目标核酸序列的扩增方法和用于该方法的探针的制作方法

专利名称：目标核酸序列的扩增方法和用于该方法的探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及在纟果针存在下扩增目标核酸序列的方法和用于 该方法的探针。而且，本发明还涉及在纟果针存在下扩增目标核 酸序列的干扰的抑制方法、以及目标核酸序列的分析方法。
背景技术：
近年来，作为检测基因的多态性和突变的方法，分析由目
标核酸序列与检测用探针所形成的双链核酸的熔解温度(Tm: melting temperature )的方法得到实用化。这种方法由于通过例 如前述双链的熔解曲线的分析而进行，因此#L称为熔解曲线分 析或Tm分析。Tm —般按以下方式定义。当加热含有双链DNA 等双链核酸的溶液时，260nm处的吸光度上升。这是因为，双 链核酸中两条链间的氢4建由于加热而解开，解离成单《连核酸(核 酸的熔解)。而且，当所有的双链核酸解离而形成单《连核酸时， 其吸光度呈现出加热开始时的吸光度(仅双链核酸时的吸光度) 的约1.5倍左右，由此可以判断熔解结束。基于这种现象，所谓 熔解温度Tm ( °C ) —般定义为吸光度达到吸光度总上升量的50 %时的温度。
单核香酸多态性是由于检测对象位点的单核苦酸的置换 (点突变)而产生的。因此，为了分析前述检测对象位点是哪 种多态性，需要判断单核苷酸的差异。因此，在前述的Tm分析 中，根据Tm值的差异来分析这种单核苷酸的差异。以下进行具 体说明。而且，方便起见，将检测对象位点的多态性称为突变 型和野生型。
双链核酸的同源性越高则Tm值越高，同源性越4氐则Tm值越低。因此，例如，在设计与含有突变型的一全测对象位点的目 标核酸序列完全互补的检测用探针(以下，称为"突变型探针") 时，前述突变型探针和检测对象位点为突变型的目标序列形成 的双链核酸的Tmmut值，显示出比前述突变型纟笨针和4企测对象位
点为野生型的目标序列所形成的双《连核酸的TmwuJ直更高的 值。通过利用该性质的Tm分析，如下所述，可以分析多态性。 首先，作为评价基准，预先确定使用前述突变型探针时的前述 Tmmut值和TmwUd值。然后，使检测对象位点的碱基未知的分析 对象的目标核酸序列与前述突变型探针形成双链核酸，对形成 的双链核酸实施加热处理，测定表示伴随温度上升的双《连核酸 的解离的吸光度等信号值。然后，制成表示伴随温度变化的信 号值的变动的熔解曲线，确认预先确定的Tnimut值和Tmwnd值的 任一个中是否存在峰。其结果是，在Tmmut值附近存在峰时，由 于与前述突变型纟笨针100%匹配，可以判断目标核酸序列中的检 测对象位点为突变型的多态性。另一方面，在TmwUd值附近存 在峰时，由于与前述突变型探针有l个石成基错配，因此可以判断 目标核酸序列中的检测对象位点是野生型的多态性。而且，还 可以判断多态性是纯合性还是杂合性。也就是说，在分析一对 等位基因的多态性时，当Tm，t值附近和Tmwnd值附近这两处都 存在峰时，可以判断为杂合性，另一方面，只在Tm咖t值附近存 在峰时，可以判断为突变型的纯合性，只在TmwUd值附近存在 峰时，可以判断为野生型的纯合性。而且，在使用与含有野生 型的检测对象位点的目标核酸序列完全互补的检测用探针(以 下，称为"野生型探针")时，作为评价基准，如果预先设定前 述野生型探针和检测对象位点为野生型的目标序列所形成的双 链核酸的Tmwud值以及前述野生型探针和检测对象位点为突变 型的目标序列所形成的双链核酸的Tmmut值，则可以同样判断。而且，野生型探针的情况下，前述野生型探针和检测对象位点
为野生型的目标序列所形成的双链核酸的Tmwud值，显示出比
前述野生型探针和检测对象位点为突变型的目标序列所形成的
双链核酸的Tm,t值更高的值。
此外，在这种利用Tm分析来进行的多态性的分析方法中， 为了更为简化，在前述检测用探针的存在下进行前述目标核酸 序列的扩增反应，直4妻使用前述扩增反应后的反应液，而进行 信号值的测定。如果通过这种方法，可以省略在扩增反应后向 前述反应液中另外添加前述4全测用挥:4十的工序，因此可以实现 简化。而且，如果在前述反应液中预先添加;险测用4笨4f"，例如 可以维持前述反应液的密闭状态，因此可以防止污染。
专利文献l:日本特开2005-58107号公报

发明内容
但是，在不存在探针下进行扩增反应后，向该反应液中添 加探针并进行Tm分析的方法，以及在探针存在下进行扩增反应 并使用该反应液而进行Tm分析的方法中，已知例如即4吏才莫板核 酸和探针相同，在后者的方法中发现了发生如下问题的情况。 也就是说，问题在于，即使使用多态性为已知的目标核酸序列， 即，使用已知在Tmwi!d值和Tmmut值中哪一个处出现峰的目标核 酸序列时，也由于峰小而难以判断，或者看不到峰。尤其是， 在已知是杂合性的试样时，理论上认为在Tmwud值和Tmmut值处 都能看见同等程度的峰，但实际上却发现难以判断与前述探针 完全互补的目标序列的峰(例如，使用突变型探针时，Tmmut 值的峰)这样的情况。
因此，本发明的目的在于提供即使在探针存在下也能扩 增目标核酸序列的扩增方法、抑制前述探针对扩增的干扰的方法、和目标核酸序列的分析方法、以及用于上述方法的4果针。
为了实现前述目的，本发明的扩增方法的特征在于，其为 一种在探针存在下扩增模板核酸中的目标核酸序列的方法，其 包括在能与前述目标核酸序列杂交的探针的存在下，通过由引 物起始的延伸反应而扩增前述目标核酸序列的工序，作为前述
探针，使用下述探针由前述探针和与前述探针互补的互补链 所形成的双链核酸的熔解温度显示为前述延伸反应的反应温度 以下的探针。本发明中，以下也将目标核酸序列称为目标序列。
本发明的扩增干扰的抑制方法的特征在于，其为 一 种在探 针存在下扩增模板核酸中的目标核酸序列时，抑制前述目标核 酸序列的扩增中的干扰的方法，前述目标核酸序列的扩增方法 是本发明的扩增方法。
