例3，RT-PCR)。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于鉴定这样的细胞、组织和/或患者的方法，所述细胞、组织和/或患者被预测为对蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物或影响蛋白酪氨酸激酶信号途径例如Src酪氨酸激酶的化合物耐药，或者所述细胞、组织和/或患者在不同生物系统中对这些化合物耐药。该方法包括如下步骤(i)分析仅如下所述的多核苷酸或其任何组合的表达，所述多核苷酸是在表2、3、4或5中列举的并已显示与对这些化合物的耐药性应答的预测相关的多核苷酸；(ii)将测试细胞、组织和/或患者中这些相关耐药性多核苷酸的观测到的表达水平与已知对化合物耐药的细胞系中相同多核苷酸的表达水平进行比较；和(iii)根据在步骤(ii)中观测到的多核苷酸表达的整体相似性预测所述细胞、组织和/或患者是否对化合物耐药。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于鉴定这样的细胞、组织和/或患者的方法，所述细胞、组织和/或患者被预测为对蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物或影响蛋白酪氨酸激酶信号途径例如Src酪氨酸激酶的化合物敏感，或者所述细胞、组织和/或患者在不同生物系统中对这些化合物敏感。该方法包括如下步骤(i)分析仅如下所述的多核苷酸或其任何组合的表达，所述多核苷酸是在表2、3、4或5中列举的并已显示与对这些化合物的敏感性应答的预测相关的多核苷酸；(ii)将测试细胞、组织和/或患者中这些相关敏感性多核苷酸的观察表达水平与已知对化合物敏感的细胞系中相同多核苷酸的表达水平进行比较；和(iii)根据在步骤(ii)中观察到的多核苷酸表达的整体相似性预测细胞、组织和/或患者是否对化合物敏感。
本发明进一步包括使用基于抗体的测试(例如免疫测试)和/或检测系统，检测和/或定量本发明的一种或多种蛋白酪氨酸激酶生物标志蛋白。如文中提到的，蛋白酪氨酸激酶包括Src酪氨酸激酶家族的成员，例如Src，Fgr，Fyn，Yes，Blk，Hck，Lck和Lyn，以及其他蛋白酪氨酸激酶，包括Bcr-abl，Jak，PDGFR，c-kit和Eph受体。这些测试包括如下的非限制性实施例，ELISA、免疫荧光、荧光活化细胞分选(FACS)、Western印迹等，本文对它们有进一步描述。
在另一个实施方案中，本发明的人蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽和/或它们的肽，或免疫原性片段或寡肽，可以用于在多种药物筛选技术中筛选治疗药物或化合物。这样的筛选测试中采用的片段可以游离于溶液中，固定于固体支持物，担载在细胞表面，或者定位于细胞内。生物标志蛋白和受测物质之间结合复合物形成活性的降低或消失可以被测量。因此，本发明提供了一种方法，用于筛选或评估多种化合物与本发明蛋白激酶抑制剂生物标志多肽或者其可结合肽段的特异结合亲和力。该方法包括如下步骤，提供多种化合物；将蛋白激酶抑制剂生物标志多肽或其可结合肽段(bindablepeptide fragment)与多种化合物的每一种在合适的条件下混合(combine)足以允许其结合的一段时间；和检测该生物标志多肽或肽与多种测试化合物中的每一种的结合，借此鉴定与该生物标志多肽或肽特异结合的化合物。更具体地，该生物标志多肽或肽是Src酪氨酸激酶抑制剂生物标志的多肽或肽。
鉴定可调节本发明表2中提供的人蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽和/或肽的活性的化合物的方法，包括混合(combine)蛋白激酶的候选化合物或药物调节剂，和测量候选化合物或药物调节剂对蛋白激酶抑制剂生物标志多肽或肽的生物活性的作用。这些可测量的作用包括例如物理结合相互作用；切割合适的蛋白激酶底物的能力；对表达天然和克隆蛋白激酶生物标志的细胞系的作用；和调节物或其他蛋白激酶介导的生理量度的影响。
另一种鉴定可调节本发明蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的生物活性的化合物的方法包括，将蛋白酪氨酸激酶生物活性(例如Src酪氨酸激酶)的潜在或候选化合物或药物调节剂与表达该蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的宿主细胞混合(combine)在一起，和测量候选化合物或药物调节剂对该蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽生物活性的影响。该宿主细胞可以还能够被诱导表达蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽，例如通过可诱导表达。给定调节剂候选物对蛋白酪氨酸激酶生物标志的生理影响也可以被测量。因此，对特定蛋白酪氨酸激酶调节剂(例如src激酶调节剂)的细胞测定可以直接测量或定量该蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的物理生物活性，或者可以测量或定量生理效应。这些方法优选地采用如本文描述的蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽，或者在含有如本文所述的表达载体的合适宿主细胞中的过表达的重组蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽，所述细胞中该蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽被表达、过表达或经历上调表达。
本发明的另一个方面包括一种方法，用于筛选能够调节蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽(例如Src激酶生物标志多肽)的生物活性的化合物。该方法包括，提供含有表达载体的宿主细胞，该宿主细胞带有蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽或其功能肽或部分(例如，表2或本文序列列表中给出的src多肽、蛋白、肽或片段序列)的编码核酸序列；确定所表达的蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽在没有调节剂化合物时的生物活性；将细胞与调节剂化合物接触并确定所表达的蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽在存在该调节剂化合物时的生物活性。在此方法中，蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的活性在存在和不存在该调节剂化合物时的差异指示了该化合物的调节效果。
本质上，在根据本发明的测定中，任何化合物均可用作候选调节剂或配体。被测试作为蛋白酪氨酸激酶调节剂的化合物可以是任何小分子化合物或者生物学实体(例如蛋白、糖、核酸或脂质)。测试化合物典型地是小分子化学分子和肽类。一般地，用作潜在调节剂的化合物可以溶解于水性或有机(例如DMSO基)溶液中。所述测定经设计以通过使测试步骤自动化并提供任何方便来源的化合物来筛选大的化学文库。测定通常平行地进行，例如在机器人化测定(robotic assay)中在微量滴定板上以微滴定模式进行。化合物供应商为数众多，包括例如Sigma(St.Louis，MO)，Aldrich(St.Louis，MO)，Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，Fluka Chemika-Biochemica Analytika(Buchs，Switzerland)。此外，化合物可以用本领域已知的方法合成。
特别考虑用高通量筛选方法来检测新型蛋白酪氨酸激酶生物标志的调节剂，例如src生物标志，多核苷酸和本文描述的多肽。这些高通量筛选方法通常包括提供含有大量潜在治疗性化合物(例如配体或调节剂化合物)的组合化学或肽文库。然后在一种或多种测定中对该组合化学文库或配体文库进行筛选，从而鉴定显示期望的特征活性的文库成员(例如特定的化学种类或亚类)。这样鉴定的化合物可以用作传统的先导化合物，或者自身用作潜在或实际的治疗剂。
组合化学文库是通过化学合成或生物合成，通过将多个化学结构单元(chemical building block)(即，试剂如氨基酸)组合起来而制备，而产生的多种多样的化合物的集合。作为一个实例，对于给定化合物长度(即多肽或肽化合物中的氨基酸数目)以所有可能的方式将一系列化学结构单元组合在一起，形成一个线性组合文库，例如多肽或肽库。通过化学结构单元的这种组合式混合(combinatorial mixing)可以合成上百万的化合物。
组合化学文库的制备和筛选是本领域技术人员熟知的。组合文库包括，但不限于，肽文库(例如美国专利NO.5,010,175；Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.，37487-493(1991)；和Houghton等，Nature，35484-88(1991))。也可以使用其他用于产生化学多样性文库的化学法。化学多样性文库化学的非限制性实例包括，类肽(peptoids)(PCT公开No.WO 91/019735)，编码的肽(PCT公开No.WO 93/20242)，随机生物寡聚体(PCT公开No.WO 92/00091)，苯并二氮卓类(benzodiazepines)(美国专利No.5,288,514)，diversomers例如乙内酰脲(hydantoin)、苯并二氮卓类和二肽(Hobbs等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906909-6913(1993))，插烯多肽(vinylogous polypeptides)(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.，1146568(1992))，具有葡萄糖骨架的非肽性肽模拟物(peptidomimetics)(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.，1149217-9218(1992))，小化合物文库的类似有机合成(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.，1162661(1994))，寡氨基甲酸酯(oligocarbamates)(Cho等，Science，2611303(1993))，和/或膦酸肽酯(peptidyl phosphonates)(Campbell等，J.Org.Chem.，59658(1994))，核酸文库(见上文的Ausubel，Berger和Sambrook)，肽核酸文库(美国专利No.5,539,083)，抗体文库(例如Vaughn等，NatureBiotechnology，14(3)309-314(1996)和PCT/US96/10287)，糖文库(例如Liang等，Science，274-1520-1522(1996)和美国专利No.5,593,853)，有机小分子库(例如苯并二氮卓类，Baum，C&EN，p.33(1993年1月18日)和美国专利No.5,288,514)；类异戊二烯(isoprenoids)(美国专利No.5,569,588)；噻唑烷酮(thiazolidinones)和间噻嗪啉酮(metathiazanones)(美国专利No.5,549,974)；吡咯烷(美国专利Nos.5,525,735和5,519,134)；吗啉代化合物(美国专利No.5,506,337)等。
用于制备组合文库的设备是可商购的(例如357MPS，390MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY；Symphony，Rainin，Woburn，MA；433AApplied Biosystems，Foster City，CA；9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。此外，有很多种可商购的组合文库(例如ComGenex，Princeton，NJ；Asinex，Moscow，Russia；Tripos，Inc.，St.Louis，MO；ChemStar，Ltd.，Moscow，Russia；3D Pharmaceuticals，Exton，PA；Martek Biosciences，Columbia，MD等)。
在一个方面中，本发明提供了基于固相的高通量模式体外测试法，其中表达酪氨酸激酶蛋白/多肽/肽的细胞或组织被附着到固相基底上。在这种高通量测定中，有可能在一天内筛选高达数千个不同的调节剂或配体。具体地，微量滴定板的每个孔均可用于执行针对所选潜在调节剂的不同测定，或者如果需要观察浓度或温育时间效应，每5-10个孔可以用于测试一个调节剂。因此，一个标准的微量滴定板可用于测试大约96个调节剂。如果使用1536孔板，那么单个板就可以容易地测试大约100-大约1500个不同的化合物。每天有可能测试数个不同的板；因此，例如，有可能使用所述集成系统对高达大约6,000-20,000个不同的化合物进行测试筛选。
在另一个方面中，本发明包括筛选和小分子(例如药物)检测测定法，其包括检测或鉴定能够结合给定蛋白的小分子，所述给定蛋白即酪氨酸激酶生物标志多肽或肽，例如Src酪氨酸激酶生物标志多肽或肽。特别优选的是适合于高通量筛选方法的测定法。
在这种基于结合的检测、鉴定或筛选测定中，通常不需要功能测定。一般地，所需的只是靶蛋白，优选地是基本上纯净的，和待筛选或测定与蛋白靶结合的化合物(例如配体、药物或小分子)或者生物学实体文库或组。优选地，大多数与靶蛋白结合的小分子可以通过与蛋白的功能区域进行优先的、高亲和力的结合从而以某种方式调节靶物的活性。
这种测试的一个实例是基于荧光的热迁移测定(fluorescence basedthermal shift assay)(3-Dimensional Pharmaceuticals，Inc.，3DP，Exton，PA)，如授予Pantoliano等的美国专利Nos.6,020,141和6,036,920所述(同见J.Zimmerman，Gen.Eng.News，20(8)(2000))。借助该测定，可以基于通过分析蛋白-药物或配体复合体的热去折叠曲线(thermal unfolding curve)而得到的结合亲和力测定结果，来检测可以和表达的(优选纯净的)酪氨酸激酶生物标志蛋白/多肽/肽(例如Src酪氨酸激酶)结合的小分子(例如药物、配体)。如果期望的话，可以用例如本文中描述的方法对通过该技术确定的药物或结合分子进行进一步的测试，以确定该分子是否影响或调节靶蛋白的功能或活性。
为了纯化酪氨酸激酶生物标志多肽或肽，例如Src酪氨酸激酶，以测量生物结合或配体结合活性，来源可以是全细胞裂解物，该裂解物可以通过在标准蛋白酶抑制剂的存在下连续冻融循环(例如1-3个)来制备。酪氨酸激酶生物标志多肽可以通过标准蛋白纯化方法，例如使用本文所述特异抗体的亲和色谱，或者通过同样在本文中描述的对重组酪氨酸激酶生物标志多肽分子内的工程化附加表位具有特异性的配体，来加以部分或完全地纯化。然后可以如本文所述测定结合活性。
根据本文提供的方法鉴定的、可以调节或调控本发明的酪氨酸激酶生物标志多肽的生物活性或生理的化合物，是本发明的优选实施方案之一。我们预期，这些调节化合物可用于处理和治疗方法，通过向有需要的个体施用治疗有效量的通过本文描述的方法鉴定的化合物，来治疗由酪氨酸激酶生物标志多肽(例如Src酪氨酸激酶生物标志多肽)介导的病症。
此外，本发明提供了用于治疗个体的方法，所述个体需要治疗由本发明的酪氨酸激酶生物标志多肽介导的疾病、疾患或病症，该方法包括向个体施用治疗有效量的通过本文提供的方法鉴定的酪氨酸激酶生物标志调节性化合物。根据本发明，本方法涵盖的酪氨酸激酶生物标志多肽或蛋白包括Src酪氨酸激酶家族的成员，例如Src，Fgr，Fyn，Yes，Blk，Hck，Lck和Lyn，以及其他蛋白酪氨酸激酶，包括Bcr-abl，Jak，PDGFR，c-kit和Eph受体。
本发明特别提供了用于治疗个体的方法，所述个体需要治疗由本发明的Src生物标志多肽介导的疾病、疾患或病症，该方法包括向个体施用治疗有效量的通过本文提供的方法鉴定的Src生物标志调节化合物。
本发明进一步包括多肽，其包含具有一个或多个蛋白酪氨酸激酶生物标志的氨基酸序列(优选地是如表2所示的Src生物标志氨基酸序列)的多肽的表位，或者所述表位组成。本发明还包括编码本发明蛋白酪氨酸激酶生物标志的多肽序列的表位的多核苷酸序列。
本文使用的术语“表位”是指多肽中在动物(优选哺乳动物，最优选人)体内具有抗原性或免疫原性的部分。在一个优选实施方案中，本发明包括含有表位的多肽，以及编码该多肽的多核苷酸。本文使用的术语“免疫原性表位”是指蛋白质中可在动物体内引发抗体反应的部分，在动物体内引发抗体反应可以通过任何本领域熟知的方法加以确定，例如通过下文中描述的生成抗体的方法(见例如，Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，813998-4002(1983))。本文使用的术语“抗原性表位”是指蛋白中抗体能够免疫特异性结合其抗原的部分，所述结合可通过任何本领域熟知的方法加以确定，例如通过本文描述的免疫测定法。免疫特异性结合不包括非特异性结合，但不一定排除与其他抗原的交叉反应性。抗原性表位不必是免疫原性的。全长蛋白或抗原性肽段均可使用。优选地从这些区段制备抗体或者从酪氨酸激酶生物标志核酸的区域中的离散片段和含有表位的蛋白序列来制备抗体。发挥表位功能的多肽或肽段可以用任何常规手段产生。(见例如Houghten，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，825131-5135(1985)；和美国专利No.4,631,211中描述的)。
而且，抗体也可以从蛋白酪氨酸激酶生物标志(包括本文描述的Src激酶生物标志)的多肽或肽的任何区域来制备。此外，如果多肽是受体蛋白，则可以开发针对整个受体或受体部分的抗体，例如针对胞内羧基端结构域、氨基端胞外域、整个跨膜结构域、特定跨膜片段、任何胞内或胞内环、或者这些区域的任何部分。还可以开发针对特殊功能位点的抗体，例如配体结合位点或者被糖基化、磷酸化、肉豆蔻酰化或酰胺化的位点。
在本发明中，用于产生抗体的抗原性表位优选地包含一段序列，其长度为至少4个、至少5个、至少6个、至少7个氨基酸残基，更优选地至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个氨基酸残基，最优选地大约15-大约30个氨基酸残基。前述表位的组合也包括在内。包含免疫原性或抗原性表位的优选多肽的长度为至少10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100个氨基酸残基。其他的非排他性优选抗原性表位包括本文公开的抗原表位，以及它们的部分，以及这些抗原性表位中2个、3个、4个、5个或更多个的任意组合。这些抗原性表位可用作免疫测定中的靶分子。(见例如Wilson等，Cell，37767-778(1984)；Sutcliffe等，Science，219660-666(1983))。然而，此处描述的片段不可以被理解为包含可能在本发明之前公开的任何片段。
包含一个或多个可引发抗体应答的免疫原性表位的蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽可以和载体蛋白，例如白蛋白，一起引入到动物系统(例如家兔或小鼠)中。或者，如果该多肽足够长(例如至少大约15-25个氨基酸)，则多肽可以不用载体。然而，已证明包含少到5-10个氨基酸的免疫原性表位足以产生起码能够结合变性多肽中的线性表位(例如在Western印迹中)的抗体。
可根据本领域熟知的方法用本发明的带有表位的多肽诱导抗体，这些方法包括但不限于，体内免疫、体外免疫、和噬菌体展示方法。(见例如Sutcliffe等，前文；Wilson等，前文；和Bittle等，前文)。如果使用体内免疫，则可以使用合适大小的游离肽对动物进行免疫；然而，通过将肽与大分子载体，例如钥孔戚血蓝蛋白(KLH)或破伤风类毒素(TT)偶联，可以提高抗肽抗体的滴度。例如，含有半胱氨酸残基的肽可以用连接子，例如马来酰亚胺基苯甲酰N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)，与载体偶联，而其他的肽可以用更通用的连接剂，例如戊二醛，与载体偶联。
含有表位的肽还可以被合成为多抗原肽(multiple antigen peptides)(MAP)，其首先由J.P.Tam等(Biomed.Pept.，Proteins，Nucleic Acids，1(3)123-132(1995))和Calvo等(J.Immunol.，150(4)1403-1412(1993))描述，在此通过提述纳入其全部内容。MAP含有附接于非免疫原性赖氨酸核心的多拷贝的特定肽。MAP肽通常含有肽的4或8个拷贝，通常被称为MAP4或MAP8肽。作为非限制性实例，MAP可以被合成到附着于聚乙二醇-聚苯乙烯(PEG-PS)支持物的赖氨酸核心基质上。利用9-芴甲氧羰基(Fmoc)化学将目标肽合成到赖氨酸残基上。例如，Applied Biosystems(Foster City，CA)提供可商购的MAP树脂，例如Fmoc Resin 4 Branch和Fmoc Resin 8 Branch，其可用于合成MAP。用本领域已知的基于三氟醋酸(TFA)的标准合剂将MAP从树脂上切离。除了脱盐之外，一般不需要纯化MAP。MAP肽可用于免疫用疫苗，这些疫苗可引发生成既可识别MAP又可识别该肽来源的天然蛋白的抗体。
也可以将本发明的带有表位的肽掺入病毒的外壳蛋白内，随后可以用作免疫原或疫苗用于免疫动物，包括人，以刺激产生抗表位的抗体。例如，1型人免疫缺陷病毒型(HIV-1)gp120糖蛋白的V3环已被工程化在鼻病毒的表面上表达。用展示V3环肽的鼻病毒进行免疫产生了对HIV-1免疫原的表观有效的模拟物(mimic)(以其被抗HIV-1抗体中和化的能力以及在细胞培养物内显示产生能够中和HIV-1的抗体的能力来衡量)。这种使用工程化病毒颗粒作为免疫原的技术在Smith等，Behring Inst Mitt Feb，(98)229-239(1997)；Smith等，J.Virol.，72651-659(1998)；和Zhang等，Biol.Chem.，380365-374(1999))中有更详细的描述，在此通过提述纳入它们的全部内容。
而且，含有根据本发明的表位的多肽或肽可以通过，例如，在肽的氨基和/或羧基端添加氨基酸来加以修饰。进行这种修饰是为了，例如，改变带有表位的多肽的构象，从而使该表位的构象更接近该表位在天然蛋白质中的结构。经过修饰的本发明带有表位的多肽的一个实例是这样的多肽，其中在该多肽上添加了一个或更多个半胱氨酸残基，从而允许在两个半胱氨酸之间形成二硫键，因此形成该带有表位的多肽的在非还原条件下稳定的环结构。二硫键可以在一个被添加到该多肽上的半胱氨酸残基与一个天然表位的半胱氨酸残基之间形成，也可以在两个被添加到天然带表位多肽上的半胱氨酸之间形成。
此外，有可能通过用半胱氨酸加以替换来对天然的带有表位的多肽的一个或更多个氨基酸残基进行修饰，以促进二硫键键合的环结构的形成。合成肽的环硫醚分子可以常规地用本领域已知的技术产生，例如在PCT公开WO 97/46251中描述的，在此通过提述纳入其全部内容。本发明预期的其他对带有表位的多肽的修饰包括生物素化。
为了在体内产生抗体，用游离或载体偶联的肽或MAP肽对宿主动物，例如家兔、大鼠、小鼠、绵羊或山羊，进行免疫，例如通过腹膜内和/或皮内注射。注射材料典型地是乳剂，其含有大约100μg肽或载体蛋白和弗氏佐剂或者任何其他已知用于刺激免疫应答的佐剂。可能需要数次加强注射(booster injection)，例如每隔大约2周进行，以提供有效低度的抗肽抗体，所述抗体可以用，例如，使用吸附在固体表面上的游离肽的ELISA测定来加以检测。被免疫动物的血清中抗肽抗体的滴度可以通过选择抗肽抗体来加以提高，例如根据本领域熟知的方法，将肽吸附到固体支持体上并洗脱所选抗体。
正如本领域的技术人员会意识到的，亦如上文所讨论的，本发明的酪氨酸激酶生物标志多肽可以与其他多肽序列融合，其中该酪氨酸激酶生物标志多肽包括下列Src酪氨酸激酶家族的成员如Src，Fgr，Fyn，Yes，Blk，Hck，Lck和Lyn，以及其他蛋白酪氨酸激酶，包括Bcr-abl，Jak，PDGFR，c-kit和Eph受体，并且该酪氨酸激酶生物标志多肽包含免疫原性或抗原性表位。例如，本发明的多肽可以和免疫球蛋白(IgA，IgE，IgG，IgD，or IgM)或其一部分，例如CH1，CH2，CH3或其任意组合或其一部分融合，或者可以和白蛋白，包括但不仅限于重组人白蛋白或其片段或变体融合(见例如美国专利No.5,876,969；欧洲专利No.0413622；和美国专利No.5,766,883，在此通过提述纳入其全部内容)，结果产生嵌合多肽。这种融合蛋白可以使纯化变得方便，并可以增加体内半衰期。这一点对于含有人CD4-多肽前两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白重或轻链恒定区的各种结构域的嵌合蛋白质已得到了证实(见例如Traunecker等，Nature，33184-86(1988))。
对于结合了FcRn结合伴侣(如IgG或Fc片段)的抗原(例如胰岛素)，已经证明可提高抗原跨越上皮屏障向免疫系统的运输(见例如WO 96/22024和WO 99/04813)。还已发现，由于IgG部分的二硫键而形成了二硫键连二聚体的IgG融合蛋白，在结合和中和其他分子方面，比单独的单体多肽或其片段更有效(见例如Fountoulakis等，J.Biochem.，2703958-3964(1995))。
也可以将编码表位的核酸作为附加表位(例如红细胞凝集素(″HA″)标签或flag标签)与目的多核苷酸重组，以帮助检测和纯化表达的多肽。例如，Janknecht等描述了用于在人细胞系中表达的非变性融合蛋白的简便纯化的系统(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，888972-8976(1991))。在该系统中，目标多核苷酸被亚克隆到痘苗病毒重组质粒中，使得该多核苷酸的开放阅读框在翻译水平上融合到具有一个6个组氨酸残基的氨基端标签上。该标签用作融合蛋白的基质结合域。将经该重组痘苗病毒感染的细胞的提取物加载到Ni2+氮川三乙酸-琼脂糖柱上，用含咪唑的缓冲液选择性洗脱组氨酸标签的蛋白。
本发明的其他融合蛋白可以用如下的技术产生，基因改组(shuffling)、基序改组(motif shuffling)、外显子改组(exon shuffling)和/或密码子改组(codon shuffling)(统称“DNA改组”)。DNA改组可用于调节本发明多肽的活性；这些方法可用于产生具有改变的活性的多肽，以及多肽的激动剂和拮抗剂。一般地，见美国专利5,605,793；5,811,238；5,830,721；5,834,252；和5,837,458，以及Patten等，Curr.Opinion Biotechnol.，8724-733(1997)；Harayama，Trends Biotechnol.，16(2)76-82(1998)；Hansson等，J.Mol.Biol.，287265-276(1999)；和Lorenzo and Blasco，Biotechniques，24(2)308-313(1998)，在此通过提述纳入其全部内容。
在本发明的一个实施方案中，对相应于表2中提出的一个或多个src生物标志多核苷酸序列的多核苷酸以及由这些多核苷酸编码的多肽的改变，可以通过DNA改组实现。DNA改组包括通过同源或定点重组组装两个或多个DNA片段，从而在多核苷酸序列中产生变异。在另一个实施方案中，在重组之前，本发明的多核苷酸或其编码的多肽可以通过用易错PCR(error-prone PCR)、随机核苷酸插入或其他方法进行随机多核苷酸突变(mutapolynucleotidesis)加以改变。在另一个实施方案中，编码本发明多肽的多核苷酸的一个或多个组分、基序、区段、部分、域、片段等可以和一个或多个异源分子的一个或多个组分、基序、区段、部分、域、片段等重组。