本发明的分析方法的特征在于，其为使用能与目标核酸序 列杂交的^t笨针的前述目标核酸序列的分析方法，其具有下述 (A)和(B )工序
(A) 通过本发明的扩增方法，在前述探针存在下，扩增 才莫^1核酸中的前述目标核酸序列的工序；
(B) 前述(A)工序后，改变前述(A)工序的反应液的 温度，测定表示获得的扩增产物和前述探针形成的双链核酸的 熔解状态的信号值的工序。
另外，本发明的探针的特征在于，其为在前述本发明的扩 增方法中使用的探针，其是在前述探针和与前述探针互补的互 补链形成双链核酸时，前述双链核酸的熔解温度显示为前述延 伸反应的反应温度以下的探针。
本发明人在纟笨针存在下进行扩增反应并^f吏用该反应液进行 Tm分析时，为了弄清楚前述问题所发生的原因，进行了积极的 研究。结果发现，在前述扩增反应前在反应液中预先添加的探针，在扩增反应时会与模板核酸杂交，例如，可能会干扰引物 的退火和由退火的引物起始的延伸。这样一来，可认为，如果 引物与模板核酸的退火和由引物起始的延伸受到干扰，虽然存 在目标序列，但其扩增并不充分，因此结果是会发生难以检测
峰这样的问题。因此，本发明人发现，通过设计出该Tm值与延 伸反应温度满足前述关系的探针，可以避免前述问题。其理由 如下。
在使用探针的多态性分析中，为了提高分析精度，通常将 探针设计成与目标序列特异性杂交。为了这样使探针特异性杂 交，一般采取使探针长度相对变长的方法。但是，前述探针相 对越长，其Tm值(即，例如，与和前述探针完全互补的序列所 构成的双链核酸的Tm值)相对更高，因此一旦形成双链，如果
不在更高的温度下探针就难以从模板解离。因此，本发明人发 现，难以检测峰的以往的问题原因是为了核酸扩增后的多态 性的Tm分析而设计成与目标核酸特异性杂交的探针，在核酸扩 增时与模板核酸杂交，干扰了引物的退火和由退火的引物起始 的延伸反应。于是，本发明人想到，使探针的碱基序列为Tm 值、即前述揮:针和与前述纟笨针互补的互补4连(例如，完全互补 的互补链)形成的双链核酸的Tm值显示为前述延伸反应温度以 下的碱基序列，以使得至少在核酸扩增中的延伸反应时，探针 难以与模板核酸杂交。根据本发明，即使在探针存在下扩增目 标序列，在前述延伸反应的反应温度下，前述探针也不易与模 板核酸杂交。因此，目标序列的核酸扩增不易因探针而受到干 扰，具体而言，例如，引物与模板核酸的退火和由前述引物起 始的延伸反应不易受到干扰，其结果是，能够充分进行前述目 标序列的扩增。尤其是，在与和前述探针完全互补的互补链的 Tm值、以及与和前述探针只有一个碱基不同的互补链Tm值中，
10由于前者的值高，因此认为目前与只有一个碱基不同的目标序 列相比，完全互补的目标序列更容易受到探针的影响。但是， 通过本发明的纟笨针可以避免这种问题，因此例如如前所述，即
使是杂合性的模板核酸，也能够实现同样的扩增效率，Tm分析 中也同样能够检测出峰。因此，根据本发明，例如能够在Tm分 析中以比以往更高的可靠度判断有无峰。因此，本发明可以说 在基因分析的领域中是一种极为有用的技术。
另外，给在探针存在下进行核酸扩增时的Tm分析造成的问 题及其原因是由本发明人初次获得的见解。而且，如前所述， 虽然有为了使探针与目标序列特异性杂交而将探针的Tm值设 定得相对较高，但本发明这样，为了避免探针对核酸扩增所造 成的影响，而根据其Tm值与延伸反应的温度关系设计探针，这 是由本发明首次提出的。


图l是表示比较例中的Tm分析结果的图。 图2是表示本发明的实施例中的Tm分析结果的图。 图3是表示本发明的实施例中的Tm分析结果的图。
具体实施例方式
<扩增方法〉
本发明的扩增方法，如前所述，其特征在于，其为在探针 存在下扩增才莫^^反核酸中的目标核酸序列的方法，其包括在前述
列的工序，
作为前述探针，使用本发明的探针、即由前述探针和与前 述探针互补的互补链所形成的双链核酸的熔解温度显示为前述延伸反应的反应温度以下的探针。以下，将本发明中使用的前 述探针称为本发明的探针。本发明的扩增方法中，前述探针优
选为由前述纟采4十和与前述挥:针完全互补的互补链所形成的双
链核酸的熔解温度显示为前述延伸反应的反应温度以下的探针。
这样一来，通过在本发明的探针的存在下进行核酸扩增反 应，如前所述，例如抑制了引物与模板核酸的退火以及由发生 退火的引物起始的延伸中的干扰，能够进行目标序列的扩增。 而且，本发明的扩增方法的特征在于，其使用满足前述条件的 探针，核酸扩增方法的种类和条件等没有任何限制。
而且，本发明中，为了对所使用的探针进行规定，而将前
述探针的性质规定为由前述探针和与前述探针完全互补的互 补链形成双链核酸时，"由前述探针和与前述探针完全互补的互 补链所形成的双《连核酸的熔解温度显示为前述延伸反应的反应 温度以下"。也就是说，前述所谓"完全互补的互补链"始终是用 于规定所使用的探针的性质的条件，在使用时，并不作为前述 探针和与其完全互补的互补链形成双《连核酸的条件。这样，在
本发明中，例如使前述探针和与前述引物完全互补的互补链形 成双链核酸的工序并不是必需的。此外，例如，在后述的目标 核酸序列的分析方法等中，在使扩增反应后的扩增产物和前述 探针形成双链时，前述探针杂交的对象不限于与前述探针完全 互补的互补链，前述探针也可以与具有1个碱基或数个碱基错配 的互补4连杂交。
本发明中，以下，将与前述探针完全互补称为"完全匹配"， 将与前述探针完全匹配的互补链称为"完全匹配互补链"，将由 前述探针和前述完全匹配互补链所形成的双《连核酸称为"完全 匹配的双链核酸"，将前述完全匹配的双链核酸的Tm值称为"Tmper值"。而且，将除了 一个碱基(或多个碱基)外与前述探
针完全互补称为"错配"，将与前述探针错配的互补链称为"错配 互补链"，将由前述探针和前述错配互补链所形成的双链核酸称
为"错配的双链核酸"，将前述错配的双链核酸的Tm值称为 "TmMis值"。此外，本发明中，通过核酸扩增方法扩增的序列可 以是目标序列和与其互补的序列，也可以是包括含有前迷目标 序列的区域的序列和与其互补的序列。