本发明的另一个方面涉及抗体和T细胞抗原受体(TCR)，其免疫特异地结合如本发明表2中所示的一个或多个src生物标志氨基酸序列的多肽、多肽片段或变体，和/或其表位(如通过本领域众所周知的用于测定特异性抗体-抗原结合的免疫测定法加以确定)。
双特异或双功能抗体是人工杂交抗体，其具有两个不同的重/轻链对和两个不同的结合位点。双特异性抗体可以用多种方法产生，包括杂交瘤融合或者Fab片段连接。(见例如Songsivilai & Lachmann，Clin.Exp.Immunol.，79315-321(1990)；Kostelny等，J.Immunol.，1481547-1553(1992))。此外，双特异性抗体可以形成作为“双抗体”(diabody)(见Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993))，或″Janusins″(见Traunecker等，EMBO J.，103655-3659(1991)和Traunecker等，Int.J.Cancer Suppl.751-52(1992))。
本发明的抗体包括，但不限于，多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化或嵌合抗体，单链抗体，Fab片段，F(ab′)片段，由Fab表达库产生的片段，抗独特型(anti-Id)抗体(包括例如针对本发明抗体的anti-Id抗体)，胞内产生的抗体(即胞内抗体(intrabody))，和上述任一个的表位结合片段。本文使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分或片段，即含有可免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)、类或亚类(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)。优选地，免疫球蛋白是IgG1，IgG2或IgG4同种型(isotype)。
免疫球蛋白可以同时具有重链和轻链。一系列IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY重链可以和kappa或lambda型轻链配对。最优选地，本发明的抗体是人抗原结合抗体和抗体片段，并且包括但不限于，Fab，Fab′F(ab′)2，Fd，单链Fv(scFv)，单链抗体，二硫键连的Fv(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。抗原结合性抗体片段，包括单链抗体，可以仅包含可变区，或者包含可变区与如下各项的整体或部分的组合铰链区，和CH1，CH2和CH3结构域。另外本发明还包括如下的抗原结合片段，其包含可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任意组合。本发明的抗体可以来自于任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人、鼠(例如小鼠和大鼠)、猴、绵羊、家兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡来源的。如本文使用的，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，并包括从人免疫球蛋白文库或从不表达内源免疫球蛋白、而转入了一个或多个人免疫球蛋白的转基因动物分离的抗体，如在下文和例如美国专利No.5,939,598中描述的。
本发明的抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或更多特异性的。多特异性抗体可以对本发明多肽的不同表位特异，或者可以既对本发明的多肽特异，又对异源表位，例如异源多肽或固相支持材料特异。(见例如WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等，J.Immunol.，14760-69(1991)；U.S.Patent Nos.4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；和Kostelny等，J.Immunol.，1481547-1553(1992))。
本发明的抗体可以用其识别或特异结合的本发明多肽的表位或部分来描述或规定。例如可以用N端和C端位置、连续氨基酸残基的大小，或者如在本文表2中定义的序列中显示的那样来规定表位或肽部分。根据本发明，进一步包括如下的抗体，其结合由如下多核苷酸编码的多肽，其中该多核苷酸可以在如本文所述的严格或中等严格的杂交条件下与本发明的多核苷酸杂交。
本发明的抗体(包括包含抗体片段或变体或者由其组成的分子)可免疫特异性地结合本发明的多肽或多肽片段，或结合本发明的变体人蛋白酪氨酸激酶生物标志，例如表2中所示的Src生物标志蛋白，和/或猴src生物标志蛋白。
作为非限制性实例，如果抗体与第一抗原结合的解离常数(Kd)小于对第二抗原的抗体Kd，则可以认为该抗体优先结合第一抗原。在另一个非限制性实施方案中，如果抗体与第一抗原结合的亲和力比该抗体对第二抗原的Ka小至少一个数量级，则可以认为该抗体优先结合第一抗原。在另一个非限制性实施方案中，如果抗体与第一抗原结合的亲和力比该抗体对第二抗原的Kd小至少两个数量级，则可以认为该抗体优先结合第一抗原。
在另一个非限制性实施方案中，如果抗体与第一抗原结合的解离速率(off rate)(koff)比该抗体对第二抗原的解离速率小，则可以认为该抗体优先结合第一抗原。在另一个非限制性实施方案中，如果抗体与第一抗原结合的亲和力比该抗体对第二抗原的解离速率小至少一个数量级，则可以认为该抗体优先结合第一抗原。在另一个非限制性实施方案中，如果抗体与第一抗原结合的亲和力比该抗体对第二抗原的解离速率小至少两个数量级，则可以认为该抗体优先结合第一抗原。
本发明的抗体还可以用其对本发明酪氨酸激酶生物标志多肽的结合亲和力，例如对Src酪氨酸激酶家族的成员，如Src，Fgr，Fyn，Yes，Blk，Hck，Lck和Lyn，以及其他蛋白酪氨酸激酶，包括Bcr-abl，Jak，PDGFR，c-kit和Eph受体的结合亲和力，来加以描述或规定。优选的结合亲和力包括解离常数或Kd小于5x10-2M，1x10-2M，5x10-3M，1x10-3M，5x10-4M，或1x10-4M的结合亲和力。更优选的结合亲和力包括解离常数或Kd小于5x10-5M，1x10-5M，5x10-6M，1x10-6M，5x10-7M，1x10-7M，5x10-8M，或1x10-8M的结合亲和力。进一步更加优选的抗体结合亲和力包括解离常数或Kd小于5x10-9M，1x10-9M，5x10-10M，1x10-10M，5x10-11M，1x 10-11M，5x10-12M，1x10-12M，5x10-13M，1x10-13M，5x10-14M，1x10-14M，5x10-15M，或1x10-15M的结合亲和力。
在具体的实施方案中，本发明的抗体结合蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽或其片段或变体的解离速率(off rate，koff)小于或等于大约5x10-2sec-1，1x10-2sec-1，5x10-3sec-1，或1x10-3sec-1。更优选地，本发明的抗体结合src生物标志蛋白多肽或其片段或变体的解离速率(koff)小于或等于大约5x10-4sec-1，1x10-4sec-1，5x10-5sec-1，1x10-5sec-1，5x10-6sec-1，1x10-6sec-1，5x10-7sec-1，或1x10-7sec-1。
在其他实施方案中，本发明的抗体结合蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽或其片段或变体的结合速率(on rate)(kon)大于或等于1x103M-1sec-1，5x103M-1sec-1，1x104M-1sec-1，或5x104M-1sec-1。更优选地，本发明的抗体结合蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽或其片段或变体的结合速率大于或等于1x105M-1sec-1，5x105M-1sec-1，1x106M-1sec-1，5x10-6M-1sec-1，或1x10-7M-1sec-1。
本发明还提供了这样的抗体，其竞争性抑制抗体与本发明表位的结合，如通过本领域任何已知的用于确定竞争性抑制的方法，例如本文描述的免疫测定所测定的。在优选实施方案中，该抗体将对表位的结合竞争性抑制至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、或者至少50％。
本发明的抗体可以担当本发明蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的激动剂或拮抗剂。例如，本发明包括可以部分或完全阻断受体/配体与本发明多肽的相互作用的抗体。本发明同时包括受体特异抗体和配体特异抗体。本发明还包括这样的受体特异抗体，其不阻止配体结合，但阻止受体激活。受体激活(即信号传导)可以用本文描述的技术或者本领域已知的技术加以确定。例如，可以进行免疫沉淀随后进行Western印迹分析来检测受体或其底物的磷酸化(例如酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸上的磷酸化)，从而确定受体的激活。在具体实施方案中，提供这样的抗体，其抑制配体活性或受体活性，抑制幅度为不存在该抗体时的活性的至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、或者至少50％。
在本发明的另一个实施方案中，免疫特异性地结合蛋白酪氨酸激酶生物标志或其片段或变体的抗体包括如下的多肽，其具有由本发明的表达抗蛋白酪氨酸激酶生物标志抗体的细胞系所表达的任何一种重链和/或由本发明表达抗蛋白酪氨酸激酶生物标志抗体的细胞系所表达的任何一种轻链的的氨基酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，免疫特异性地结合酪氨酸激酶生物标志蛋白或其片段或变体的抗体包括这样的多肽，其具有由本发明表达抗蛋白酪氨酸激酶生物标志抗体的细胞系所表达的重链的任何一个VH结构域和/或由本发明表达抗蛋白酪氨酸激酶生物标志抗体的细胞系表达的轻链的任何一个VL结构域的氨基酸序列。在优选实施方案中，本发明的抗体包括由单个表达抗蛋白酪氨酸激酶生物标志蛋白抗体的细胞系所表达的VH结构域和VL结构域的氨基酸序列。在作为备选的实施方案中，本发明的抗体包括由两个不同的表达抗蛋白酪氨酸激酶生物标志的抗体的细胞系表达的VH结构域和VL结构域的氨基酸序列。
本发明还包括这样的分子，其包括由表达抗蛋白酪氨酸激酶生物标志抗体的细胞系所表达的VH和/或VL结构域的抗体片段或变体，或者由抗体片段或变体组成，且所述抗体片段或变体免疫特异性地结合酪氨酸激酶生物标志蛋白，例如Src酪氨酸激酶；本发明还包括编码这些VH和VL结构域、分子、片段和/或变体的核酸分子。
本发明还提供了如下的抗体，其免疫特异性地结合酪氨酸激酶生物标志蛋白(例如Src激酶生物标志蛋白)的多肽、多肽片段或变体，其中这些抗体包含如下多肽或者由如下所述多肽组成，所述多肽具有由一个或多个抗酪氨酸激酶生物标志蛋白抗体表达细胞系所表达的重链中含有的任何一个、两个、三个或更多个VHCDR的氨基酸序列。具体地，本发明提供了这样的抗体，其免疫特异性地结合酪氨酸激酶生物标志蛋白，且包括具有由一个或多个抗酪氨酸激酶生物标志蛋白抗体表达细胞系表达的重链中包含的VHCDR1的氨基酸序列的多肽或者由该多肽组成。在另一个实施方案中，免疫特异性地结合酪氨酸激酶生物标志蛋白的抗体包含这样的多肽或者由其组成，所述多肽具有由一个或多个抗酪氨酸激酶生物标志蛋白抗体表达细胞系所表达的重链中包含的VHCDR2的氨基酸序列。在优选实施方案中，免疫特异性地结合酪氨酸激酶生物标志蛋白的抗体包含这样的多肽或者由其组成，所述多肽具有由一个或多个抗酪氨酸激酶生物标志蛋白抗体表达细胞系所表达的重链中包含的VHCDR3的氨基酸序列。本发明还包括这样的分子，所述分子包含这些抗体或它们的可免疫特异性结合酪氨酸激酶生物标志蛋白或酪氨酸激酶生物标志蛋白片段或其变体的抗体片段或变体，或者由这样的抗体、抗体片段或变体组成。本发明还包括编码这些抗体、分子、片段和/或变体的核酸分子。
本发明还提供了如下的抗体，其可以免疫特异性结合酪氨酸激酶生物标志蛋白(例如Src激酶生物标志蛋白)的多肽或多肽片段或变体，其中所述抗体包含如下多肽或者由该多肽组成，所述多肽具有由本发明的一个或多个抗酪氨酸激酶生物标志蛋白抗体表达细胞系表达的重链中含有的任何一个、两个、三个或更多个VLCDR的氨基酸序列。具体地，本发明提供了这样的抗体，其免疫特异性地结合酪氨酸激酶生物标志蛋白，且包括具有由一个或多个本发明的抗酪氨酸激酶生物标志蛋白抗体表达细胞系表达的重链中包含的VLCDR1的氨基酸序列的多肽，或者由该多肽组成。在另一个实施方案中，免疫特异性结合src生物标志蛋白的抗体包含如下多肽或者由该多肽组成，所述多肽具有由本发明的一个或多个抗酪氨酸激酶生物标志蛋白抗体表达细胞系表达的重链中包含的VLCDR2的氨基酸序列。在优选实施方案中，免疫特异性结合酪氨酸激酶生物标志蛋白的抗体包含如下多肽或者由该多肽组成，所述多肽具有由本发明的一个或多个抗酪氨酸激酶生物标志蛋白抗体表达细胞系所表达的重链中包含的VLCDR3的氨基酸序列。本发明还包括如下的分子，所述分子包含这些抗体或它们的可免疫特异性结合酪氨酸激酶生物标志蛋白或酪氨酸激酶生物标志蛋白片段或其变体的抗体片段或变体，或者由这样的抗体、抗体片段或变体组成。本发明还包括编码这些抗体、分子、片段和/或变体的核酸分子。
本发明还提供了这样的抗体(包括含有抗体片段或变体或由抗体片段或变体组成的分子)，其免疫特异性结合酪氨酸激酶生物标志蛋白，酪氨酸激酶生物标志蛋白(例如Src酪氨酸激酶)的多肽、或多肽片段或变体，其中所述抗体包含，或者其组成为，由本发明的一个或多个抗酪氨酸激酶生物标志蛋白抗体表达细胞系所表达的重链或轻链中含有的一个、两个、三个或更多个VHCDR和一个、两个、三个或更多个VLCDR。具体地，本发明提供了这样的抗体，其免疫特异性结合酪氨酸激酶生物标志蛋白的多肽、多肽片段或变体，其中所述抗体包含，或者其组成为，由本发明一个或多个抗酪氨酸激酶生物标志蛋白抗体表达细胞系表达的重链或轻链中含有的VHCDR和VLCDR中的VHCDR1和VLCDR1，VHCDR1和VLCDR2，VHCDR1和VLCDR3，VHCDR2和VLCDR1，VHCDR2和VLCDR2，VHCDR2和VLCDR3，VHCDR3和VHCDR1，VHCDR3和VLCDR2，VHCDR3和VLCDR3，或其任意组合；或者由其组成。本发明还包括如下的分子，所述分子包含这些抗体或它们的可免疫特异性结合酪氨酸激酶生物标志蛋白的抗体片段或变体，或者由这样的抗体、抗体片段或变体组成。本发明还包括编码这些抗体、分子、片段和/或变体的核酸分子。
本发明还提供了编码本发明抗体(包括含有抗体片段或变体或由抗体片段或变体组成的分子)的核酸分子，它们通常是分离的。在一个具体实施方案中，本发明的核酸分子编码这样的抗体(包括含有抗体片段或变体或由抗体片段或变体组成的分子)，所述抗体包含或者其组成为具有由本发明抗酪氨酸激酶生物标志蛋白抗体表达细胞系表达的重链的任何一个VH结构域的氨基酸序列的VH结构域，和具有由本发明抗酪氨酸激酶生物标志蛋白抗体表达细胞系表达的轻链的氨基酸序列的VL结构域。在另一个实施方案中，本发明的核酸分子编码这样的抗体(包括含有抗体片段或变体或由抗体片段或变体组成的分子)，所述抗体包含或者其组成为具有由本发明的抗酪氨酸激酶生物标志蛋白抗体表达细胞系表达的重链的任何一个VH结构域的氨基酸序列的VH结构域，或者具有由本发明的抗酪氨酸激酶生物标志蛋白抗体表达细胞系表达的轻链的氨基酸序列的VL结构域。
本发明还提供了这样的抗体，其包含或者其组成为本文描述的抗体分子(例如VH结构域和/或VL结构域)的变体(包括衍生物)，所述抗体免疫特异性结合酪氨酸激酶生物标志蛋白或其片段或变体，例如Src酪氨酸激酶多肽。
可以使用本领域技术人员已知的标准技术，包括例如导致氨基酸替换的定点多核苷酸突变(mutapolynucleotidesis)和PCR介导的多核苷酸突变(PCR-mediated mutapolynucleotidesis)，在编码本发明分子的核苷酸序列中引入突变。优选地，该分子是免疫球蛋白分子。同样优选地，所述变体(包括衍生物)相对于参考VH结构域，VHCDR1，VHCDR2，VHCDR3，VL结构域，VLCDR1，VLCDR2，或VLCDR3，编码少于50个氨基酸替换、少于40个氨基酸替换、少于30个氨基酸替换、少于25个氨基酸替换、少于20个氨基酸替换、少于15个氨基酸替换、少于10个氨基酸替换、少于5个氨基酸替换、少于4个氨基酸替换、少于3个氨基酸替换，或者少于2个氨基酸替换。
“保守氨基酸替换”是指其中氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基取代的替换。具有带相似电荷的侧链的氨基酸的家族在本领域中已有定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有非带电的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。或者，可以在全部或部分编码序列上随机地引入突变，例如通过饱和多核苷酸突变(saturationmutapolynucleotidesis)。可以对最终突变体筛选生物活性，从而鉴定保留活性的突变体。
例如，有可能仅在抗体分子的框架区或者仅在CDR区引入突变。引入的突变可以是沉默的或中性错义突变，即对抗体结合抗原的能力没有影响或者影响很小。这些类型的突变可用于优化密码子使用，或者改善杂交瘤抗体的生产。或者，非中性错义突变可能改变抗体结合抗体的能力。大多数沉默和中性错义突变的位置很可能在框架区内，而大多数非中性错义突变的位置很可能在CDR内，尽管这不是绝对的要求。本领域的技术人员能够设计和测试具有期望性质，例如在抗原结合能力方面没有改变或者结合活性发生了改变(例如抗原结合活性的改进或抗体特异性的改变)，的突变分子。在多核苷酸突变之后，编码蛋白可以常规地加以表达，并可以用本文描述的技术或者通过本领域已知和通用的常规修饰技术对编码蛋白的功能和/或生物活性进行确定。
在一个具体的实施方案中，免疫特异性地结合蛋白酪氨酸激酶多肽或其片段或变体的本发明的抗体(包括含有抗体片段或变体或由抗体片段或变体组成的分子)，包含或者组成为如下所述的氨基酸序列编码该氨基酸序列的核苷酸序列可以和编码由本发明的一个或多个抗酪氨酸激酶生物标志蛋白抗体表达细胞系所表达的VH或VL结构域之一的核苷酸序列的互补核苷酸序列杂交，该杂交优选地在严格条件下进行，例如在大约45℃在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与结合于滤膜(filter-bound)的DNA杂交，随后在大约50℃-65℃在0.2xSSC/0.1％SDS中清洗一次或多次，优选地在高度严格的条件下进行，例如在大约45℃在6xSSC中与结合于滤膜的核酸杂交，随后在大约68℃在0.1xSSC/0.2％SDS中清洗一次或多次，或者在其他本领域技术人员已知的严格杂交条件下进行(见例如Ausubel，F.M.等编辑，当代分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology)，第1卷，GreenPublishing Associates公司和John Wiley & Sons公司，纽约，pp.6.3.1-6.3.6和2.10.3(1989))。本发明还包括编码这些抗体的核酸分子。
本领域众所周知的是，具有相似氨基酸序列的多肽或其片段或变体通常具有相似的结构和许多相同的生物活性。因此，在一个实施方案中，免疫特异性地结合蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽或酪氨酸激酶生物标志多肽的片段或变体的抗体(包括含有抗体片段或变体或由抗体片段或变体组成的分子)，包含或其组成为具有如下氨基酸序列的VH结构域，所述氨基酸序列与由本发明抗酪氨酸激酶生物标志蛋白抗体表达细胞系所表达的重链的VH结构域的氨基酸序列至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或者至少99％同一。
在另一个实施方案中，免疫特异性地结合蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽或酪氨酸激酶生物标志多肽的片段或变体的抗体(包括含有抗体片段或变体或由抗体片段或变体组成的分子)，包括或其组成为具有如下氨基酸序列的VL结构域，所述氨基酸序列与由本发明抗酪氨酸激酶生物标志蛋白抗体表达细胞系表达的重链的VL结构域的氨基酸序列至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或者至少99％同一。
本发明还提供了这样的抗体(包括含有抗体片段或变体或由抗体片段或变体组成的分子)，其可下调酪氨酸激酶生物标志蛋白的细胞表面表达，如用本领域已知的任何方法(例如FACS分析或免疫荧光测定)所确定的。作为非限制性的假说，这种下调可能是抗体诱导下的酪氨酸激酶生物标志蛋白内化(internalization)的结果。这些抗体可以包含或其组成为具有本发明抗体的氨基酸序列的VH或VL结构域的一部分(例如VHCDR1，VHCDR2，VHCDR3，VLCDR1，VLCDR2，或VLCDR3)，或其片段或变体。
在另一个实施方案中，下调酪氨酸激酶生物标志蛋白的细胞表面表达的抗体包含或其组成为如下所述的多肽该多肽具有本发明抗体的VH结构域或其片段或变体以及本发明抗体VL结构域或其片段或变体的氨基酸序列。在另一个实施方案中，下调酪氨酸激酶生物标志蛋白的细胞表面表达的抗体包含或其组成为如下所述的多肽该多肽具有来自单个本发明抗体(或者scFv或Fab片段)的VH结构域和VL结构域或其片段或变体的氨基酸序列。在另一个实施方案中，下调酪氨酸激酶生物标志蛋白的细胞表面表达的抗体包含或其组成为如下所述的多肽该多肽具有本发明的抗体的VH结构域或其片段或变体的氨基酸序列。在另一个实施方案中，下调酪氨酸激酶生物标志蛋白的细胞表面表达的抗体包含或其组成为如下所述的多肽该多肽具有本发明的抗体的VL结构域或其片段或变体的氨基酸序列。
在一个优选实施方案中，下调酪氨酸激酶生物标志蛋白的细胞表面表达的抗体包含或其组成为如下所述的多肽该多肽具有本发明抗体的VHCDR3或其片段或变体的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，下调酪氨酸激酶生物标志蛋白的细胞表面表达的抗体包含或其组成为如下所述的多肽该多肽具有本发明抗体的VLCDR3或其片段或变体的氨基酸序列。本发明还包括编码这些抗体的核酸分子。
在另一个优选实施方案中，提高酪氨酸激酶生物标志蛋白活性的抗体或其片段或变体，包含或其组成为如下所述的多肽该多肽具有本发明抗体的VLCDR3的多肽或其片段或变体的氨基酸序列。本发明还包括编码这些抗体的核酸分子。
作为非限制性实例，本发明的抗体可用于纯化、检测和靶定本发明的蛋白酪氨酸激酶多肽，同时包括体外和体内诊断、检测、筛选和/或治疗方法。例如，抗体已经用于免疫测定，用于定性或定量测量生物样品中src生物标志多肽的水平。(见例如Harlow等，抗体实验手册(AntibodiesALaboratory Manual)，第二版，冷泉港实验室出版社(1988)，在此通过提述纳入其全部内容)。
作为另一个非限制性实例，本发明的抗体可以作为被动免疫的形式施用给个体。或者，本发明的抗体可用于表位绘图(epitope mapping)，以鉴定被抗体结合的表位。用此方法鉴定的表位进而可以，例如，用作疫苗候选物，即用于免疫个体而引发产生针对天然存在形式的一种或多种酪氨酸激酶生物标志蛋白的抗体。
如下文将更详细讨论的，本发明的抗体可单独使用，或者与其他组合物组合使用。这些抗体可以进一步在N或C端重组融合异源多肽，或者化学缀合(包括共价和非共价缀合)到多肽或其他组合物上。例如，本发明的抗体可以重组融合或缀合到能在检测分析中用作标记的分子上，也可以连接到效应物分子，例如异源多肽、药物、放射性核素或者毒素。见例如PCT公开WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利No.5,314,995和EP 396,387。
本发明的抗体包括经过修饰的衍生物，即，通过向该抗体共价连接任何类型的分子进行修饰。例如，没有限制意义，抗体衍生物包括那些经过修饰的抗体，修饰方式例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、用已知的保护/封闭基团衍生、蛋白酶水解切割、与细胞配体或其他蛋白连接等。可通过已知的技术实施多种化学修饰中的任何一种，包括但不限于，特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，抗体衍生物可以包含一个或多个非经典氨基酸。
本发明的抗体可以用本领域已知的任何合适的方法产生。可以用各种本领域熟知的程序产生针对某种目的抗原或免疫原的多克隆抗体。例如，可以将本发明的酪氨酸激酶生物标志多肽或肽按照上文阐明的那样施加给各种宿主动物以诱导产生含有特异针对该生物标志抗原的多克隆抗体的血清。这取决于宿主物种，有多种佐剂可用于提高免疫应答；佐剂包括，但不限于，弗氏佐剂(完全和不完全)，矿物凝胶例如氢氧化铝，表面活性物质例如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、油乳液、钥孔戚血蓝蛋白、二硝基苯酚和可能可以用于人的佐剂，例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。这些佐剂也是本领域众所周知的。
单克隆抗体可以用很多种本领域已知的技术来制备，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术、或它们的组合。例如，单克隆抗体可以用本领域已知并通用的杂交瘤技术产生，所述技术的教导可见例如Kohler andMilstein，Nature，256495-497(1975)；Harlow等，AntibodiesA LaboratoryManual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)；和Hammerling，等，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，pp.563-681(1981)，在此通过提述纳入其全部内容。本文使用的术语“单克隆抗体”并不仅限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指从单个克隆衍生的抗体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不一定涉及产生它的方法。也可以使用涉及连续细胞系培养的技术。除了杂交瘤技术之外，其他的技术包括三源杂交瘤(trioma)技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，Immunol.Today，472(1983))，和EBV-杂交瘤技术(Cole等，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96(1985))。
使用杂交瘤技术产生和筛选特异抗体的方法是常规的并且是本领域熟知的。作为一个非限制性实例，可以用本发明的酪氨酸激酶多肽或肽，或其变体，或者用表达该多肽或肽或其变体的细胞，对小鼠进行免疫。一旦检测到免疫应答，例如在被免疫小鼠的血清中检测到特异针对该抗原的抗体，则收集脾脏并分离脾细胞。然后用众所周知的技术将脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞，例如来自可从