本发明的探针例如只要是前述完全匹配的Tmper值与前述
延伸反应温度的关系满足"Tmper值《延伸反应温度(。C )"的探
针即可，其碱基序列和碱基数没有任何限定。核酸扩增中，通
常包括以下3个步骤双链核酸的熔解(向单链核酸的解离)、 引物与单链核酸退火、和由发生退火的引物起始的互补链的延 伸反应。前述延伸反应中，退火是前提，在核酸扩增中，例如 退火温度和延伸反应一般设定在相同温度。此时，本发明中的 "延伸反应温度"例如还可以替换为退火温度。
本发明的探针的碱基序列可被设计为例如，在设定了延 伸反应的反应温度的情况下，Tm值在前述延伸反应温度以下。 考虑Tm值的探针的设计方法没有特别限制，可以采用以往的公 知方法。探针的序列和Tm值，可以通过例如以往公知的 MELTCALC软件(http: 〃www.meltcalc.com/)和田比邻法(Nearest Neighbor Method )等确定。对于使用这种软件等设计的探针， 优选例如在实际进行核酸扩增的条件下确认Tmper值。而且，本 发明的探针不仅例如如前所述根据延伸反应温度而确定碱基序 列，还根据前述4笨针的Tmpe/f直设定前述延伸反应温度，从而使 其具备本发明的条件。也就是说，本发明的探针只要是探针的 Tmper值和延伸反应温度最终满足式"Tmper值《延伸反应温度"
即可，用于满足前式的方法例如可以调整前述探针的碱基序列，
13也可以调整延伸反应温度。由前述探针和前述完全匹配互补链所形成的双链核酸的Tmper值只要满足"Tmper值 < 延伸反应温度(°C)"即可。TmPer值与延伸反应温度之差例如为o。c以上(约o。c以上)，其上限没有特别限制，例如，优选为0-30。C,更优选为0 20。C，进一 步优选为0 10。C,特别优选为0-2t:。前述^~配互补《连与前述#:针的同源性比前述完全匹配互补 链的同源性低，因此TniMis值比Tmper值低(TmMis值< TmPeJii《 延伸反应温度(。C))。本发明的探针优选为由前述探针和前 述完全匹配互补链所形成的双链核酸的Tmper值、与由前述探针 和前述错配互补《连所形成的双链核酸的TmMis值之差例如在TC 以上(约rc以上)，更优选在3。C以上(约3。C以上)，特别优选 在5。C以上(约5。C以上)。这样一来，通过充分设定Tmper值和 TmMis值之差，例如在制成后述那样的熔解曲线时，容易判断 Tmper值的峰和TmMis值的峰，分析精度也进一步提高。只要前述一果针的Tmper值和延伸反应温度满足前述关系即 可，前述探针的长度没有特别限定。前述探针例如能与目标序 列特异性杂交，因此优选相对长的序列。作为前述长度例如为 5~50碱基，优选为10 30碱基。本发明的探针例如可以是未标记的探针，也可以是用标记 物质标记的标记纟罙针，尤其优选是前述标记纟笨针。通过这种标 记4笨针，例如，在后述的目标序列的分冲斤方法中，可以测定标 记物质的信号，作为表示前述扩增产物和前述探针形成的双链 核酸的熔解状态的信号值。作为前述标记物质，例如可以例举荧光色素、荧光团等荧 光物质。作为前述标记探针的具体例子，例如，优选用前述荧 光物质标记的、单独显示荧光且荧光由于形成杂交体而减少(例如，猝灭)的探针。利用这种荧光猝灭现象(Quenching phenomenon)的探针 一般称为荧光猝灭探针。其中，作为前述 探针，优选多核苷酸的3，末端或5，末端被荧光物质标记的探针， 被标记的前述末端的石咸基优选为C。此时，优选将前述标记探 针的碱基序列设计成在前述标记探针杂交的；威基序列中，与 前述标记探针的末端碱基C配对的碱基或者从前述配对的碱基 开始距离l碱基~ 3碱基的碱基为G。这种探针一般被称为鸟嘌 呤猝灭探针，已知有所谓的QProbe (注册商标)。这种鸟嘌呤 摔灭探针一旦与碱基序列杂交的话，被荧光物质标记的末端的 C由于靠近前述石威基序列中的G，因此呈现出前述荧光物质的发 光变弱(荧光强度减少)的现象。如果使用这种探针，则可以 根据信号的变化容易地确认杂交和解离。作为前述荧光物质，没有特别限制，可以例举例如荧光素、 磷光体、若丹明、聚曱炔染料衍生物等荧光色素，作为市售的 焚光物质，可以例举例如BODIPY FL (商标，Molecular probe 乂i^司制)、FluorePrime (商品名，Amersham Pharmacia公司制)、 Fluoredite (商品名，Millipore公司制)、FAM ( ABP>司制)、 Cy3和Cy5 ( Amersham Pharmacia乂^司制)、TAMRA ( Molecular probe公司制)等荧光色素。在一个反应系中使用2种以上本发明的挥:针时，例如，优选 用不同的荧光物质(在不同波长下进行检测的荧光物质)标记 各探针。前述荧光物质的组合例如只要能在不同条件下检测即 可，没有特别限定，可以例举例如太平洋蓝(Pacific Blue)(检 观'J >皮长450 ~ 480nm ) 、 TAMRA (才企观'J ;皮长585 ~ 700nm )禾口 BODIPYFL ( 4全测波长515 ~ 555nm)的组合等。此外，5，末端用荧光色素标记的标记探针，例如为了预防 扩增反应中探针自身延伸，也可以在其3，末端上进一步添加磷本发明中，作为前述核酸扩增方法，没有特别限制，可以例举例如PCR (聚合酶链式反应)法、NASBA(依赖核酸序列 的扩增，Nucleic acid sequence based amplification) 法、TMA (转录介导的扩增，Transcription-mediated amplification ) 法、 SDA(链置换扩增，Strand Displacement Amplification )法等， 这其中优选PCR法。以下，以PCR法为例，对本发明进行说明， 但不限于此。作为使用本发明的试样，例如只要含有作为模板的核酸即 可，没有特别限制。作为具体例子，例如可以例举全血、口腔 内细胞(例如，口腔粘膜)、指曱或毛发等体细胞、生殖细胞、 痰、羊水、石蜡包埋组织、尿、胃液(例如，胃洗液)等、以 及它们的悬浮液等。核酸扩增的反应液中的试样的添加比例没有特别限制。作 为具体例子，在前述试样为生物试样(例如，全血试样)时， 前述反应液中的添加比例的下限例如优选为0.01体积％以上， 更优选为0.05体积％以上，进一步优选为0.1体积％以上。而且， 前述添加比例的上限也没有特别限定，4旦例如优选为2体积％以 下，更优选为1体积％以下，进一步优选为0.5体积％以下。此外，如后所述，对核酸扩增的反应液进行光学检测时， 尤其是用标记纟笨针进行光学冲全测时，前述反应液中的全血试样 等生物试样的添加比例例如优选设定为O.l ~ 0.5体积％ 。 PCR 反应中，通常为了核酸变性(向单链核酸的解离)而实施热处 理，但通过这种热处理，试样中所含的糖和蛋白质等变性，存 在产生不溶性的沉淀物和浑浊等的担忧。因此，在通过光学方 法确认扩增产物的有无和多态性时，这种沉淀物和浑浊的发生 可能会对测定精度产生影响。然而，反应液中的全血试样的添加比例如果设定在前述范围内，虽然机理并不清楚，但例如由 于可以充分防止由于变性产生的沉淀物等所造成的影响，因此 可以提高光学方法的测定精度。此外，由于全血试样中的杂质 所导致的对PCR的干扰也被充分抑制，因此可以进一步提高扩
增效率。
此夕卜，前述反应液中的全血试样的比例不 <义可以用前述体
积比例(例如，0.1 ~ 0.5体积％ )表示，还可以用血红蛋白(以 下，称为"Hb")的重量比例来表示。此时，前述反应液中的全 血试样的比例换算成Hb量，例如优选在0.565 ~ 113g/L的范围， 更优选在2.825 ~ 56.5g/L的范围，进一步优选在5.65 ~ 28.25g/L 的范围。此外，前述反应液中的全血试样的添加比例例如可以 满足前述体积比例和Hb重量比例这两者，也可以满足其中任一 者。
作为全血，例如可以是溶血的全血、未溶血的全血、抗凝 固全血、含凝固成分的全血等中的任意一种。
本发明中，试样中所含的模板核酸例如是DNA。前述DNA 例如可以是生物试样等试样中原本所含的D N A ，也可以是通过 核酸扩增而扩增的扩增产物DNA。后者的情况下，可以例举由 前述试样中原本所含有的RNA (总RNA、 mRNA等)通过逆转 录反应而生成的cDNA。
本发明的扩增产物的制造方法中，例如，优选在核酸扩增 开始前，在前述反应液中进一步添力口白蛋白。通过添力口这种白 蛋白，例如可以进一步降低由前述沉淀物和浑浊的产生而造成 的影响，而且还可以进一步提高扩增效率。
前述反应液中的白蛋白的添力o比例例如为0.01 ~ 2重量％ 的范围，优选为0.1~1重量％,更优选为0.2~ 0.8重量％ 。作为 前述白蛋白，没有特别限制，可以例举例如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、马血清白蛋白等， 这些物质可以^使用其中任一种，也可以一起^f吏用两种以上。下面，关于本发明的扩增产物的制造方法，列举一个例子 进行说明，所述例子为以DNA作为模板核酸，在本发明的探 针的存在下，通过采用用于扩增目标核酸的引物的PCR,对全 血试样扩增目标核酸。而且，本发明的特征在于使用本发明的 探针，其它构成及条件没有任何限定。首先，制备PCR反应液。前述反应液中的纟罙针的添加比例 没有特别限定，例如优选在前述反应液中4姿10 ~ 400nmol/L的范 围添加，更优选为20 ~ 200nmol/L。此外， -使用荧光物质作为4果 针的标记时，例如，为了调整检测的荧光强度，可以一起使用 与标记探针序列相同的未标记挥:针，该未标记^罙针可以在其3， 末端上添加磷酸。此时，标记探针和未标记探针的摩尔比例如 优选为1: 10 ~ 10: 1。前述反应液中的引物的添加比例没有特别限定，例如优选 按O.l ~ 2jimol/L添加，更优选为0.25 ~ 1.5|imol/L，特别优选为 0.5 ~ l|amol/L。而且，作为引物，可以4吏用由正向引物和反向 引物所构成的一对引物对，此时，优选在前述范围内添加两条 引物。正向引物(F)和反向引物(R)的添加比例(摩尔比F: R)没有特别限定，例如，优选为l: 0.25~1: 4,更优选为l: 0.5-1: 2。而且，引物和引物对例如可以是l种，也可以是2 种以上。本发明中，所使用的引物例如可以才艮据l个反应液中所 扩增的目标序列的数目而适当使用。前述反应液中的全血试样的比例没有特别限定，优选为前 述范围。全血试样可以直接添加在反应液中，也可以预先用水 或緩冲液等溶剂稀释之后再添加到反应液中。预先稀释全血试 样时，其稀释率没有特别限制，例如，可以设定为反应液中的18最终的全血添加比例在前述范围内，例如为100 ~ 2000倍，优选 为200 ~ IOOO倍。
前述反应液中的其它组成成分没有特别限制，可以例举以 往公知的成分，其比例没有特别限定。作为前述组成成分，可 以例举例如DNA聚合酶、核苷酸(三磷酸核苷(dNTP))和溶 剂。jt匕夕卜，3o前戶斤述，前述反应液l尤选还含有白蛋白。而且， 在前述反应液中，各组成成分的添加顺序没有任何限制。
作为前述DNA聚合酶，没有特别限制，例如可以使用以往 公知的耐热性细菌来源的聚合酶。作为具体例子，可以是水生 栖热菌(TTzwww "《wa"'cw)来源的DNA聚合酶(美国专利第 4,889，818号和第5,079，352号)(商品名Taq聚合酶)、嗜热栖热 菌(772ermw f/zwmop/n7w )来源的DNA聚合酶(WO 91/09950 )
(rTth DNA聚合酶)、强烈火球菌(/鹏'o纖)来源 的DNA聚合酶(WO 92/9689 ) ( Pfu DNA聚合酶Stratagene公 司制)、嗜热球菌(7Tzwmococcw/"or"/")来源的DNA聚合酶