商购的细胞系SP2/0或P3X63-AG8.653的细胞融合。通过有限稀释技术对杂交瘤进行选择和克隆。然后用本领域熟知的方法对杂交瘤克隆进行测试，以确定并选择出那些分泌能够结合本发明多肽的抗体的细胞。可以通过用阳性杂交瘤克隆对小鼠进行免疫而产生腹水液，其一般含有高水平的抗体。
另一种用于产生多克隆和单克隆人B细胞系的公知技术是用EpsteinBarr病毒(EBV)进行转化。用于产生EBV转化的B细胞系的规程是本领域众所周知的，例如在Coligan等编辑的《当代免疫学方法》(CurrentProtocolsin Immunology)，John Wiley & Sons，NY(1994)，第7.22章列出的方案，在此通过提述纳入其全部内容。用于转化的B细胞的来源一般是人外周血，但是用于转化的B细胞也可以获自其他的来源，包括但不限于，淋巴结、扁桃腺、脾脏、肿瘤组织和被感染组织。在EBV转化之前，一般将组织制备成单细胞悬液。此外，对于在B细胞样品中可能存在的T细胞，可以物理清除或者使其失活(例如通过用环孢菌素A处理)。清除T细胞经常是有利的，因为来自抗EBV抗体血清阳性的个体的T细胞会抑制EBV对B细胞的永生化。一般地，用EBV接种含有人B细胞的样品并培养3-4周。EBV的典型来源之一是B95-8细胞系(ATCC；VR-1492)的培养物上清。EBV转化的物理征象一般可以在3-4周培养期之末看到。
通过相差显微镜，被转化细胞显示大而清晰并且“多毛”，它们趋向于聚集成紧密的细胞团。开始时，EBV系一般是多克隆的。然而，随着细胞培养时期的延长，EBV系会由于特定B细胞克隆的选择性优势生长(selectiveoutgrowh)而变成单克隆。或者，可以将多克隆的EBV转化系亚克隆(例如通过有限稀释)或与合适的融合配偶融合，并以有限的稀释度铺板，以获得单克隆B细胞系。对于EBV转化细胞系合适的融合配偶包括小鼠骨髓瘤细胞系(例如2/0，X63-Ag8.653)，异源骨髓瘤细胞系(人x小鼠；例如SPAM-8，SBC-H20和CB-F7)、和人细胞系(例如GM 1500，SKO-007，RPMI 8226和KR-4)。因此，本发明还包括产生针对本发明蛋白酪氨酸激酶多肽或肽或其片段的多克隆或单克隆人抗体的方法，包括对人B细胞进行EBV转化。
识别特定表位的抗体片段可以用已知的技术产生。例如本发明的Fab和F(ab′)2片段可以通过用酶，例如木瓜蛋白酶(用于产生Fab片段)或胃蛋白酶(用于产生F(ab′)2片段)，对免疫球蛋白分子进行蛋白酶水解切割来产生。F(ab′)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。
本发明涵盖的抗体还可以用各种本领域已知的噬菌体展示技术产生。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域被展示在携带有编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。在一个具体的实施方案中，这种噬菌体可用于展示由全抗体库(repertoire)或组合抗体库(例如人或鼠的)表达的抗原结合域。对于表达与目的抗原结合的抗原结合域的噬菌体，可以用抗原加以选择或鉴定，例如使用标记抗原或者被结合或俘获到固体表面或球珠上的抗原。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括由如下噬菌体表达的fd和M13结合区，在该噬菌体中Fab、Fv或二硫键稳定化的抗体结构域被重组融合到噬菌体的多核苷酸III或多核苷酸VIII蛋白。可用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的实例包括在下列文献中公开的那些Brinkman等，J.Immunol.Methods，18241-50(1995)；Ames等，J.Immunol.Methods，184177-186(1995)；Kettleborough等，Eur.J.Immunol.，24952-958(1994)；Persic等，Gene，1879-18(1997)；Burton等，Advances in Immunology，57191-280(1994)；PCT公开No.PCT/GB91/01134；PCT公开WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利No5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743及5,969,108，在此通过提述纳入它们各自的全部内容。
如上面参考文献中描述的，在噬菌体选择之后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区并用来产生完整抗体，包括人抗体，或者任何其他期望的抗原结合片段，并可以在任何期望的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如将在下文中详细描述的。
可用于产生单链Fv和抗体的技术实例包括在如下文献中描述的那些美国专利No4,946,778和5,258,498；Huston等，Methods in Enzymology，20346-88(1991)；Shu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，907995-7999(1993)；和Skerra等，Science，2401038-1040(1988)。对于一些应用，包括抗体在人体的体内应用和在检测试验中的体外应用，可优选使用嵌合、人源化或人抗体。嵌合抗体是这样的一种分子，其中抗体的不同部分来自于不同的动物物种，例如具有得自于鼠源单克隆免疫球蛋白的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。(见例如Gillies等，J.Immunol.Methods，125191-202(1989)；和美国专利No 5,807,715；4,816,567；和4,816,397，在此通过提述纳入其全部内容)。
人源化抗体是来自于非人物种的抗体分子，其结合期望的抗原并具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)和来自于人免疫球蛋白分子的框架区。通常，人框架区内的框架残基被来自供体抗体的CDR和框架区的相应残基替代，从而改变(优选提高)抗原结合。这些框架替代是用本领域熟知的方法来鉴定的，例如通过对CDR和框架残基的相互作用的建模来鉴定对抗原结合重要的框架残基，及通过序列比较来鉴定特定位置的非常见框架残基。(见例如Queen等，美国专利No.5,693,762和5,585,089；和Riechmann等，Nature，332323(1988)，在此通过提述纳入其全部内容)。抗体可以用本领域已知的多种技术加以人源化，包括例如CDR-移植(EP239,400；PCT公开WO 91/09967；美国专利No.5,225,539；5,530,101；和5,585,089)；镶饰(veneering)或表面重塑(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology，28(4/5)489-498(1991)；Studnicka等，ProteinEngineering，7(6)805-814(1994)；Roguska等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91969-973(1994))；和链改组(chain shuffling)(美国专利No.5,565,332)。
完全人抗体可以通过多种本领域已知的方法来制备，包括上文描述的噬菌体展示方法，其使用从人免疫球蛋白序列衍生的抗体文库。另见美国专利No.4,444,887和4,716,111；和PCT公开WO 98/46645，WO 98/50433，WO 98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，WO 96/33735，和WO 91/10741；在此通过提述并入每一篇文献的全部内容。
完全人抗体尤其宜于人类患者的治疗，用以避免或减轻对外来蛋白的免疫反应。人抗体可以用本领域已知的各种方法加以制备，包括上文描述的噬菌体展示方法，其使用从人免疫球蛋白序列衍生的抗体文库。另见美国专利Nos.4,444,887和4,716,111；和PCT公开WO 98/46645，WO 98/50433，WO 98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，WO 96/33735，和WO 91/10741；在此通过提述并入每一篇文献的全部内容。
人抗体还可以使用转基因小鼠来产生，所述转基因小鼠不能表达有功能的内源免疫球蛋白，但能够表达人免疫球蛋白多核苷酸。例如，可以将人重链和轻链免疫球蛋白多核苷酸复合体随机地或通过同源重组引入到小鼠胚胎干细胞。或者，除了人重链和轻链多核苷酸之外，还可以将人可变区、恒定区和多样性区引入到小鼠胚胎干细胞中。可以使小鼠重链和轻链免疫球蛋白多核苷酸去功能化，该去功能化可以和通过同源重组进行的人免疫球蛋白座位的引入分别或同时地进行。具体地，纯合删除JH区可防止内源抗体的产生。将经过修饰的胚胎干细胞扩增后微注射到胚泡中，以产生嵌合小鼠。然后对该嵌合小鼠进行育种以产生表达人抗体的纯合后代。用所选抗原，例如本发明的全部或部分多肽，按照通常的方式免疫转基因小鼠。
因此，使用这种技术，有可能产生有用的人IgG，IgA，IgM，IgD和IgE抗体。关于生产人抗体的技术的概述，见Lonberg and Huszar，Intl.Rev.Immunol.，1365-93(1995)。关于生产人抗体和人单克隆抗体的技术以及这些抗体的生产规程的详细讨论，见例如PCT公开WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；欧洲专利No.0 598 877；美国专利No.5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；5,939,598；6,075,181；和6,114,598，在此通过提述纳入其全部内容。此外，可以与有些公司，例如Abgenix，Inc.(Fremont，CA)，Protein DesignLabs，Inc.(Mountain View，CA)和Genpharm(San Jose，CA)，洽谈使用上文描述的技术的类似技术提供针对所选抗原的人抗体。
识别所选表位的完全人抗体可以用一种称作“导向筛选”的技术加以产生。在此方法中，使用选定的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，来指导可识别相同表位的完全人抗体的选择。(Jespers等，BioTechnology，12899-903(1988))。
进一步，使用本领域技术人员熟知的技术，可以进而用针对本发明酪氨酸激酶多肽的抗体产生抗独特型抗体，这样的抗体可“模拟”本发明的蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽(见例如Greenspan and Bona，FASEB J.，7(5)437-444(1989)和Nissinoff，J.Immunol.，147(8)2429-2438(1991))。例如，可以用结合并且竞争性抑制本发明多肽多聚化和/或与配体的结合的抗体来产生抗独特型，抗独特型“模拟”所述多肽的多聚化和/或结合区，因此可结合并中和所述多肽和/或其配体，例如在治疗方案中。这种具有中和能力的抗独特型或该抗独特型的Fab片段可用于中和多肽配体。例如，可以用这些抗独特型抗体来结合本发明的多肽和/或结合其配体/受体，借此激活或阻断其生物活性。
胞内抗体(intrabodies)是如下的抗体，通常是scFv它们由重组核酸分子表达，并经过工程化而被保留在细胞内(例如，保留在宿主细胞的细胞质、内质网或胞外周质中)。胞内抗体可用于，例如，消除胞内抗体所结合的蛋白的功能。胞内抗体的表达还可以通过使用包含编码该胞内抗体的核酸的核酸表达载体中的可诱导启动子进行调节。本发明的胞内抗体可以用本领域已知的方法产生，例如在下列文献中公开和综述的Chen等，Hum.Polynucleotide Ther.，5595-601(1994)；Marasco，W.A.，Polynucleotide Ther.，411-15(1997)；Rondon and Marasco，Annu.Rev.Microbiol.，51257-283(1997)；Proba等，J.Mol.Biol.，275245-253(1998)；Cohen等，Oncogene，172445-2456(1998)；Ohage and Steipe，J.Mol.Biol.，2911119-1128(1999)；Ohage等，J.Mol.Biol.，2911129-1134(1999)；Wirtz and Steipe，Protein Sci.，82245-2250(1999)；和Zhu等，J.Immunol.Methods，231207-222(1999)。
优选地利用转基因小鼠制备根据本发明的