(EP隱A 455 430 )(商才示Vent: New England Biolabs7>司制)、超 嗜热古菌(TTzermococcw Aod"A:"raews")来源的DNA聚合酵(商 品名KODDNA聚合酶)等能够商业获得的聚合酶，这其中优选 水生栖热菌(T72^mws a《w"〃cw )来源的耐热性DNA聚合酶。
前述反应液中的DNA聚合酶的添加比例没有特别限定，例 如为l 100U/mL,优选为5 50U/mL,更优选为20 ~ 30U/mL。 而且，DNA聚合酶的活性单位(U) —般被定义为以活化鲑 鱼精子DNA作为模板引物，以活性测定用反应液中74。C下30分 钟内将全部10nmol的核苷酸吸收到酸不溶性沉淀物的活性为 1U。前述活性测定用反应液的组成例如为25mmol/L TAPS緩冲 液(pH9.3， 25°C)、 50mmol/LKCl、 2mmol/L MgCl2、 lmmol/L 琉基乙醇、200[imol/L dATP、200|imol/:L dGTP 、 200jamol/;L dTTP、100|imol/L [ a-32P ] dCTP、 0.25mg/mL活化鲑鱼精子DNA。作为前述三磷酸核苷，通常可以例举dNTP ( dATP、 dCTP、dGTP、 dTTP、和/或dUTP)。前述反应液中的dNTP的添加比例没有特另'J限定，例如为0.01 ~ lmmol/L ， 优选为0.05 ~0.5mmol/L, 更Y尤选为0.1 ~ 0.3mmol/L。作为前述溶剂，可以例举例如Tris-HCl、三(羟曱基)甲基甘氨酸(Tricine)、 MES、 MOPS、 HEPES、 CAPS等緩冲液，可以使用市售的PCR用緩冲液和市售的PCR试剂盒的緩沖液等。而且，前述PCR反应液还可以含有甘油、肝素、甜菜石威、 KC1、 MgCl2、 MgS04、 DMSO等，它们的添加比例例如只要设 定在不干扰PCR反应的范围内即可。前述反应液的总体积没有特别限制，例如可以根据所使用 的机器(热循环仪)、和管或芯片等容器等而适当确定，但通常 为l 500[iL,优选为10 ~ IOOjiL。然后，进行PCR。 PCR通常以(1)双链核酸向单链核酸的 解离、(2)引物与单链核酸退火、(3)退火的引物的延伸(聚 合酶反应)这3个步骤为1个循环。各步骤中的温度条件没有特 别限制，如前所述，前述(3 )的延伸反应温度只要在前述探针 的Tmper值以上即可。前述(1 )的解离步骤可以例举例如，90~ 99。C下1 ~ 120秒、， <尤选92~ 95。C下l ~ 60秒、，前述(2)的退火 步骤可以例举例如40~ 70。C下l ~ 300秒，优选50~ 70。C下5 60 秒，前述(3)的延伸步骤可以例举例如50 80。C下l ~ 300秒， 优选50~ 75。C下5 ~ 60秒的条件，但并不限于此。P C R的循环数没有特别限定，但例如优选为3 0个循环以上， 其上限没有特别限定，例如为总计100个循环以下，优选为70 个循环以下，更优选为50个循环以下。如上所述，在本发明的探针的存在下，能够扩增目标序列。 根据该方法，如前所述，引物与模板核酸的退火和由退火的引 物起始的延伸不易受到探针干扰，因此即使在前述目标序列含 有与前述探针完全匹配的互补链和错配的互补链中的任 一 者的 情况下，也可以以比以往更优异的效率进4亍扩增。而且，本发 明的扩增方法也可以称为目标序列的扩增产物的制造方法。
本发明的扩增方法还可以进一步包括4全测由前述扩增反应 而获得的目标序列的扩增产物的工序。由此，也可以检测扩增 产物的有无、以及目标序列的多态性。对于这种实施方式，下 面将其作为本发明的目标序列的分析方法的一个方式来说明。
<目标序列的分析方法〉
本发明的目标序列的分析方法，如前所述，其特征在于， 其为使用能与目标核酸序列杂交的探针进行的前述目标核酸序
列的分析方法，其具有下述(A)和(B)工序
(A) 通过本发明的扩增方法，在前述探针的存在下，扩 增前述目标核酸序列的工序；
(B) 前述(A)工序后，改变前述(A)工序的反应液的 温度，测定表示获得的扩增产物与前述探针形成的双链核酸的 熔解状态的信号值的工序。
根据本发明的目标序列的分析方法，例如可以进行前述目 标序列的扩增的有无、和前述目标序列中多态性的判断等。而 且，本发明的分析方法的特征在于，利用本发明的扩增方法来 扩增目标序列，也就是说在本发明的探针存在下扩增目标序列， 例如，其它构成和条件等没有任何限定。
本发明的目标序列分析方法例如优选进一步具有下述(C) 工序。这样，通过确认伴随前述反应液的温度变化的信号值的 变动，可以判断如前所述的前述目标序列的扩增的有无和多态性。
(C)根据伴随温度变化的前述信号值的变动而分析前述 目标序列的工序。
本发明中，前述(C)工序优选为采用表示伴随温度变化 的信号值的变动的熔解曲线进行的熔解曲线分析。熔解曲线一 般是显示出各温度与表示试样的熔解状态的信号值或信号值的 微分值(以下，称为"信号微分值")之间关系的图。如果使用 这种熔解曲线，可以容易地通过例如目视而判断例如Tmper值和
Tm廳值处有无峰。
由于前述熔解曲线容易判断信号的变化量，因此优选为表 示前述温度与信号微分值之间关系的图。前述信号微分值例如 可以用"dF/dT，，表示，也可以用"-dF/dT，，表示。dF表示信号值的 变化量，dT表示温度的变化量。信号的发生由于试样的熔解而 受到抑制时，在用"dF/dT"表示信号微分值的熔解曲线中，峰为 波谷型，在用"-dF/dT，，表示信号微分值的熔解曲线中，峰为山 型。而且，由于试样的熔解而发生信号时，在用"dF/dT"表示信 号微分值的熔解曲线中，峰为山型，在用"-dF/dT"表示信号微 分值的熔解曲线中，峰为波谷型。前述信号例如可以由于试样 的非熔解而发生，由于试样的熔解而导致信号发生被抑制，相 反，也可以由于试样的非熔解而导致信号发生被抑制，由于前 述试样的熔解而导致发生信号。信号在试样的熔解和非熔解下 都发生，而且，在用前述任一式表示信号微分值时，峰的大小 可以用信号微分值的绝对值的大小来评价。