Technology抗体，所述转基因小鼠基因组内插入了人抗体产生基因组的实质部分，并被赋予了内源鼠抗体产生缺陷(例如可以从Abgenix Inc.，Fremont，CA商业获得的

株系)。这种小鼠能够产生人免疫球蛋白分子，而实际上缺少鼠免疫球蛋白分子的产生。用于实现这些目的的技术在本文公开的专利、专利申请和参考文献中有公开。
人们能够在YAC中克隆和重建百万碱基大小的人源座位并将它们引入到小鼠种系中，这为非常大或者定位不精确的座位的功能组件的阐明，以及有用的人类疾病模型的构建提供了一种有力的手段。而且，使用这种用人源等价物替代小鼠座位的技术，提供了一种独特的视角来考察发育过程中人多核苷酸产物的表达和调节，它们与其他系统的联系，以及其在疾病诱发和进展中的作用。这种策略的一个重要实际应用是小鼠体液免疫系统的“人源化”。通过将人免疫球蛋白(Ig)座位引入到内源Ig多核苷酸已经被失活的小鼠体内，人们就有机会研究抗体程序性表达和组装的内在机理以及其在B细胞发育中的作用。而且，这种策略可能为产生完全人源的单克隆抗体(Mab)—这是实现人体疾病的抗体疗法目标的阶段性标志—提供一种理想的来源。
完全人源抗体预期可以使小鼠源或小鼠源衍生的单克隆抗体固有的免疫原性反应和过敏性反应最小化，从而提高所施用抗体的效力和安全性。可预期在需要重复施用抗体的慢性和复发性人类疾病如癌症中，完全人源抗体的使用将提供很大的好处。
实现这个目标的一个途径是对具有鼠抗体产生缺陷的小鼠株系进行工程化，使之带有大片段的人Ig座位，预期这些小鼠会产生种类齐全的人抗体库而没有小鼠抗体。人Ig大片段可保留大的可变多核苷酸多样性以及抗体产生和表达的合适调节。通过利用小鼠的抗体多样化和选择机制，及其对人蛋白质的免疫耐受性的缺乏，在这些小鼠株系中重建的人抗体库应能产生针对任何目的抗原，包括人抗原，的高亲和性抗体。利用杂交瘤技术，可以容易地产生和选择具有期望特异性的抗原特异性人单克隆抗体。
这种一般策略已经在1994年公开的第一个“

T”株的生产中有过描述，见Green等，Nature Genetics，713-21(1994)。该

株被酵母人工染色体(YAC)工程化，这些YAC含有分别为245kb和10,190kb大小的人重链座位和kappa轻链座位种系构型片段(germline configuration fragment)，所述片段含有核心可变区和恒定区序列(见上文)。该含有人Ig的YACs被证明在抗体重排和表达方面能够与小鼠系统兼容，并且能够替代被失活的小鼠Ig多核苷酸。这体现在它们能够诱导B细胞发育，产生成人样全人源抗体库，及产生抗原特异性人源单克隆抗体。这些结果还表明，若引入含有更多V多核苷酸、额外调节元件和人Ig恒定区的更大的人Ig座位部分，也许能基本上再现人体对感染和免疫的体液应答的特征性的全套抗体。Green等的工作最近被推进到通过分别使用百万碱基大小的、种系构型的人重链座位和kappa轻链座位YAC片段，引入人抗体库的超过大约80％，产生了