通过本发明的分析方法分析前述目标序列的多态性时，例 如，所谓前述目标序列是指具有发生多态性的检测对象位点的 序列，本发明的探针为与其互补的序列。而且，前述(C)工 序中，根据前述信号值的变动，可以分析前述目标序列的4全测
22对象位点的多态性。如前所述，探针为突变型探针时，如果在 Tmper值(即Tmmut值)附近检测到峰，则可以判断多态性为突
变型，如果在TmMis值(即Tm^d值)附近检测到峰，则可以判 断多态性为野生型。而且，如果只在一者的Tm值处^^测到峰， 则可以判断为纯合性的多态性，如果在两者的Tm值处均检测到 峰，则可以判断为杂合性的多态性。而且，本发明中，方便起 见，将检测对象位点的多态性称为突变型和野生型，但这并不 限制本发明。
前述(B)工序中，表示前述扩增产物和前述探针形成的 双链核酸的熔解状态的信号值的测定，如前所述，可以测定 260nm处的吸光度，也可以测定标记物质的信号。前者例如优 选在本发明的#:针为未标记探针时采用。后者例如优选在本发 明的挥:针为用标记物质标记的标记纟笨针时采用。作为前述标记 探针，可以例举例如单独显示信号且由于形成杂交体而不显示 信号的标记探针，或者单独不显示信号且由于形成杂交体而显 示信号的标记探针。如果是前述的探针，在与目标序列形成杂 交体(双链核酸)时不显示信号，而探针由于加热游离时则显 示信号。此外，如果是后者的探针，通过与目标序列形成杂交 体(双链核酸)而显示信号，而探针由于加热游离时则信号减 少(消失)。因此，通过在信号特有的条件(吸收波长等)下检 测这种标记物质所产生的信号，与前述260nm处的吸光度测定 一样，也可以进行杂交体的熔解的进行和Tm值的确定等。
本发明中，如前所述，能够在同一反应液中对2个以上的目 标序列进行分析，或者对l个目标序列中的2个以上的检测对象 位点的多态性进行分析等。这种情况下，前述(A)工序的核 酸扩增的反应液中，可以#4居所分析的目标序列和^r测对象位 点，预先添加例如2种以上的本发明的探针。这样，在使用2种以上的探针时，优选它们分别被可以在不同条件下^全测的不同 标记物质标记。这样，通过使用不同的标记物质，即使是同一 反应液，通过改变片全测条件，也可以分别分析各目标序列和各 4企测对象位点。
下面，就本发明的分析方法，以使用标记探针作为本发明 的探针为例进行说明，但本发明并不限于此。此外，只要没有 特别说明，可以与本发明的扩增方法同样进行。
首先，与前述一样，制备含有标记探针和用于扩增目标序
列的引物的PCR反应液，进行PCR,进行前述目标序列的扩增。 前述反应液例如含有本发明的探针、引物、DNA聚合酶、dNTP 和含有才莫^反核酸的试样等。此外，前述反应液还可以含有能够
在核酸扩增中4吏用的各种添加剂。
然后，直接使用前述PCR反应液，进行获得的扩增产物的 解离(例如，双链DNA等向单链核酸的解离)、和解离出的单 链核酸与前述标记探针的杂交。这例如可以通过前述反应液的 温度变化来进行。
前述解离工序中的加热温度只要是能够解离前述扩增产物 的温度即可，没有特别限定，例如是85 95。C。加热时间也没 有特别限定，通常为1秒 10分钟，优选为1秒 5分钟。
解离出的单链核酸与前述标记探针的杂交，例如可以在前 述解离工序后，通过降低前述解离工序中的加热温度来进行。 温度条件没有特别限定，但在确认前述目标序列是否与前述探 针完全匹配时，优选低于前述标记探针的Tmper值。此外，在确 认目标序列是否与前述探针错配时，以及在确认是完全匹配还 是错配时，优选比TmMis值低。前述杂交的温度没有特别限定， 例如一般为40 ~ 50°C。
然后，改变前述反应液的温度，测定表示前述扩增产物与前述标记探针的杂交产物的熔解状态的信号值。具体而言，例
如，加热前述反应液(前述单链DNA与前述标记探针的杂交产 物)，测定伴随温度上升的信号值的变动。如前所述，在使用末 端的C碱基被标记的探针(鸟噤呤猝灭探针)时，在与单链DNA 杂交的状态下，荧光减少(或猝灭)，解离的状态下，发出荧光。 因此，例如可以缓緩加热荧光减少(或捽灭)的杂交产物，测 定伴随温度上升的荧光强度的增加。
测定荧光强度的变动时的温度范围没有特别限定，例如起 始温度为室温 85。C,优选为25 70。C，终止温度例如为40 105°C。而且，温度的上升速度没有特别限定，例如为O.l ~ 20°C/ 秒，优选为0.3 ~ 5"/秒。
然后，根据前述信号的变动，进行目标序列的分析。此时， 对本发明的探针，预先测定Tmper值和TmMis值。然后，根据得 到的荧光强度，计算各温度下每单位时间的荧光强度变化量， 确认前述Tmper值和TmMis值的任 一 者处是否显示出最大的绝对 值。具体而言，例如，制成由温度与"-d荧光强度增加量/dT"而 绘制成的熔解曲线，确认在前述Tmper值和TmMis值的任 一 者处 是否存在表示最低值的波谷型的峰。此外，例如，在制成由温 度和"d荧光强度增加量/ d T"绘制成的熔解曲线时，确认在前述 Tmp^值和TmMis值的任一者处是否存在表示最高值的山型的 峰。其结果是，如果在前述Tmper值附近可看到峰，则可以判断 前述目标序列与前述探针完全匹配，如果在前述TmMis值附近可 看到峰，则可以判断前述目标序列与前述揮:4i^晉配。而且，如 果前述探针是突变型检测用的话，完全匹配则可以判断多态性 为突变型，错配则可以判断多态性为野生型，相反，如果前述 探针是野生型检测用的话，完全匹配则可以判断多态性为野生 型，错配则可以判断多态性为突变型。此外，与鸟嘌呤猝灭探针相反，使用在与单链DNA杂交的 状态下发出荧光、在解离的状态下荧光减少(或猝灭)的探针 时，緩緩加热发出荧光的杂交产物，测定伴随温度上升的荧光 强度的减少。
此外，本发明中，例如，可以测定杂交体形成时的信号变 动来代替如前所述纟是高含有前述探针的反应液的温度来测定伴 随温度上升的信号变动的方法。也就是说，在降低含有前述4罙 针的反应液的温度而形成杂交产物时，可以测定伴随前述温度 下降的信号变动。
作为具体例子，在使用单独显示信号且由于形成杂交体而
不显示信号的标记探针(例如，鸟嘌呤猝灭探针)时，在单链 DNA和探针解离的状态下发出荧光，而由于温度下降形成杂交 体时，前述萸光则减少(或猝灭)。因此，例如可以〗吏前述反应 液的温度緩緩下降，测定伴随温度下降的荧光强度的减少。另 一方面，在使用单独不显示信号且由于形成杂交体而显示信号 的标记探针时，在单链DNA与探针解离的状态下不发出荧光， 而由于温度下降形成杂交体时，则发出荧光。因此，例如可以 使前述反应液的温度緩緩下降，测定伴随温度下降的荧光强度 的增力口 。
<扩增干扰的抑制方法>
本发明的扩增干扰的抑制方法，如前所述，其特征在于， 其为在探针存在下的目标序列的扩增中，抑制前述目标序列的 扩增的干扰的方法，前述目标序列的扩增方法是本发明的扩增 方法。本发明的特征在于，在探针存在下的目标序列的扩增中 进行本发明的扩增方法，即在本发明的探针存在下扩增目标序 列，其它构成和条件没有任何限制。而且，本发明可以与前述 本发明的扩增方法同样进行。
26<探针〉
本发明的探针如前所述，其特征在于，其为在本发明的扩增方法或本发明的扩增干扰的抑制方法中使用的探针，其是由前述探针和与前述探针互补的互补链所形成的双链核酸的熔解温度显示为前述延伸反应的反应温度以下的探针。前述探针优选为，由前述#笨针和与前述探针完全互补的互补链所形成的双链核酸的炫解温度显示为前述延伸反应的反应温度以下。具体内容如本发明的扩增方法中所述。本发明的探针可以在本发明的抑制方法、扩增方法和分析方法中使用。
<扩增用试剂>
本发明的扩增用试剂的特征在于，其为在本发明的扩增方法、抑制方法或分析方法中使用的试剂，其含有本发明的探针。本发明的扩增用试剂只要含有本发明的探针即可，其它构成没有任何限定。本发明的扩增试剂例如还可以进一步含有用于扩
增目标序列的引物、DNA聚合酶等聚合酶、dNTP等。
本发明的扩增用试剂的形态没有特别限制，例如可以是液体试剂，也可以是使用前悬浮于溶剂中的干燥试剂。此外，本发明的探针和前述引物等其它成分的含量没有特别限定。本发明的扩增用试剂例如可以是扩增用试剂盒，例如，各试剂可以
收纳于相同容器或各自的容器中。此外，前述扩增用试剂盒优选还配备有使用说明书。<探针的设计方法〉
本发明的探针的设计方法的特征在于，其为在探针存在下扩增模板核酸中的目标核酸序列的方法中使用的前述探针的设计方法，将前述探针设计为由前述探针和与前述纟果针互补的互补链所形成的双链核酸的熔解温度显示为前述延伸反应的反应温度以下。本发明中，优选将前述探针i殳计为由前述纟笨针和
27与前述探针完全互补的互补链所形成的双链核酸的熔解温度显示为前述延伸反应的反应温度以下。本发明的i殳计方法，具体可以与前述本发明的扩增方法中说明的方法同样进行。而且，本发明也可称为探针的制造法，包括如前所述设计探针的工序。
下面，就本发明，以实施例为例进行说明，^旦本发明并不限于此。
实施例1
使用试剂盒(商品名QIAamp DNA Mini kit; QIAGEN^>司制)，从呈现出杂合性的多态性CYP2C9 * 3的待测者的血液中纯化基因组。用TE ( 10mmol/L Tris-HCl、 lmmol/L EDTA )将纯化基因组稀释为1/10 (体积)。将该稀释的纯化基因组lfiL添加到下述组成的PCR试剂49fiL中，用热循环4义进行PCR。 PCR的条件为，95。C下处理60秒后，以双链的解离处理l秒和延伸反应处理15秒作为1个循环而重复50个循环。前述解离处理的温度为95°C ,延伸反应处理(包括退火处理)的温度为规定温度(52°C、 58。C或60。C)。然后，PCR反应后，再将前述反应液进行95。C下1秒、40。C下60秒处理，然后将温度的上升速度设为1。C/3秒，从40。C开始加热到95。C,测定经时的荧光强度的变化。测定波长为515~ 555nm (荧光色素BODIPY FL的检测)。
(PCR反应液单位fiL)
蒸馏水 27.610 x Gene Taq緩冲液(无Mg) * 5
10%NaN3 0.2
5U/pL Gene Taq FP* 0.25
80%甘油 9.37
100mmol/L MgCl2 0.752.5mmol/L dNTP 4100pmol/L CYP2C9 F引物 0.5lOO^mol/L CYP2C9 R引物 0.2100|imol/L CYP2C"3用探针 0.04
20% BSA_1
合计49^L
氺商品名Gene T叫FP: NIPPON GENE CO.， LTD.制(引物对)
CYP2C9 * 3 F引冲勿(序歹'J号1 )
5'-gagcccctgcatgcaa-3'
CYP2C9 * 3 R引物 (序歹'J号2 )
5'-gatactatgaatttggggacttcgaa-3'
(突变型检测用探针)CYP2C9 * 3 4笨4十(序歹寸号3 )5'-gggagaagGtcaAGgTatc画(BODIPY FL ) -3'突变型4企测用的CYP2C9 * 3用探针和与前述纟果针完全互补的互补链形成的杂交体(完全匹配双链)的Tmpe/fi为58。C。此外，前述〔丫？209* 3用探针和与前述探针除检测对象位点的l个碱基之外完全互补的互补链形成的杂交体(4晉配双链)的TmMis值为53 °C 。
这些结果示于图1 图3。这些图是表示伴随温度上升的荧光强度的变化的熔解曲线的图，纵轴的微分值表示"-d荧光强度增加量/dT，， (-dF/dT)，横轴表示温度。图1是表示将PCR的延伸反应温度设定在52。C时的熔解曲线的图，图2是表示将前述延伸反应温度设定在58。C时的熔解曲线的图，图3是表示将前述延伸反应温度设定在60。C时的熔解曲线的图。
前述延伸反应温度为52°C时，前述完全匹配双链的TmPer值与延伸反应温度的关系为"Tmper值〉延伸反应温度"，无法满
足本发明中的条件。因此，如图l所示，尽管在53。C处可以充分确认错配双链的峰，但58。C处完全匹配双链的峰极小，因此难以判断。相反，前述延伸反应温度为58。C时，前述完全匹配双