小鼠。见Mendez等，Nature Genetics，15146-156(1997)；Green and Jakobovits，J.Exp.Med.，188483-495(1998)；和Green，Journal of Immunological Methods，23111-23(1999)，在此通过提述纳入其全部内容。
人抗鼠抗体(HAMA)应答促成了嵌合或者人源化抗体的产业制备。尽管嵌合抗体通常由人源恒定区和鼠源可变区组成，但是可以预期，仍然会见到一些人抗嵌合抗体(HACA)应答，特别是在涉及长期或多剂量使用抗体的治疗中。因此，理想的是，提供针对蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的完全人源抗体，以削弱HAMA或HACA应答的担忧和/或影响。
本发明的抗体可以化学合成，或者通过使用重组表达系统产生。因此，本发明进一步包括多核苷酸，其包括编码本发明抗体或其片段的核苷酸序列。本发明还包括这样的多核苷酸，其可以在严格或较低严格杂交条件下，例如前文中定义的，与编码抗体，优选特异结合本发明蛋白酪氨酸激酶多肽的抗体，更优选结合具有一个或多个表2中所示的蛋白酪氨酸激酶生物标志序列(例如Src酪氨酸激酶生物标志)的氨基酸序列的多肽的抗体，的多核苷酸杂交。
该多核苷酸获得以及该多核苷酸的核苷酸序列的测定可以通过本领域已知的方法。例如，如果抗体的核苷酸序列已知，那么编码该抗体的核苷酸序列可以用化学合成的寡核苷酸组装而成(例如在Kutmeier等，BioTechniques，17242(1994)中描述的)，简而言之，其包括合成含有该抗体编码序列的部分的重叠寡核苷酸，将那些寡核苷酸退火和连接，然后通过PCR对已连接的寡核苷酸进行扩增。
或者，编码抗体的多核苷酸可以由合适来源的核酸产生。如果不能获得含有编码特定抗体的核酸的克隆，但是该抗体分子的序列已知，那么可以化学合成或者从合适的来源获得编码该免疫球蛋白的核酸，所述来源例如抗体cDNA文库或者从表达该抗体的任何组织或细胞产生的cDNA文库，或从表达该抗体的任何组织或细胞分离的核酸，优选poly A+RNA；所述表达该抗体的组织或细胞包括例如可以表达本发明抗体的杂交瘤，其是通过用可以和该序列3’和5’端杂交的合成引物进行PCR扩增选择出来的。或者，可以使用特异针对待鉴定的特定多核苷酸序列的寡核苷酸探针，例如来自编码期望抗体的cDNA文库的cDNA克隆，进行克隆。随后使用任何本领域熟知的方法，将通过PCR产生的扩增核酸亚克隆到可以复制的克隆载体中。
一旦确定本发明抗体的核苷酸序列和相应的编码氨基酸序列，就可以用本领域熟知的用于操作核苷酸序列的方法，例如重组DNA技术、定点多核苷酸突变技术、PCR等，对抗体的核苷酸序列进行操作(见例如在下列文献中描述的技术，Sambrook等《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)第二版，冷全港实验室，冷泉港，NY(1990)；和F.M.Ausubel等编，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1998)，在此通过提述纳入其全部内容)，从而产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸替换、删除和/或插入。
在一个具体的实施方案中，可以用本领域熟知的方法对重链和/或轻链可变区的氨基酸序列进行检查以鉴定CDR序列，例如通过与其他重链和轻链可变区的已知氨基酸序列比较，从而确定序列高可变性区域。使用常规的重组DNA技术，可以将一个或多个CDR插入到框架区，例如插入到人框架区，从而将非人抗体人源化，如前文中描述的。该框架区可以是自然发生的，也可以是共有框架区(consensus framework regions)，优选是人框架区(见例如Chothia等，J.Mol.Biol.，278457-479(1998)中的一组人框架区)。
优选地，通过组合框架区和CDR产生的多核苷酸编码可特异结合本发明蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的抗体。另外，优选地，如前文中讨论的，可以在框架区内制造一个或多个氨基酸替换；实施这种氨基酸替换的目的是提高抗体与其抗原的结合，例如更大的抗体结合亲和力。此外，可以通过这些方法，用氨基酸替换或删除一个或多个参与链内二硫键的可变区半胱氨酸残基，从而产生缺乏一个或多个链内二硫键的抗体分子。其他可以对多核苷酸进行的改变也包含在本发明的范围内，并且是本领域的技术可实现的。
对于某些应用，例如对于本发明抗体的体外亲和性成熟，可使用前文描述的噬菌体展示方法将本发明的一个或多个抗体的重链和轻链的VH和VL结构域在噬菌体展示库中表达为单链抗体，或者Fab片段。例如，可以用噬菌体展示库以全部可能的组合表达编码本发明一个或多个抗体的重链和轻链的VH和VL结构域的cDNA，这样就有可能选择出拥有较优的结合特性(例如更高的亲和力或更好的解离速率)的结合根据本发明的蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的VH/VL组合。此外，VH和VL片段，尤其是本发明一个或多个抗体的VH和VL结构域的CDR区，可以被体外突变。通过在噬菌体展示库中表达具有“突变”CDR的VH和VL结构域，有可能选择出结合蛋白酪氨酸激酶生物标志例如Src酪氨酸激酶生物标志蛋白的VH/VL组合，它们是具有较优的结合特性(例如更高的亲和力或改进的解离速率)的受体多肽。
一旦通过动物、化学合成或重组表达产生了本发明的抗体分子，就可以用任何本领域已知的用于纯化免疫球蛋白或多肽分子的方法加以纯化，例如通过色谱(例如离子交换、亲和，特别是通过对特定抗原的亲和、蛋白A、和大小分级柱色谱(sizing column chromatography))，离心，差别溶解度，或通过任何其他用于纯化蛋白的标准技术。此外，本发明的抗体或其片段可以融合于本文描述的或者本领域已知的异源多肽序列以方便纯化。
本发明包括与本发明多肽(或其部分，优选该多肽的至少10，20，30，40，50，60，70，80，90或100个氨基酸)重组融合或化学偶联(包括共价和非共价偶联)以产生融合蛋白的抗体。该融合不必是直接的，而是可以通过接头序列来实现。抗体可以对除本发明多肽(或其部分，优选该多肽的至少10，20，30，40，50，60，70，80，90或100个氨基酸)之外的抗原特异。例如，通过将本发明的多肽融合或偶联到对特定细胞表面受体特异的抗体上，可利用抗体将本发明的多肽在体外或体内靶定到特定的细胞类型。
本发明进一步包括组合物，其包含与除可变区之外的抗体结构域融合或偶联的本发明的蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽。例如，本发明的多肽可以融合或偶联到抗体Fc区或其部分。与本发明多肽融合的抗体部分可以包括恒定区、铰链区、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、或全部结构域或其部分的任意组合。多肽还可以融合或偶联到上述抗体部分而形成多聚体。例如，与本发明多肽融合的免疫球蛋白分子Fc部分可以通过Fc部分之间的二硫键联而形成二聚体。更高的多聚体形式可以通过将多肽与IgA和IgM的部分融合来制备。用于将本发明多肽与抗体部分融合或偶联的方法是本领域已知的(见例如美国专利No.5,336,603；5,622,929；5,359,046；5,349,053；5,447,851；5,112,946；EP 307,434；EP 367,166；PCT公开WO96/04388；WO 91/06570；Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8810535-10539(1991)；Zheng等，J.Immunol.，1545590-5600(1995)；和Vil等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8911337-11341，通过提述纳入其全部内容)。
如前文讨论的，可以用本领域已知的方法将多肽与上述抗体部分融合或偶联，以提高该多肽的体内半衰期或者便于在免疫测定中使用，其中上述多肽对应于表2中所示的一个或多个蛋白酪氨酸激酶生物标志氨基酸序列的多肽、多肽片段或变体。进一步，对应于表2中所示的一个或多个蛋白酪氨酸激酶生物标志(例如src生物标志)的序列的多肽可以融合或偶联到上述抗体部分，以便于纯化。关于指导，已经有人描述了具有人CD4多肽前两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链恒定区的各个结构域的嵌合蛋白(EP 394,827；Traunecker等，Nature，33184-86(1988))。具有二硫键连接二聚体结构(由于IgG)的与抗体融合或偶联的本发明多肽或其片段还可能在结合和中和其他分子方面比单独的单体分泌蛋白或蛋白片段更有效(Fountoulakis等，J.Biochem.，2703958-3964(1995))。在许多情况下，融合蛋白的Fc部分在治疗、诊断和/或筛选方法中是有利的，因此能够导致，例如，改善的药代动力学性质(EP 232,262 A)。在药物发现中，例如，已经将人蛋白如huIL-5与Fc部分融合，用于鉴定huIL-5的拮抗剂的高通量筛选试验的目的。(见Bennett等，J.Molecular Recognition，852-58(1995)；and Johanson等，J.Biol.Chem.，2709459-9471(1995))。或者，在对融合蛋白进行表达、检测和纯化之后删除Fc部分可能是理想的。例如，如果将融合蛋白用作免疫的抗原，Fc部分可能会妨碍治疗和诊断。
而且，本发明的抗体或其片段可以和标志序列(例如肽)融合，以便于其纯化。在优选实施方案中，标志氨基酸序列是六聚组氨酸肽，例如在pQE载体(QIAGEN，Inc.，Chatsworth，CA)等中提供的标签，其中许多是可商购的。如Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86821-824(1989)中描述的，例如，六组氨酸可以方便融合蛋白的纯化。其他有用于纯化的肽标签包括，但不限于，″HA″标签，其对应于衍生自流感凝血素(HA)蛋白的表位(Wilson等，Cell，37767(1984))，以及″flag″标签。
本发明进一步包括与诊断或治疗剂偶联的抗体或其片段。该抗体可以诊断性地用于，例如，监视肿瘤的发生或进展，作为临床测试程序(例如用于确定给定治疗方案的效力的临床测试程序)的一部分。通过将抗体与可检测的物质偶联可以便于检测。可检测物质的非限制性实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、使用各种正电子发射层析成像的正电子发射金属，和非放射性顺磁金属离子。可检测的物质可以用本领域已知的技术直接与抗体(或其片段)偶联或缀合，或者通过中介物(例如本领域已知的接头)间接地偶联或缀合。(关于与可与抗体偶联用于根据本发明的诊断的金属离子，见美国专利No.4,741,900)。
合适酶的非限制性实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的非限制性实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的非限制性实例包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的非限制性实例包括鲁米诺；生物发光材料的非限制性实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白(aequorin)；合适放射性材料的非限制性实例包括碘(125I，131I)、碳(14C)、硫(3sus)、氚(3H)、铟(111In和铟的其他放射性同位素)、锝(99Tc，99mTc)、铊(20′Ti)、镓(68Ga，67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(19F)、153Sm、177Lu、Gd、放射性Pm、放射性La、放射性Yb、166Ho、90Y、放射性Sc、放射性Re、放射性Re、142Pr、105Rh和97Ru。
在具体的实施方案中，本发明的蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽被附接于大环螯合剂，大环螯合剂可以用来将放射性离子，包括但不仅限于，111In，177Lu，90Y，166Ho，和153Sm，偶连到多肽。在一个优选实施方案中，附接在本发明蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽上的大环螯合剂的相关放射性离子是111In。在另一个优选实施方案中，附接在本发明蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽上的大环螯合剂的相关放射性离子是90Y。在具体实施方案中，大环螯合剂是1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(DOTA)。在其他具体实施方案中，DOTA通过接头分子附接在本发明的蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽上。
可用于将DOTA偶联于多肽的接头分子的实例是本领域通常知道的(见例如DeNardo等，Clin.Cancer Res.，4(10)2483-2490(1998)；Peterson等，Bioconjug.Chem.，10(4)553-557(1999)；和Zimmerman等，Nucl.Med.Biol.，26(8)943-950(1999)，在此通过提述纳入其全部内容)。此外，美国专利No.5,652,361和5,756,065公开了能够与抗体偶联的螯合剂和用于制作和使用它们的方法，在此通过提述纳入其全部内容。尽管美国专利No.5,652,361和5,756,065关注的是将螯合剂偶联于抗体，但是本领域的技术人员能够容易地对其中公开的方法进行改造，以便将螯合剂与其他多肽偶联。
抗体还可以附接到固体支持物上，其对于靶抗原的免疫测定或纯化是特别有用的。这些固体支持物包括，但不限于，玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。用于将治疗模块与抗体偶联的技术是众所周知的，见例如Arnon等，″Monoclonal Antibodies ForImmunotargeting of Drugs in Cancer Therapy″，Monoclonal Antibodies AndCancer Therapy，Reisfeld等编，Alan R.Liss，Inc.，pp.243-256(1985)；Hellstrom等，″Antibodies For Drug Delivery″，Controlled Drug Delivery，2ndEd.，Robinson等编，Marcel Dekker，Inc.，pp.623-653(1987)；Thorpe，″Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer TherapyA Review″，Monoclonal Antibodies′84Biological And Clinical Applications，Pinchera等编，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，and Future Prospective of theTherapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，MonoclohalAntibodies for Cancer Detection and Therapy，Baldwin等编，Academic Press，pp.303-316(1985)；和Thorpe等，″The Preparation and Cytotoxic Properties ofAntibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.，62119-158(1982)。或者，抗体可以偶联另一抗体从而形成抗体异源偶联物(heteroconjugate)，例如授予Segal的美国专利4,676,980中描述的，在此通过提述纳入其全部内容。抗体，即对本发明蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽特异的抗体，无论有还是没有与之偶联的治疗模块，可以用作治疗剂，既可以单独施用，也可以和细胞毒因子和/或细胞因子组合施用。
本发明的抗体可以进一步用于对细胞系和生物样品进行免疫分型。本发明的蛋白酪氨酸激酶生物标志编码多核苷酸的翻译产物可以用作细胞特异标志，或者更具体地，用作在特定细胞类型的分化和/或成熟的各个阶段具有差异表达的细胞标志。针对特定的表位或表位组合的单克隆抗体可用于筛选表达该标志的细胞群体。采用单克隆抗体的各种技术可以用于筛选表达该标志的细胞群体，包括使用抗体包被磁珠的磁分离，用附着在固体基质(即组织培养板)上的抗体进行“淘选”，和流式细胞术(见例如美国专利No.5,985,660；Morrison等，Cell，96737-749(1999)；和L.J.Wysocki and V.L.Sato，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75(6)2844-2848(1978))。
这些技术允许筛选特定细胞群体，例如血液恶性疾病中可能发现的(即急性白血病患者中的微小残留病变(MRD))，和移植中的“非自身”细胞，以防止移植物抗宿主病(GVHD)。或者，这些技术允许筛选能够进行增殖和/或分化的造血干细胞和祖细胞，例如可能在人脐带血中发现的。
可以用任何本领域已知的方法对根据本发明的抗体的免疫特异性结合进行测试。可以使用的免疫测定包括但不限于竞争和非竞争性测试系统，它们使用例如BIAcore分析、FACS(荧光激发细胞分选仪)分析、免疫荧光、免疫细胞化学、Western印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”(sandwich)免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应(gel diffusion precipitin reaction)、免疫扩散测定(immunodiffusionassays)、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测量测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定等技术，还有很多。这些测定是本领域常规的，众所周知的，并且通用的(见例如Ausubel等编辑，《当代分子生物学实验方案》(CurrentProtocols in Molecular Biology)第一卷，John Wiley & Sons，Inc.，New York(1994)，在此通过提述纳入其全部内容)。下文将对非限制性示例免疫测定进行简单的描述。
免疫沉淀方案一般包括，在添加了蛋白磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如EDTA、PMSF、抑肽酶、钒酸钠)的裂解缓冲液例如RIPA缓冲液(即，1％NP-40或Triton X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，0.15M NaCl，0.01M磷酸钠，pH 7.2，1％

)中，裂解细胞群体；将目标抗体添加到细胞裂解物中；在4℃温育一定时间(例如1-4个小时)；向细胞裂解物添加蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠子；在4℃温育大约60分钟或者更长时间；在裂解缓冲液中清洗珠子；和在SDS/样品缓冲液中重新悬浮珠子。目标抗体免疫沉淀特定抗原的能力可以通过例如Western印迹分析加以测定。本领域的技术人员知道可以调节哪些参数来提高抗体与抗原的结合以及降低背景(例如用琼脂糖珠子对细胞裂解物进行预澄清(pre-clearing))。关于免疫沉淀规程的进一步的讨论，见例如Ausubel等编辑，《当代分子生物学实验方案》(Current Protocols in Molecular Biology)第一卷，John Wiley & Sons，Inc.，NewYork(1994)。
Western印迹分析一般包括，制备蛋白样品；在聚丙烯酰胺凝胶(例如8％-20％SDS PAGE，这取决于抗原的分子量)上进行电泳；将蛋白样品从聚丙烯酰胺凝胶转移到膜上，例如硝酸纤维素、PVDF或尼龙膜上；在封闭液(例如含3％BSA或脱脂牛奶的PBS)中对膜进行封闭；在清洗缓冲液(例如PBS-Tween 20)中对膜进行清洗；用在封闭液中稀释过的第一抗体(目标抗体)封闭膜；用清洗缓冲液清洗膜；用在封闭液中稀释过的与酶性底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如32p或125I)偶联的第二抗体(其识别第一抗体，例如抗人抗体)对膜进行封闭；在清洗缓冲液中对膜进行清洗；和检测被结合抗原的存在。本领域的技术人员知道可以调节哪些参数来提高信号检测和降低背景噪音。关于Western印迹规程进一步的讨论，见例如Ausubel等编辑，《当代分子生物学实验方案》(Current Protocols inMolecular Biology)第一卷，John Wiley & Sons，Inc.，New York(1994)。
ELISA包括制备抗原；用抗原包被96孔微量滴定板的孔；向孔内添加与可检测化合物例如酶性底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)偶联的目标抗体；温育一段时间；和检测抗原的存在。在ELISA中，目标抗体不一定必须和可检测化合物偶联；作为替代，可以向孔内添加与可检测化合物偶联的第二抗体(其可识别结合在抗原上的目标抗体)。此外，如果不用抗原包被孔，则可以首先将抗体包被于孔上。在这种情况下，可以在添加目的抗原后，向由抗体包被的孔中添加与可检测化合物偶联的第二抗体。本领域的技术人员知道可以调节哪些参数来提高被检测的信号，以及其他本领域已知的ELISA变量。关于ELISA进一步的讨论，见例如Ausubel等编辑，《当代分子生物学实验方案》(Current Protocols in Molecular Biology)第一卷，John Wiley & Sons，Inc.，New York(1994)。
抗体与抗原的结合亲和力以及抗体-抗原相互作用的解离速率(off-rate)可以用竞争结合测定加以确定。竞争性结合测定的一个实例是放射免疫测定，其包括在递增量的标记抗原的存在下温育标记抗原(例如3H或125I)或其片段或变体与目标抗体，并检测与标记抗原结合的抗体。目标抗体对蛋白酪氨酸激酶生物标志的亲和性和结合解离速率可以由该数据通过Scatchard作图分析加以确定。使用放射免疫测定还可以确定与另一抗体的竞争。在这种情况下，在递增量的非标记的另一抗体的存在下将酪氨酸激酶生物标志蛋白与偶联了标记化合物(例如用3H或125I标记的化合物)的目标抗体一起温育。这种两个抗体间的竞争测定还可用于确定两个抗体是与抗原上的同一表位结合还是与不同的表位结合。
在一个优选实施方案中，使用BIAcore动力学分析确定抗体(包括其抗体片段或变体)与酪氨酸激酶生物标志蛋白或酪氨酸激酶生物标志蛋白的片段的结合速率和解离速率。动力学分析包括分析抗体在表面固定有酪氨酸激酶生物标志蛋白的芯片上的结合和解离。
可以进一步理解，上述用于产生、表达、分离和操作抗体分子的技术，例如通过涉及分子生物学的重组技术以及其他与多核苷酸和蛋白质分析相关的技术，根据本发明的各种实施方案，适用于其他如本文描述的本发明多肽或肽分子，尤其是适用于酪氨酸激酶生物标志多肽或肽本身(视情况或需要而定)。
本发明还包括试剂盒，用于确定、预测或预后患有疾病的患者对药物的敏感性或耐药性，所述疾病特别是癌症或肿瘤，优选前列腺癌或肿瘤。这些试剂盒可在临床情境中用于测试患者的活检肿瘤或癌症样品，以便，例如，确定或预测患者的肿瘤或癌症对使用药物、化合物、化疗剂或生物作用剂的特定处理或治疗是耐药还是敏感。试剂盒中提供了预测子系列、位于合适容器内的用于测试来自患者组织的细胞或患者样品的耐药性/敏感性的调节化合物、和使用说明书；所述预测子系列包括与在特定生物系统中对蛋白酪氨酸激酶调节物(特别是蛋白酪氨酸激酶抑制剂)的耐药性和敏感性相关的多核苷酸，并且优选地包括微阵列。这些试剂盒所涵盖的预测子系列包含与对包括下列物质在内的蛋白酪氨酸激酶调节物的耐药性和敏感性相关的多核苷酸Src酪氨酸激酶家族的成员，例如Src，Fgr，Fyn，Yes，Blk，Hck，Lck和Lyn，以及其他蛋白酪氨酸激酶，包括Bcr-abl，Jak，PDGFR，c-kit和sEph受体。
另外，如上文解释的，该试剂盒不仅限于微阵列，还可以涵盖能同时在mRNA和蛋白质水平测定和/或监视预测子/标志多核苷酸的表达的多种方法和系统，例如通过PCR测定，如RT-PCR；和免疫测定，如ELISA。在用于实施PCR或原位杂交的试剂盒中，例如，除了实施该方法所必需的缓冲液和试剂以及使用说明书之外，还包括来自一个或多个预测子多核苷酸序列(例如本文描述的那些)的核酸引物或探针。在用于实施免疫测定，例如ELISA、免疫印迹测定等的试剂盒中，除了实施该方法必需的缓冲液和试剂以及使用说明书之外，还提供针对本发明蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽或其抗原性肽或免疫原性肽的抗体或其可结合部分。根据本发明的试剂盒还可包括如表2中所示的预测子多核苷酸和/或如本文表3、4或5中提供的一种或多种特定的预测子多核苷酸亚系列。
在另一个实施方案中，本发明包括本文鉴定的那些预测子多核苷酸中可用作疾病治疗的药物疗法开发的靶标的一个或多个多核苷酸的应用。这些靶标可能尤其适用于治疗前列腺疾病，例如前列腺癌或肿瘤。确实，因为这些预测子多核苷酸在敏感细胞和耐药细胞中的表达有差异，它们的表达模式与细胞对可以与蛋白酪氨酸激酶相互作用且抑制蛋白酪氨酸激酶的化合物的治疗的相对内在敏感性相关。因此，在耐药细胞中高表达的多核苷酸可以作用开发用于对蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物(例如Src酪氨酸激酶抑制剂)耐药的肿瘤的药物的靶标。
在另一个实施方案中，本发明包括反义和/或siRNAi试剂，作为本发明预测子多核苷酸的特异调节物。在具体的实施方案中，根据本发明的拮抗剂是对应于SEQ ID NO1-176中提供的一个或多个序列中含有的序列或其互补链的核酸。在一个实施方案中，反义序列是由生物体内部产生的，在另一个实施方案中，反义序列是分别施用的(见例如O’Connor，Neurochem.，56560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of GeneExpression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。反义技术可用于通过反义DNA或RNA，或通过三螺旋形成，来控制基因表达。反义技术的讨论见例如Okano，Neurochem.，56560(1991)；Oligodeoxynucleotides as AntisenseInhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)。三螺旋形成的讨论见例如Lee等，Nucleic Acids Research，63073(1979)；Cooney等，Science，241456(1988)；和Dervan等，Science，2511300(1991)。这些方法是基于多核苷酸与互补DNA或RNA的结合。
例如，先前描述的使用c-myc和c-myb反义RNA构建体抑制非淋巴细胞白血病细胞系HL-60和其他细胞系的生长。(Wickstrom等(1988)；Anfossi等(1989))。这些实验是在体外实施的，将细胞与寡核苷酸一起温育。在WO 91/15580中描述了用于体内应用的类似程序。简而言之，如下地产生给定反义RNA的一对寡核苷酸将一段与开放阅读框的最先15个碱基互补的序列用5’侧的EcoR1位点和3’侧的HindIII位点包夹(flanked)。接着将一对寡核苷酸在90℃加热1分钟，然后在2X连接缓冲液(20mM TRIS HCl pH7.5，10mM MgCl2，10MM二硫苏糖醇(DTT)和0.2mM ATP)中退火，而后连接到逆转录病毒载体PMV7(WO 91/15580)的EcoR1/Hind III位点。
例如，可以利用本发明成熟多肽的编码多核苷酸的5’编码部分来设计长度为大约10-40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被设计成与参与转录的基因区域互补，从而阻止受体的转录和产生。反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交，并阻断mRNA分子翻译成受体多肽。反义寡核苷酸可以是单链或双链的。双链RNA可以根据下列文献中的教导加以设计，Paddison等，Proc.Nat.Acad.Sci.，991443-1448(2002)；和国际公开WO01/29058和WO 99/32619；在此通过提述纳入其全部内容。
在一个实施方案中，本发明的反义核酸在细胞内通过从外源序列转录而产生。例如，转录载体或其部分，从而产生本发明的反义核酸(RNA)。这样的载体将包含编码本发明的反义核酸的序列。这种载体可以保持游离或整合到染色体中，只要它能够被转录产生期望的反义RNA即可。这类载体可以通过本领域的重组DNA技术方法标准加以构建。载体可以是质粒、病毒或其他本领域已知的用于在脊椎动物细胞中复制和表达的载体。编码本发明多肽或其片段的序列的表达可以由任何本领域已知的在脊椎动物优选人细胞中发挥作用的启动子所驱动。这些启动子可以是诱导型或者是组成型的。这些启动子包括，但不限于，SV40早期启动子区(Bernoist and Chambon，Nature，29304-310(1981)，劳氏肉瘤病毒3’长末端重复序列中含有的启动子(Yamamoto等，Cell，22787-797(1980)，疱疹胸腺嘧啶启动子(Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，781441-1445(1981)，金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等，Nature，29639-42(1982))，等。
本发明的反义核酸包括与目的基因RNA转录本的至少一部分互补的序列。然而，绝对互补，虽然是优选的，并不是必需的。本文所称的“与RNA的至少一部分互补”的序列，意思是具有足够的互补度，能够与RNA杂交，形成稳定的双链体(duplex)的序列；因此，在本发明双链反义核酸的情况中，可以检验双链体DNA中的一条单链，或者可以对三链体的形成进行测定。杂交的能力将同时取决于互补的程度和反义核酸的长度。一般地，杂交核酸越大，就可以含有越多的与本发明RNA序列不匹配的碱基而仍可形成稳定双链体(或可能地，三链体)。本领域技术人员能够使用杂交复合体熔点测定的标准程序来确定可以容忍的不匹配程度。
与信使(message)的5’端——例如5’非翻译序列(直到并且包含AUG起始密码子)——互补的寡核苷酸在抑制翻译方面应当是最有效的。不过，与mRNA的3’非翻译序列互补的序列也已显示可有效抑制mRNA的翻译。一般地，见Wagner，R.，Nature，372333-335(1994)。因此，与本发明多核苷酸序列的5’-或3’-非翻译、非编码区互补的寡核苷酸可用于反义方法中，以抑制内源mRNA的翻译。与mRNA的5’非翻译区互补的寡核苷酸应当包括AUG起始密码子的互补序列。与mRNA编码区互补的反义寡核苷酸在抑制翻译方面效果要差一些，但仍然可以根据本发明来使用。无论被设计成与mRNA的5’-，3’-还是编码区杂交，反义核酸的长度应当为至少6个核苷酸，优选是长度为6-50个核苷酸范围的寡核苷酸。在具体的方面中，寡核苷酸为至少10个核苷酸，至少17个核苷酸，至少25个核苷酸，或至少50个核苷酸。
本发明的多核苷酸可以是DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或修饰版本，可以是单链的或双链的。寡核苷酸可以在碱基、糖基或磷酸骨架上被修饰，以便例如提高分子、杂交等的稳定性。寡核苷酸可以包括其他附加基团，例如肽(例如，用于在体内靶定宿主细胞受体)，或易化跨细胞膜转运的作用剂(见例如Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，866553-6556(1989)；Lemaitre等，Proc.Natl.Acad.Sci.，84648-652(1987)；1988年12月15日公开的PCT公开NOWO 88/09810)，或者易化跨血脑屏障转运的作用剂(见例如1988年4月25日公开的PCT公开No.WO 89/10134)，杂交引发的断裂试剂(hybridization-triggered cleavage agents)(见例如Krol等，Bio Techniques，6958-976(1988))或插层剂(intercalating agent)(见例如Zon，Pharm.Res.，5539-549(1988))。为此目的，寡核苷酸可以和另-种分子偶联，例如肽、杂交引发的交联剂(hybridization-triggered crosslinking agents)、转运剂、杂交引发的断裂剂等。
双链RNA可以根据下列文献的教导加以设计Paddison等，Proc.Nat.Acad.Sci.，991443-1448(2002)；和国际公开Nos.WO 01/29058和WO99/32619；在此通过提述纳入其全部内容。
本发明特别考虑了siRNA试剂。这些试剂可用于抑制本发明的多核苷酸的表达，并可能具有治疗效力。本领域已知有多种方法通过施加siRNA试剂来治疗疾病。Tiscornia描述了其中一种方法(Proc.Nat.Acad.Sci.，100(4)1844-1848(2003))，在此通过提述纳入其全部内容。
反义寡核苷酸可以包括至少一个修饰碱基，其选自下组，包括但不限于，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(β-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(β-D-mannosylqueosine)、5-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。
反义寡核苷酸还可以包括至少一个经过修饰的糖模块，其选自下组，包括但不仅限于，阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。
在另一个实施方案中，反义寡核苷酸包括至少一个经过修饰的磷酸骨架，其选自下组，包括但不仅限于，硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、硫代氨基磷酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、二氨基磷酸酯(phosphordiamidate)、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯、和缩醛(formacetal)，或其类似物。
在另一个实施方案中，反义寡核苷酸是a-异头寡核苷酸。a-异头寡核苷酸与互补RNA形成特定的双链杂交体，其中与通常的b单位不同，各链彼此平行排列(Gautier等，Nucl.Acids Res.，156625-6641(1987))。寡核苷酸是2-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等，Nucl.Acids Res.，156131-6148(1987))，或嵌合RNA-DNA模拟物(Inoue等，FEBS Lett.，215327-330(1987))。
本发明的多核苷酸可以用本领域已知的标准方法合成，例如通过使用自动DNA合成仪(例如可从Biosearch，Applied Biosystems等商购的)。作为实例，硫代磷酸酯寡核苷酸可以用Stein等的方法合成(Nucl.Acids Res.，163209(1988))，甲基膦酸酯寡核苷酸可以通过使用可控多孔玻璃聚合物支持物(controlled pore glass polymer supports)制备(Sarin等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，857448-7451(1988))，等。
尽管可以使用与本发明编码区序列互补的反义核酸，但是与转录的非翻译区的互补是最优选的。
根据本发明的潜在拮抗剂还包括催化性RNA或核酶(见例如1990年10月4日公开的PCT国际公开WO 90/11364；Sarver et al，Science，2471222-1225(1990))。尽管在位点特别识别序列处切割mRNA的核酶可以用于破坏与本发明多核苷酸对应的mRNA，但是优选使用锤头状核酶。锤头状核酶切割mRNA的位置由该位置的形成与靶mRNA互补的碱基对的侧翼区所确定。唯一的要求是，靶mRNA具有如下的二碱基序列5′-UG-3′。锤头状核酶的构建和产生是本领域众所周知的，在Haseloff and Gerlach，Nature，334585-591(1988)中有更全面的描述。在序列表中公开的每个核苷酸序列中有大量的潜在锤头状核酶切割位点。优选地，核酶被工程化从而使切割识别位点靠近本发明多核苷酸的相应mRNA的5’端；即，为了提高效率和并最大程度地减少无功能的mRNA转录本在细胞内的积累。
正如在反义方法中那样，本发明的核酶可以由经过修饰的寡核苷酸构成(例如，为了提高稳定性、靶向等)，并且应当被输送到在体内表达本发明多核苷酸的细胞。编码核酶的DNA构建体可以引入到细胞中，其方式与上文关于引入反义编码DNA所描述的方式相同。一种优选的输送方法涉及使用在强组成型启动子(例如pol III或pol II启动子)的控制下“编码”该核酶的DNA构建体，从而被转染的细胞会产生足够量的核酶，以破坏内源信使(message)，并抑制翻译。因为核酶与反义分子不同，它是催化性的，因此实现效力所需的细胞内浓度更低。
拮抗剂/激动剂可以用于抑制本发明多肽对新生物细胞和组织的细胞生长或增殖效果，即对肿瘤血管新生的刺激作用，从而阻碍或防止异常的细胞生长和增殖，例如在肿瘤形成或生长中。
拮抗剂/激动剂还可以用于预防富血管疾病(hyper-vascular diseases)，并防止晶状体上皮细胞在囊外白内障(extracapsular cataract)手术之后的增殖。防止本发明多核苷酸的促有丝分裂活性在例如气囊血管成形术后的再狭窄等场合也是理想的。
所述拮抗剂/激动剂还可用于防止疤痕组织在伤口愈合期间的生长。
所述拮抗剂/激动剂还可用于治疗、预防和/或诊断本文描述的疾病。
因此，本发明提供了一种通过向患者施用(a)针对本发明多核苷酸的反义分子，和/或(b)针对本发明多核苷酸的核酶，来治疗或预防与本发明多核苷酸的过表达相关的疾病、疾患和/或病症，包括但不限于在本专利申请全文中列举的疾病、疾患和/或病症的方法。
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实施例1-方法 细胞系和细胞培养 所有的细胞系均是从美国典型培养物保藏中心(Manassas VA)获得的，DUCaP除外，它是从Michigan大学的Kenneth Pienta博士处获得的。PWR1E和MDAPCa2b细胞在BRFF-HPC1无血清培养基(AthenaES，Baltimore，MD)中生长，其他所有细胞在补充了10％胎牛血清、100IU/ml青霉素和100mg/ml链霉素的RPMI 1640培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养。DUCaP细胞在永生化鼠成纤维细胞系的存在下保持，该细胞系在DUCaP细胞下面形成一个容易脱离(dislodged)的层。细胞在37℃的5％CO2环境下生长。
体外细胞增殖测定 BMS-A(达沙替尼)处理对细胞增殖的影响用MTS比色方法(Promega，Madison，WI)进行测量。在预实验中确定了接种到96孔板上的细胞的最佳数目以获得线性。以2000-5000个细胞/孔的密度将细胞在96孔板中铺板，并过夜培养。然后，用系列稀释浓度的达沙替尼对细胞进行处理。3天后，向培养基中添加MTS，并在

光度平板阅读器(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)上在490nm进行定量。将结果相对于药物浓度作图，用Prism4软件(GraphPad，San Diego，CA)计算IC50。IC50是达沙替尼使细胞增殖与对照相比减少50％的浓度。对每个细胞系进行至少3次独立的测定。计算平均值±标准差(SD)，但对化合物高度耐药而难以获得精确的IC50的细胞系除外。在后者的情况下，将能够稳定地(consistently)降低细胞增殖的达沙替尼的浓度作为IC50。达沙替尼对细胞生长的抑制还可以在显微镜下目测确认。溶解在DMSO中的达沙替尼储液浓度为10mg/ml。
微阵列分析 使用含有～22,000个探针系列的

HG-U133v2基因芯片(Affymetrix，Santa Clara，CA)进行基因表达谱分析。用RNeasy试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从细胞中分离总RNA。用Agilent 2100生物分析仪(Agilent，Santa Clara，CA)评估RNA的质量(quality)。使用10μg总RNA制备生物素标记的cRNA。芯片杂交、扫描和数据获取根据制造商提供的《表达分析技术手册》(Expression Analysis Technical Manual)实施。
数据分析 原始表达数据用RMA算法加以标准化，并用

Discovery Suite软件(Partek，St Louis，MO)进行分析。实施了两种统计分析，包括用于比较敏感型和耐药型细胞系群之间的基因表达的单向(1-way)ANOVA，和基因表达水平与log2IC50值之间的Pearson相关，以鉴定在16个前列腺细胞系中基线表达水平与达沙替尼敏感性相关的基因(在两种分析中的p＜0.05)。进一步通过变量滤镜(基因表达值在所有样品中的变异系数为10％，和在以IC50定义的敏感性和耐药性细胞群之间最少相差3倍的差异表达)将基因列表缩小。从最终的列表中除去EST和基因重复。用配对t-检验比较经药物处理(100nM处理2天)的细胞系与DMSO对照的基因表达特征谱(p＜0.05)。用GeneCluster软件进行聚类分析，生成分别用红色和绿色表示高表达和低表达的热图(heatmap)。
Western印迹分析 用添加了蛋白酶(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)和磷酸酶抑制剂(Sigma，St.Louis，MO)合剂的RIPA缓冲液从异步生长的细胞制备细胞裂解物。用BCA试剂盒(Pierce，Rockford，IL)确定蛋白浓度。将3μg裂解物加载到

Novex 4-12％ Bis-Tris凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上并进行分离。印迹用小鼠单克隆抗EphA2抗体(Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY)和抗微管蛋白抗体(Abcam，Cambridge，MA)探查，并用化学发光剂ECL

(GE Healthcare，Piscataway，NJ)显影。
uPA蛋白ELISA测定 将细胞接种在24孔板上，接种密度为25,000个细胞/孔。2天后，用PBS清洗细胞两次，并将培养基换成含有0.1％FBS和不同浓度达沙替尼或