链的Tmper值与延伸反应温度的关系为"Tmper值=延伸反应温
度，，，前述延伸反应温度为60。C时，前述完全匹配双链的Tm值
与延伸反应温度的关系为"Tmper值 < 延伸反应温度"，满足本发
明的条件。其结果为，如图2和图3所示，53匸处错配的峰当然可以;险测，并且58 。C处完全匹配的峰同样可以检测。产业上的可利用性
如上所述，根据本发明，即使在探针存在下进行目标序列的扩增，在前述延伸反应的反应温度下，前述探针难以与模板核酸杂交。因此，引物与模板核酸的退火和由前述引物起始的延伸反应不易受探针干扰，其结果为，可以充分进行前述目标序列的扩增。因此，才艮据本发明，例如，在Tm分析中可以以比以往更高的可靠性来判断峰的有无。因此，本发明可以说尤其在基因分析领域中是极为有用的技术。
权利要求
1.一种扩增方法，其特征在于，其为在探针存在下扩增模板核酸中的目标核酸序列的方法，其包括在能与前述目标核酸序列杂交的探针的存在下，通过由引物起始的延伸反应而扩增前述目标核酸序列的工序，作为前述探针，使用的探针为由前述探针和与前述探针互补的互补链所形成的双链核酸的熔解温度显示为前述延伸反应的反应温度以下的探针。
2. 根据权利要求l所述的扩增方法，其中，作为前述探针， 使用的探针为由前述探针和与前述探针完全互补的互补链所 形成的双链核酸的熔解温度显示为前述延伸反应的反应温度以 下的探针。
3. 根据权利要求2所述的扩增方法，其中，由前述探针和 与前述探针完全互补的互补链所形成的双链核酸的熔解温度与 前述延伸反应的反应温度之差在约0。C以上。
4. 根据权利要求2所述的扩增方法，其中，前述探针是如 下的探针由前述探针和与前述探针完全互补的互补链所形成 的双链核酸的熔解温度、以及由前述探针和与前述探针除1个碱 基外完全互补的互补链所形成的双链核酸的熔解温度，二者之差显示为约rc以上。
5. 根据权利要求l所述的扩增方法，其中，前述探针是用 标记物质标记的标记t罙针。
6. 根据权利要求4所述的扩增方法，其中，前述标记物质 是荧光物质。
7. —种扩增干扰的抑制方法，其特征在于，其为在探针存 在下扩增^t板核酸中的目标核酸序列时，抑制前述目标核酸序 列的扩增的干扰的方法，前述目标核酸序列的扩增方法是权利要求l所述的扩增方法。
8. —种目标核酸序列的分析方法，其特征在于，其为使用 能与目标核酸序列杂交的探针进行的前述目标核酸序列的分析 方法，其具有下述(A)和(B)工序(A) 通过权利要求l所述的扩增方法，在前述探针的存在 下，扩增模板核酸中的前述目标核酸序列的工序；(B) 前述(A)工序后，改变前述(A)工序的反应液的 温度，测定表示获得的扩增产物与前述探针形成的双链核酸的 熔解状态的信号值的工序。
9. 根据权利要求8所述的分析方法，其还具有下述(C)工序(C) 根据伴随温度变化的前述信号值的变动而分析前述 目标序列的工序。
10. 根据权利要求9所述的分析方法，其中，前述(C)工 序是使用表示伴随温度变化的信号值的变动的熔解曲线进行的 熔解曲线分析。
11. 才艮据斗又利要求9所述的分析方法，其中，前述目标核酸 序列是具有发生多态性的检测对象位点的序列，在前述(C)工序中，根据前述信号值的变动，分析前述 目标核酸序列的#r测对象位点的多态性。
12. 根据权利要求9所述的分析方法，其中，在前述(C) 工序中，根据前述信号值的变动，分析前述目标核酸序列有无 扩增。
13. 根据权利要求8所述的分析方法，其中，前述探针是用标记物质标记的标记揭:针。
14. 根据权利要求13所述的分析方法，其中，前述标记物 质是荧光物质，前述(B)工序中的信号值是荧光强度。
15. —种探针，其特征在于，其为在权利要求l所述的扩增方法中使用的探针，前述4笨针是如下的探针由前述探针和与前述4笨针互补的 互补链所形成的双链核酸的熔解温度显示为前述延伸反应的反 应温度以下的探针。
16. 根据权利要求15所述的探针，其中，前述探针是由 前述探针和与前述探针完全互补的互补链所形成的双链核酸的 熔解温度显示为前述延伸反应的反应温度以下的探针。
17. 根据权利要求16所述的探针，其中，前述探针和与前 述探针完全互补的互补链所形成的双链核酸的熔解温度与前述 延伸反应的反应温度之差为约0。C以上。
18. 根据权利要求16所述的探针，其是如下的探针由前 述探针和与前述:l笨针完全互补的互补链所形成的双链核酸的熔解温度、以及由前述探针和与前述探针除l个碱基外完全互补的 互补链所形成的双链核酸的熔解温度，二者之差显示为约rc以上。
19. 根据权利要求15所述的探针，其中，前述探针是用标 记物质标记的标记4笨针。
20. 根据权利要求19所述的探针，其中，前述标记物质是 荧光物质。
21. —种探针设计方法，其特征在于，其为在探针存在下 扩增模板核酸中的目标核酸序列的方法中使用的前述探针的设 计方法，将前述探针设计成由前述探针和与前述探针互补的互补 链所形成的双链核酸的熔解温度显示为前述延伸反应的反应温 度以下。
22. 根据权利要求21所述的探针设计方法，其中，将前述探针设计成由前述探针和与前述探针完全互补的互补链所形 成的双链核酸的熔解温度显示为前述延伸反应的反应温度以下。
全文摘要
提供一种在探针存在下的核酸扩增中抑制扩增反应的干扰而扩增目标序列的方法。在扩增目标序列时，作为共存的探针，使用的探针的碱基序列为在前述探针和与前述探针互补的互补链形成双链核酸时，前述双链核酸的熔解温度呈现为前述延伸反应的反应温度以下的碱基序列。如果在这种探针存在下，例如，引物的退火和延伸反应不易因探针的存在而受到干扰，能充分进行目标序列的扩增。因此，在通过Tm分析等而分析目标序列中的检测目标位点的多态性时，能实现高可靠性。
文档编号C12Q1/68GK101646786SQ200880010650
公开日2010年2月10日 申请日期2008年12月25日 优先权日2007年12月26日
发明者平井光春, 细见敏也, 间岛智史 申请人:爱科来株式会社