的RPMI 1640。培养基在0，2，4，8，24和48小时取样，并立即以10,000g离心5min。将上清冷冻于-80℃备分析用。还用细胞计数计确定细胞的总数，并使用台盼蓝估计活细胞的数目。用uPA ELISA试剂盒(AmericaDiagnostica，Stamford，CT)测定上清中uPA蛋白的含量，并计算由50,000个活细胞分泌到培养基中的uPA的浓度。
实施例2-血浆中UPA蛋白水平的下调与达沙替尼诱导的PC异种移植肿瘤的生长降低相关 为了确认uPA可以用作被降低的肿瘤生长的替代标志，在存在和不存在达沙替尼的情况下，检查带有PC3异种移植肿瘤的小鼠血浆中uPA蛋白的水平。在nu/nu无胸腺小鼠中皮下建立异种移植肿瘤。当肿瘤达到大约200mg后，将小鼠分成3组，每组8只小鼠，两组分别用15或30mg/kg的达沙替尼进行处理，第三组不接受达沙替尼，作为对照。达沙替尼按照给药5天而后停药2天的方案，每天口服给药2次，给药20个剂量。在处理之前，以及处理开始后两周每周一次，进行肿瘤尺寸测量和血液采样。肿瘤重量用如下的公式确定肿瘤重量＝(长度*宽度2)/2。需要注意，所用的ELISA试剂盒仅检测人而非小鼠uPA蛋白(数据未显示)。意料之中的，PC3异种移植肿瘤被所测试的两个剂量水平的达沙替尼所抑制，尽管30mg/kg并未显示出比15mg/kg更高的肿瘤生长抑制活性。用达沙替尼处理处理的第一周后，血浆uPA水平被显著降低，特别是以30mg/kg处理后(～30％)。尽管这种下调的幅度随着肿瘤进展到第二周会有所降低，但是该趋势仍然保持。由于达沙替尼与紫杉醇的组合在临床模型中显示了比单一药剂更高的抗肿瘤活性，uPA的下调幅度可以更大，因此可以更好地在组合研究中用作替代标志。在无法进行肿瘤测量的场合，例如在转移性肿瘤中，这个发现具有特别重要的意义。
这些发现体现了uPA表达特征谱的第二种用途。如本文概述的，样品中低水平的uPA表达，与样品至少部分地对蛋白酪氨酸激酶抑制剂耐药的可能性增加之间具有相关性。但是，当uPA表达水平提高或者至少正常时，样品对蛋白酪氨酸激酶抑制剂敏感的可能性增加。在此实例中，利用异种移植检查的细胞系是一个敏感型细胞系，其应答于蛋白酪氨酸激酶抑制剂处理而显示降低的uPA表达。这种降低的表达进一步证明，uPA是一种蛋白酪氨酸激酶抑制剂的敏感性标志，并可以用作衡量治疗有效性的替代物(surrogate)。
实施例3-PCR表达特征谱分析 用

实时PCR荧光测定进行RNA定量。

测定是测定核酸模板浓度的最精确的方法之一。
用标准方法制备RNA，优选地，采用可以从Qiagen(Valencia，CA)商购的RNeasy Maxi试剂盒。用于实时PCR的cDNA模板可以使用RT-PCR

第一链合成系统产生。表6中提供了用于本发明各种蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的代表性正向和反向RT-PCR引物(SEQ IDNO357-887)。


Green实时PCR反应体系如下制备反应混合物包含20ng第一链cDNA；50nM正向引物；50nM反向引物；0.75X

Green I(Sigma)；1X

Green PCR缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.3，75mM KCl)；10％DMSO；3mM MgCl2；dATP，dGTP，dTTP，dCTP各300μM；1U

高保真度Taq DNA聚合酶(批号11304-029；Life Technologies；Rockville，MD)。实时PCR使用Applied Biosystems 5700序列检测系统来进行。条件为95℃，10分钟(变性及活化

Taq DNA聚合酶)，40个PCR循环(95℃15秒，60℃1分钟)。用5700序列检测系统内建的分析算法分析PCR产物的均一熔解。
在模板量标准化中使用的cDNA定量是采用

技术实施的。

反应体系的制备如下反应混合物包含20ng第一链cDNA；25nM GAPDH-F3正向引物；250nM GAPDH-R1反向引物；200nMGAPDH-PVIC

探针(荧光染料标记的寡核苷酸引物)；1X缓冲液A(Applied Biosystems)；5.5mM MgCl2；300μM dATP，dGTP，dTTP，dCTP；和1U AMPLITAQ

(Applied Biosystems)。GAPDH(D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶)用作对照以便将mRNA水平标准化。使用Applied Biosystems 7700序列检测系统进行实时

PCR。条件为95℃，10分钟(变性和AMPLITAQ

活化)，40个PCR循环(95℃15秒，60℃1分钟)。
在所述

反应中使用的GAPDH寡核苷酸的序列如下 GAPDH-F35’-AGCCGAGCCACATCGCT-3’(SEQ ID NO888)； GAPDH-R15’-GTGACCAGGCGCCCAATAC-3’(SEQ ID NO889)；和 GAPDH-PVIC

探针-VIC-5’- CAAATCCGTTGACTCCGACCTTCACCTT-3’TAMRA(SEQ IDNO890). 序列检测系统产生一个Ct(阈循环)值，用该值计算每个输入的cDNA模板的浓度。将每个目标多核苷酸的cDNA水平相对于GAPDH cDNA水平标准化，以补偿输入样品中总cDNA量的差异。这是通过为每个细胞系生成GAPDH Ct值来实现的。将目标多核苷酸和GAPDH的Ct值插入到δδCt公式的修饰版本中(Applied Biosystems

7700序列检测系统用户公告#2)，用该方程为每个特定cDNA计算经GAPDH标准化的相对cDNA水平。δδCt公式如下核酸模板的相对量＝＝2δδCt＝2(δCta-δCtb)，其中δCta＝Ct靶-Ct GAPDH，δCtb＝Ct参照-Ct GAPDH。(不使用参照细胞系来计算相对量，δCtb定义为21)。
实施例4-针对蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的抗体的产生 本发明的抗蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽抗体可以用上文详述的多种方法加以制备。作为抗体产生方法的一个实例，将表达本发明多肽的细胞施加给动物作为免疫原，从而诱导产生含有针对所表达多肽的多克隆抗体的血清。在一个优选方法中，用本领域通用的技术制备(prepare)，优选分离和/或纯化被表达的多肽，使其基本上没有自然污染物。然后，将这种制备物引入到动物体内，以便产生单克隆抗血清，其对表达和分离的多肽具有更大的特异性活性。
在一个最优选的方法中，本发明的抗体是单克隆抗体(或其蛋白结合片段)，并可用如上文详细描述的杂交瘤技术制备。表达该多肽的细胞可以在任何合适的组织培养基中培养；然而，往往优选补充含有10％胎牛血清(大约56℃灭活的)和补充含有大约10g/l非必需氨基酸、大约1.0U/ml青霉素和大约100μg/ml链霉素的Earle修饰Eagle培养基(Earle′s modified Eagle′smedium)中培养细胞。
提取经过免疫(和加强免疫)的小鼠的脾细胞，并与合适的骨髓瘤细胞系融合。任何合适的骨髓瘤细胞系均可依照本发明加以采用；然而优选地是采用可以从

商购的亲本骨髓瘤细胞系SP2/0。在融合之后，将所得的杂交瘤细胞在HAT培养基中选择性维持，然后通过有限稀释加以克隆，例如按照Wands等(Gastroenterology，80225-232(1981))描述的方式。然后对通过这种选择过程获得的杂交瘤细胞进行测试，以鉴定出分泌能够与多肽免疫原或其部分结合的抗体的细胞克隆。
或者，可以使用抗独特型抗体，通过一个两步程序来产生其他能够结合该多肽的抗体。这种方法利用了这样一个事实，即抗体本身是抗原，因此有可能获得与一种抗体结合的另一种抗体。根据此方法，使用蛋白特异抗体免疫动物，优选小鼠。然后使用这种被免疫动物的脾细胞产生杂交瘤细胞，对该杂交瘤细胞进行筛选，以鉴定产生如下抗体的克隆，该抗体的结合所述蛋白特异性抗体的能力可以被该蛋白所阻断。这些抗体包括针对该蛋白特异性抗体的抗独特型抗体，并可用于免疫动物来诱导形成其它的蛋白特异性抗体。
对于抗体在人类的体内用途，使用“人源化”的嵌合单克隆抗体可能是优选的。这些抗体可以用从上文描述的可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞衍生的基因构建体产生。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知并且通用的。(综述见例如Morrison，Science，2291202(1985))；Oi等，BioTechniques，4214(1986)；Cabilly等，美国专利No.4,816,567；Taniguchi等，EP 171496；Morrison等，EP 173494；Neuberger等，WO 8601533；Robinson等，WO87/02671；Boulianne等，Nature，312643(1984)；和Neuberger等，Nature，314268(1985))。
实施例5-免疫荧光测定 如下所述的免疫荧光规程可以用来，例如，证实细胞中蛋白酪氨酸激酶生物标志的表达，或者，例如，检查一种或多种可以和细胞表面上表达的蛋白酪氨酸激酶生物标志(多肽或肽)结合的抗体的存在。简而言之，在4℃用溶于含有钙和镁的DPBS(DPBS++)中的10μg/ml牛II型胶原蛋白过夜包被LAB-

II小室玻片(chamber slide)。然后用冷DPBS++清洗玻片两次，并接种大约8000个用包含本发明蛋白酪氨酸激酶生物标志编码序列的载体转染的CHO细胞，或者只用载体转染的CHO细胞(对照)，总体积为125μl，在95％氧气/5％二氧化碳的存在下在37℃温育。
之后，通过抽吸轻轻地除去培养基，并用DPBS++在环境温度下清洗贴壁细胞两次。用含有0.2％BSA(封闭剂)的DPBS++在0-4℃将玻片封闭1小时。通过抽吸轻轻地除去封闭溶液，并添加125μl含有抗体的溶液(含有抗体的溶液可以是，例如，通常不经稀释即使用的杂交瘤培养物上清，或者通常以例如大约1∶50，1∶100，1∶1000等的稀释度稀释的血清/血浆)。玻片在0-4℃温育1小时。然后通过抽吸轻轻地除去抗体溶液，并用400μl冰冷的封闭液清洗细胞5次。然后，向细胞添加125μl溶于封闭液中的1μg/ml的罗丹明标记的第二抗体(例如抗人IgG)。再次将细胞在0-4℃温育1小时。
然后通过抽吸轻轻除去第二抗体溶液，并用400μl冰冷的封闭液清洗细胞3次，用冷DPBS++清洗细胞5次。然后在环境温度下用125μl溶于DPBS++的3.7％甲醛固定细胞15分钟。之后，用400μl DPBS++在环境温度下清洗细胞5次。最后，细胞在50％甘油水溶液中封固(mount)，并在荧光显微镜下使用罗丹明滤波片进行观察。
实施例6-互补序列 与蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽编码序列或其任何部分互补的反义分子或核酸序列，可用于降低或抑制自然发生的蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的表达。尽管包含大约15-35个碱基对的反义或互补寡核苷酸的使用已有描述，但是对于更小或更大的核酸序列片段基本上使用相同的程序。基于如SEQ ID NO1-356所述的蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的编码序列的寡核苷酸，被用来，例如，抑制自然发生的蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的表达。互补的寡核苷酸典型地是基于最独特的5’序列设计的，或者用于通过阻止启动子结合到编码序列从而抑制转录，或者用于通过阻止核糖体结合编码蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的转录本，从而抑制翻译，等等。但也可以靶定其他的区域。
使用SEQ ID NO1-356的信号和5’序列的合适部分，有效的反义寡核苷酸包括任何跨翻译成SEQ ID NO1-356所示的多肽的信号或5’编码序列的区域(或其他区域)的大约15-35个核苷酸。合适的寡核苷酸可以用OLIGO4.06软件和蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽编码序列(SEQ ID NO1-356)进行设计。优选的寡核苷酸是基于脱氧核苷酸或嵌合脱氧核苷酸/核糖核苷酸的，并在下文中提供。寡核苷酸可以用大体上在美国专利No.5,849,902中描述的化学法合成，在此通过提述纳入其全部内容。
代表性RNAi试剂序列如下 用反义寡核苷酸转染静息后(post-quiescent)A549细胞 所需材料 ·A549细胞可以保持在含有高葡萄糖(Gibco-BRL)并添加了10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和1X青霉素/链霉素的DMEM中 ·Opti-MEM(Gibco-BRL) ·Lipofectamine 2000(Invitrogen) ·反义寡聚体(Qiagen) ·聚苯乙烯管. ·组织培养物处理的平板 静息细胞的制备如下 第0天将300,000个A549细胞接种在含有10ml A549培养基(如上文说明的)的T75组织培养瓶中，并在37℃，5％CO2的加湿培养箱中温育48小时。
第2天震荡T75烧瓶以除去任何贴壁不紧的细胞，除去A549生长培养基，并补充10ml新鲜的A549培养基。细胞培养6天而不更换培养基，从而产生静息细胞群体。
第8天将静息细胞以多孔格式铺板，并用反义寡核苷酸转染。A549细胞的转染如下 1.用胰酶处理含有静息A549细胞群体的T75烧瓶。
2.对细胞计数，并以每孔60K个静息A549细胞接种。
3.让细胞贴附到组织培养板上(大约4小时)。
4.用反义寡核苷酸和对照寡核苷酸根据如下转染细胞 a.可制备Lipofectamine 2000(10ug/ml为10X)的10X储液，将稀释的脂质在室温放置15分钟。
Lipofectamine 2000的储液为1mg/ml。
用于转染的10X溶液为10ug/ml。
为了制备10X溶液，将10ul Lipofectamine 2000储液稀释在1mlOpti-MEM(无血清培养基)中。
b.为每个寡聚体制备10X储液，用于转染。
寡聚体的储液为100uM，溶于20mM HEPES，pH 7.5。
寡聚体的10X浓度可以是0.25uM。
为了制备10X溶液，将2.5ul寡聚体稀释在1ml Opti-MEM中。
c.将等体积的10X Lipofectamine 2000储液与10X寡聚体溶液充分混合，并在室温下温育15分钟，从而让寡聚体与脂质复合。最终的混合物为5X。
d.复合15分钟之后，向寡聚体/脂质复合物添加4倍体积的全生长培养基(溶液可以是1X)。
e.从细胞吸去培养基，并向每个孔添加0.5ml 1X寡聚体/脂质复合物。
f.将细胞在37℃加湿CO2培养箱中温育16-24小时。
g.收集细胞离心沉淀，用于RNA分离和蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的

分析，以评估敲低(knock-down)的水平。


反应 可以对用DNA酶I处理的总RNA制备物或用多聚A选择的RNA进行定量RT-PCR分析。DNA酶处理可以用本领域已知的方法实施，虽然优选地是使用Qiagen RNeasy试剂盒纯化RNA样品，其中DNA酶I处理在柱上实施。
简而言之，试剂的预混合液(master mix)可以根据下表制备 DNA酶I处理 接着，可以向96孔PCR反应板的每个孔添加5ul等份的预混合液(PE部分#N801-0560)。用DEPC处理水(如果需要)将RNA样品调整到0.1ug/ul，并向等份添加的预混合液中添加20ul，使最终反应体积为25ul。
用strip well盖(PE部分#N801-0935)将孔盖住，置于一块平板内，在平板离心机(Beckman)中短暂旋转，以将全部体积收集于管底。一般地，在

RT中短暂旋转加速到500rpm就足够了。
将板在37℃温育30分钟。然后可以向每个孔添加等体积的溶于10mMTris的0.1mM EDTA，在70℃热失活5分钟。完成后，将板存储在-80℃。
RT反应 试剂的预混合液可以根据下表加以制备 RT反应 将样品调整到一定的浓度，使得500ng RNA被添加到每个RT反应中(非RT添加100ng)。最多可以向RT反应混合物添加19ul(对于非RT为10.125ul)。用DEPC处理水填补剩余体积直到达到最大体积，从而使总反应体积为50ul(RT)或25ul(非RT)。
可以在96孔PCR反应板上(PE部分#N801-0560)等份加入37.5ul预混合液(非RT预混合液为22.5ul)，然后添加RNA样品达到总反应体积为50ul(25ul，非RT)。在两个或者甚至三个不同的孔中添加对照样品，以便具有足够的模板用于产生标准曲线。
用strip well盖(PE部分#N801-0935)将孔盖住，置于一块平板内，在平板离心机(Beckman)中短暂旋转，以将全部体积收集于管底。一般地，在

RT中短暂旋转加速到500rpm就足够了。
对于RT-PCR反应，可以使用如下的温度曲线(thermal profile) a.25℃，10min b.48℃，30min c.95℃，5min d.4℃保持(1小时) e.完成后将平板保存在-20℃或者更低温度

反应(模板来自RT板) 预混合液(Master mix)可以根据下表加以制备

反应(每孔)
可以为每种酪氨酸激酶生物标志多肽的编码区设计合适的正向、反向和探针引物，用于在RT-PCR反应中使用。
使用

P-10重复移液器，向96孔光学平板的每个孔等份添加22.5ul预混合液。然后，用P-10移液器，向每个孔添加2.5ul样品。一般地，对于每个所用的引物/探针系列，RT样品进行3个重复，非RT样品仅运行1次，并且仅用一个引物/探针系列，通常是GDPDH(或其他内部对照)。
然后构建一条标准曲线并装载到平板上。该曲线具有5个点加1个无模板对照(NTC，＝DEPC处理的H2O)。制作该曲线的样品可以是以50ng样品为高点(是未知RNA量的两倍)，接下来则是25，10，5和1ng样品。曲线可以用对照样品制作(见上文)。
用光学strip well盖(PE部分#N801-0935)盖住孔，置于一块平板内，在平板离心机(Beckman)中短暂旋转，以将全部体积收集于管底。一般地，在

RT中短暂旋转加速到500rpm就足够了。
将平板装载到PE 5700序列检测仪上，注意使平板与右上角的V型刻痕恰当地对齐。可以将盖子盖紧，用5700和5700定量程序和

探针运行，并使用如下的温度曲线 50°，2min 95℃，10min 随后进行40个循环 95℃，15sec 60℃，1min 将反应体积改变为25ul。
一旦反应结束，可以设定一个大约0.1的人工阈值，以便将背景信号最小化。关于

5700设备操作的更多信息可以参考如下的手册“GeneAmp 5700序列检测系统操作员训练CD”(GeneAmp 5700 SequenceDetection System Operator Training CD)；和“5700序列检测系统用户手册”(User’s Manual for 5700 Sequence Detection System)；它们可以从Perkin-Elmer获得，在此通过提述纳入其全部内容。
技术人员会认识到，对于本发明的每一个蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽可能需要对上述方案进行修改。技术人员还会认识到，可以使用除A549之外的其他细胞系，A549仅提供作为实例。技术人员还会认识到，可以采用其他方法评估互补寡核苷酸的能力，例如SEQ ID NO534-557中提供的RNAi试剂，其包括但不仅限于Western印迹和ELISA测定及其他。
实施例7-测定互补序列调节本发明蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽表达水平的能力的备选方法 SEQ ID NO14-37提供了可用于评估其调节本发明蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的表达水平的能力的优选互补序列。根据如SEQ ID NO1-356提供的本发明蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的编码区可以设计其他的互补序列，并且本发明也特别考虑了这些序列。
共转染RNAi 转染 转染前一天，在24孔盘的每个孔内接种2X105个HeLa细胞。随后一天，细胞应当有90-95％汇合。对每个待转染的RNAi，在聚苯乙烯管(管A)中将4.5uL的20uM RNAi储液(SEQ ID NO14-37中的一个或多个)稀释到50uL Optimem中。轻轻敲击混匀。在另一个聚苯乙烯管中，混合2uLLipofectamine 200和50uL Optimem(管B)。轻轻敲击混匀。置于室温5分钟。将50uL管B与每个50uL管A混合。轻轻敲击混匀。置于室温15分钟.向每个管添加500uL无血清/抗生素MEM，使最终RNAi浓度为150nM。(对于RNAi和质粒的共转染，在管A中使用1uL 20uM RNAi储液(最终浓度为33nM)与1ug载体DNA，然后实施上述的转染方案)。从HeLa板除去培养基，替换成600uL转染混合物。置于37℃5％CO2孵化箱中4-5小时。将培养基替换成含有10％FBS的MEM。
转染中包含的对照包括用于计算转染效率的荧光寡核苷酸对照(1U/uL＝20uM)，作为非特异性阴性对照的GFP B，作为标准化敲低对照的CDC2，和不加DNA的非转染对照。
裂解 转染后48小时，吸去培养基，每孔用大约500uL冷1xPBS清洗细胞。吸去并替换为100uL含有蛋白酶抑制剂的冷RIPA(1mini BM蛋白酶抑制剂片/10mL 1x RIPA)。震荡并轻敲平板数次，然后置于4℃10-15分钟。再轻敲/震荡平板数次。用200uL微量移液器抽吸5-10次，并清洗孔，以保证完全裂解和转移全部材料。将裂解物转移到一个eppendorf管，吹打5-10次。如果样品仍然粘稠，再吹打数次。在4℃ 14000 RPM 10分钟旋转沉降样品。现在可以将样品保存于-20℃或者准备上样。
Western印迹/Novex 样品的准备是混合20uL裂解物与3uL还原剂和7uL 4X凝胶上样染料。在70℃加热10分钟，然后将样品置于冰上。在样品加热期间，将要用的凝胶(通常为4-12％Bis-Tris凝胶)除去梳子和密封条备用。将凝胶置于凝胶盒内，用要用的缓冲液(1xMES或MOPS-向每个凝胶盒添加50mL 20x缓冲液于950mL dH2O中)充满内室和外室。向内室添加600uL氧化剂。通过倾每个孔用500uL缓冲液冲刷(blasting)洗涤。在孔1中，装载5uL分子量标记——Invitrogen的

Plus2。在接下来的泳道中装载样品。将凝胶在200V运行45-50分钟。制作1X转膜液——50mL 20x转膜液，甲醇(如果在同一装置内转移一块凝胶，则用100mL，如果转移两块凝胶，则用200mL)，并加dH2O到1000mL。将印迹垫在dH2O中浸泡，然后在转膜缓冲液中浸泡-要确保挤压垫子以排出气泡。将预先切好的Hybond-ECL膜(Amersham硝酸纤维素)在dH2O中浸泡，然后在转膜液中浸泡。切掉Biorad滤纸的末端，以使其与转移膜的尺寸匹配。如果转移一块凝胶，则在印迹室中放置2块印迹垫。对于2块凝胶，则放置1块垫。将滤纸在转膜缓冲液中短暂浸泡，并小心地叠放在印迹垫上。用剥离工具打开凝胶夹板(cassette)，切掉凝胶的顶部、底部和侧边。将它在转膜缓冲液中短暂漂洗，然后将它小心地叠加在滤纸的上面，确保不存在任何气泡。再次小心地将转移膜叠放在上面，确保没有气泡。放下滤纸，如果转移1块凝胶的话，放下两个印迹垫，以完成夹层。如果转移2块凝胶，则放下1个印迹垫，滤纸、凝胶、膜、滤纸、印迹垫。现在凝胶已经准备好用于转膜。将凝胶夹层压紧并放置在转膜装置内。用转膜缓冲液充满内室和外室。在30V转移凝胶1小时 移出膜，将它们放置在

(Pierce)中，并在室温下震荡至少1小时-过夜。(我曾经将膜置于

中在4℃度过周末)。将第一抗体和标准化抗体稀释在1∶10混合的

∶1xPBS/0.3％Tween-20中。将膜在室温下与第一抗体温育并震荡最少1小时-过夜。然后在1xPBS/0.3％Tween-20中彻底清洗膜。我通常快速漂洗数次，然后在1xPBS/0.3％Tween-20中漂洗3次每次5分钟。在最后一次漂洗中，将HRP-偶联的第二抗体稀释在1xPBS/0.3％Tween-20中。将它添加给膜，并在室温震荡至少30分钟。彻底清洗膜。我通常快速漂洗数次，然后在1xPBS/0.3％Tween-20中漂洗3次每次5分钟。将膜从清洗缓冲液中取出，通过握住膜的边缘在纸巾上吸干多余的缓冲液。将膜置于已经在台面上平整以除去气泡的Saran Wrap上。添加足够的ECL试剂，以覆盖膜1分钟。除去膜，在纸巾上排干多余的ECL。将膜置于两个透明薄板之间，小心地平整以排出气泡。
定量 用FluorS-Max对膜进行曝光。相对百分比抑制率可以通过比较每个用RNAi处理的条带的强度与没有经过RNAi处理的每个条带(对照)的强度来加以确定。用目标条带除以每个泳道的标准化条带将泳道标准化。将每个被处理样品的标准化值除以对照的标准化值。然后，可以通过公式(1-上述值)x100计算百分比抑制率。
技术人员会认识到，对于本发明的每一个蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽可能需要对上述方案进行修改。
本文引述的全部专利、专利申请、公开的PCR申请和论文、书籍、参考文献、参考手册、摘要、序列表和互联网址的全部内容均以提述方式并入本文以更全面地描述本发明所涉及领域的现有技术水平。
可以对上述的主题进行各种修改而不背离本发明的范围和精神，上述说明书中包含的或者在随附的权利要求中定义的全部主题均应看作是本发明的描述和举例。根据前面的教导，可以对本发明作出许多修改和变化。
序列列表的简单描述
在此通过提述纳入其全部内容的是一份序列表，包括SEQ ID NO1-SEQID NO912，其包括本文表2中列出的蛋白酪氨酸激酶生物标志的核酸和氨基酸序列，和本文描述的用于这些多核苷酸标志、探针和RNAi试剂的正向和反向引物的核苷酸序列。序列表装在一张高密盘即CD-ROM上，这里提交了3个相同的拷贝。IBM/PC MS-WINDOWS文本格式的序列表首先在2007年2月1日生成，大小为153MB。
权利要求
1.一种预测子系列，其包括多个如下所述的多核苷酸，所述多核苷酸的表达模式可预示细胞对N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺处理的应答。
2.根据权利要求1的预测子系列，其中所述多核苷酸选自下组
a)表2中给出的多核苷酸；
b)表2中给出的敏感性预测子多核苷酸；
c)表2中给出的耐药性预测子多核苷酸；
d)表3中给出的多核苷酸；
e)表3中给出的敏感性预测子多核苷酸；
f)表3中给出的耐药性预测子多核苷酸；
g)表4中给出的多核苷酸；
h)表4中给出的敏感性预测子多核苷酸；
i)表4中给出的耐药性预测子多核苷酸；
j)表5中给出的多核苷酸；
k)表5中给出的敏感性预测子多核苷酸；
l)表5中给出的耐药性预测子多核苷酸；
m)CK5，PSA，AR多核苷酸；
n)PSA和AR多核苷酸；
o)CK5多核苷酸；
p)uPA多核苷酸；
q)EPHA2多核苷酸；
r)PSA多核苷酸；
s)AR多核苷酸；和
t)上述多核苷酸的任意组合。
3.一种预测子系列，其包括多个如下所述的多肽，所述多肽的表达模式可预示细胞对N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺处理的应答。
4.根据权利要求3的预测子系列，其中该多肽选自下组
a)表2中给出的多肽；
b)表2中给出的敏感性预测子多肽；
c)表2中给出的耐药性预测子多肽；
d)表3中给出的多肽；
e)表3中给出的敏感性预测子多肽；
f)表3中给出的耐药性预测子多肽；
g)表4中给出的多肽；
h)表4中给出的敏感性预测子多肽；
i)表4中给出的耐药性预测子多肽；
j)表5中给出的多肽；
k)表5中给出的敏感性预测子多肽；
l)表5中给出的耐药性预测子多肽；
m)CK5，PSA，AR多肽；
n)PSA和AR多肽；
o)CK5多肽；
p)uPA多肽；
q)EPHA2多肽；
r)PSA多肽；
s)AR多肽；和
t)上述多肽的任意组合。
5.用于预测化合物是否能够调节细胞活性的方法，包括如下步骤
a)获得细胞样品；
b)确定所述细胞是否表达多个标志；和
c)将所述标志的表达与化合物调节所述细胞的活性的能力相关联。
6.根据权利要求5的方法，其中该多个标志是根据权利要求2的一种或多种多核苷酸。
7.根据权利要求9的方法，其中该多个标志是根据权利要求5的一种或多种多肽。
8.一种用于鉴定可预测与疾病状态相关的细胞的化合物敏感性或耐药性的多核苷酸和多肽的方法，所述方法包括如下步骤
a)使多个细胞系接受一种或多种化合物；
b)分析多核苷酸的微阵列或多肽的微阵列的表达模式；和
c)利用所述微阵列的所述表达模式选择可预测与疾病状态相关的细胞的敏感性或耐药性的多核苷酸或多肽。
9.一种用于预测需要进行疾病状态的治疗的个体是会成功地应答所述治疗或是不会应答所述治疗的方法，包括如下步骤
a)从所述个体获得细胞样品；
b)确定所述细胞是否表达多个标志；和
c)将所述标志的表达与个体应答所述治疗的能力进行关联。
10.根据权利要求9的方法，其中该疾病状态是前列腺癌、乳腺癌或肺癌。
11.一种用于筛选能够结合蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽和/或调节蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的活性的候选化合物的方法，包括
a)使测试化合物与根据权利要求4的多肽接触；和
b)选择那些可以结合所述多肽和/或调节所述多肽活性的测试化合物作为候选化合物。
12.一种用于治疗受试者的前列腺癌的方法，包括施用权利要求4中给出的一种或多种蛋白酪氨酸激酶生物标志多肽的调节物。
13.一种预测患者是否可对蛋白酪氨酸激酶抑制剂例如N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺具有应答性的方法，其使用选自下组的方法
a)测量患者样品中激肽释放酶3和雄激素受体的表达水平，其中相对于标准样品中观察到的水平升高的激肽释放酶3和/或雄激素受体的表达水平指示对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂的至少部分的耐药性，而其中相对于标准样品中观察到的水平降低的激肽释放酶3和/或雄激素受体的表达则指示对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂的敏感性；
b)测量患者样品中细胞角蛋白5的表达水平，其中相对于标准样品中观察到的水平降低的细胞角蛋白5的表达水平指示对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂的至少部分的耐药性，而其中相对于标准样品中观察到的水平升高的细胞角蛋白5的表达则指示对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂的敏感性；
c)确定患者样品是否显示出前列腺细胞谱系的基底细胞型表型的征象，其中这些征象的存在指示对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂的敏感性；
d)测量患者样品中激肽释放酶3，雄激素受体和细胞角蛋白5的表达水平，其中相对于标准样品中观察到的水平升高的激肽释放酶3和/或雄激素受体的表达水平，以及其中相对于标准样品中观察到的水平降低的表达水平，指示对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂的至少部分的耐药性；而其中相对于标准样品中观察到的水平降低的激肽释放酶3和/或雄激素受体的表达，以及其中相对于标准样品中观察到的水平升高的细胞角蛋白5的表达水平，则指示对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂的敏感性；
e)测量患者样品中SCEL，ANXA3，CST6，LAMC2，ZBED2，EREG，AXL，FHL2，PLAU和/或ARNTL2的表达水平，其中相对于标准样品中观察到的水平降低的SCEL，ANXA3，CST6，LAMC2，ZBED2，EREG，AXL，FHL2，PLAU和/或ARNTL2的表达水平指示对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂的至少部分的耐药性，而其中相对于标准样品中观察到的水平升高的SCEL，ANXA3，CST6，LAMC2，ZBED2，EREG，AXL，FHL2，PLAU和/或ARNTL2的表达则指示对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂的敏感性；
f)测量患者样品中EPHA2的表达水平，其中相对于标准样品中观察到的水平降低的EPHA2表达水平指示对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂的至少部分的耐药性，而其中相对于标准样品中观察到的水平升高的EPHA2的表达则指示对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂的敏感性；和
g)测量患者样品中UPA的表达水平，其中相对于标准样品中观察到的水平降低的UPA表达水平指示对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂的至少部分的耐药性，而其中相对于标准样品中观察到的水平升高的UPA的表达则指示对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂的敏感性。
14.一种为罹患癌症的患者建立治疗方案的方法，包括如下步骤根据权利要求5，6，7，8，9，10，11，12或13中的任一项确定患者是否被预测为对蛋白酪氨酸激酶激酶抑制剂例如N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺具有应答性，并且如果患者样品被预测为对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂是耐药的，则采用更积极的治疗方案，或者如果患者样品被预测为对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂是敏感的，则采用典型的治疗方案。
15.一种使用替代标志来预测罹患癌症的患者对蛋白酪氨酸激酶抑制剂的应答性的方法，包括下述步骤比较在施用蛋白酪氨酸激酶抑制剂例如N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺之前和之后的预测性多核苷酸或多肽标志表达水平，其中相对于没有所述施用的情况所述预测性标志在所述施用之后的表达降低，指示所述患者对所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂具有应答性，其中所述预测标志由表2，3，4或5中给出的一种或多种敏感性标志所代表。
全文摘要
本发明描述了若干多核苷酸，它们已被发现与细胞(例如前列腺细胞系)对可与蛋白酪氨酸激酶相互作用并调节(例如抑制)蛋白酪氨酸激酶的化合物的治疗的相对内在敏感性或耐药性有关，其中所述蛋白酪氨酸激酶例如Src酪氨酸激酶家族的成员，如Src、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、Lck和Lyn，以及其他蛋白酪氨酸激酶，包括Bcr-abl、Jak、PDGFR、c-kit和Eph受体。这些多核苷酸已显示出在预测前列腺细胞系对所述化合物的耐药性和敏感性方面的用处。一些多核苷酸的表达水平或磷酸化状态受到特定蛋白酪氨酸激酶抑制剂化合物处理的调节，从而表明这些多核苷酸参与了蛋白酪氨酸激酶例如Src酪氨酸激酶的信号转导途径。这些表达水平与药物敏感性或耐药性高度相关并且被化合物处理所调节的多核苷酸包括多核苷酸预测子(predictor)或标志系列(marker set)，它们在预测药物应答的方法中有用，而且可在疾病管理(disease management)中作为预报或诊断指示物，特别是在那些疾病进程涉及藉由蛋白酪氨酸激酶途径(如Src酪氨酸激酶途径)的信号传导的疾病领域中，例如前列腺癌中。
文档编号C12Q1/68GK101631877SQ200880007775
公开日2010年1月20日 申请日期2008年1月8日 优先权日2007年1月9日
发明者飞 黄, 埃德温·A·克拉克, 王希德 申请人:百时美施贵宝公司