作为葡萄酒稳定剂的肽混合物的制作方法

专利名称：：作为葡萄酒稳定剂的肽混合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及包含基于干重而言至少2.5%的肽混合物的组合物，其特征在于，所述的肽具有^3kDa并且^10kDa的分子量，本发明还涉及生产所述组合物的方法以及其在对葡萄酒的稳定中的用途。该组合物及其溶液可有利地用于对葡萄酒的稳定，特别是防止或延迟葡萄酒中酒石酸盐的形成。
背景技术：
：葡萄酒的生产包括本领域技术人员公知的如下步骤a)从葡萄提取葡萄汁(winemust);b)在酵母作用下使葡萄汁经历发酵，以产生葡萄酒，随后将其与固体残余物分开；c)任选地，令葡萄酒熟化，以及d)对葡萄酒装瓶或包装。将葡萄酒与发酵之后存在的残余物分开之后，通常在随后的其生产步骤中，葡萄酒中会形成其它不可溶物(例如，由于酒石酸盐的沉淀形成的固体，例如当葡萄酒经历冷却稳定的时候)。因此，葡萄酒生产(尤其是以大规模进行时)经常包含在葡萄酒装瓶或包装之前对葡萄酒过滤以除去上文提到的形成的不可溶化合物的步骤。取决于待生产的葡萄酒，葡萄酒制造可包含上文提到的步骤之外的步骤。所有这些步骤都是本领域技术人员已知的。酒石酸盐，酒石酸氢钾(KHT)或酒石酸钙(CaT)的存在是葡萄酒不稳定的重要诱因。酒石酸是葡萄浆果在其发育期间产生的主要有机酸。其在桨果加工期间可以以钾盐和钙盐的形式溶入葡萄汁。发酵期间，酒石酸盐的溶解度随着乙醇浓度的增加(由于糖的发酵)而减少。在年轻葡萄酒中，酒石酸氢钾(KHT)总以过饱和的浓度存在并自发结晶。葡萄酒装瓶后，由于不可预见的结晶性质，KHT-不稳定性可能成为商业问题。此外，消费者通常将瓶中晶体的存在当成劣质葡萄酒的象征。可在葡萄酒装瓶之前进行物理处理，以防止酒石酸盐结晶。这些处理由将葡萄酒冷却至-4°C以促进结晶或通过电渗析或使用离子交换色谱来除去钾和酒石酸离子构成。但是，这些耗时耗能的过程可能改变葡萄酒的胶体平衡。葡萄酒物理处理的替代方法是使用防止KHT晶体成核和/或生长的添加剂。在包含通过加入葡萄酒稳定剂(例如甘露糖蛋白)来稳定葡萄酒的步骤的(工业)葡萄酒制造工艺中，所述葡萄酒稳定剂可加入到葡萄汁或葡萄酒中。通常其加入到葡萄酒中，通常在熟化期间以及过滤和装瓶之前。当在熟化期间以及过滤和装瓶之前加入葡萄酒稳定剂的情况下，已经发现，作为防止酒石酸盐沉淀的葡萄酒稳定剂(例如甘露糖蛋白)的活性在红酒过滤之后降低。因此，应当加入更高剂量的葡萄酒稳定剂，以在瓶装酒中实现想要的稳定。因此，该问题的一种解决方案是在装瓶之前葡萄酒经历的最后一个步骤之后加入作为溶液的稳定剂。羧甲基纤维素和间酒石酸属于抑制KHT晶体生长的添加剂的组。但是，羧甲基纤维素在目前的规定下没有被批准用作为葡萄酒添加剂。另一方面，间酒石酸在葡萄酒的pH和葡萄酒贮藏的温度下不稳定。间酒石酸将随时间水解，其保护作用会消失。因此，其使用仅局限于用于快速消耗的低品质葡萄酒。另一缺点在于，因为添加剂优选是葡萄酒的天然组分，间酒石酸或羧甲基纤维素明显并非如此。具有防止KHT晶体的成核和生长的活性的天然添加剂相对于化学添加剂是优选的。天然添加剂的一个例子是甘露糖蛋白。甘露糖蛋白与葡聚糖一起是酵母细胞壁的主要组分(LipkeP.N."al，J.Bacteriol.(1998)180(15):3735-3740)。甘露糖蛋白主要通过两种类型的方法从酵母细胞获得物理方法和酶促方法。用于获得甘露糖蛋白的最常用的物理方法是PeatS."a/，J.Chem.Soc.London(1961)28-35中描述的，其中，通过在中性pH下对酵母细胞进行热提取来获得甘露糖蛋白。用于从酵母获得甘露糖蛋白的酶促方法被描述于WO96/13571中，其主要包含用P-葡聚糖酶制剂来处理经分离的酵母细胞壁以及通过超滤分离产物。通过加热或通过P-葡聚糖酶制剂提取的甘露糖蛋白阻止酒石酸盐沉淀的活性已被测定。己经发现，针对酒石酸盐稳定的活性级分是使用P-葡聚糖酶制剂从酵母细胞壁提取的甘露糖蛋白，其具有约30-50kDa的分子量并且高度糖基化(DubourdieuD."a/,J.Int.Sci.VigneVin.(1997)vol.31(1)pp.23-31)。甘露糖蛋白可能具有下述缺点_—一旦加入葡萄酒中，其导致不想要的浑浊增加，在一些情况下，会导致副产物沉淀。此外，甘露糖蛋白防止KHT晶体成核和/或生长的有效性并不总令人满意。EP-A-1094117描述了一种方法，用于生产甘露糖蛋白的可溶固体，其中，甘露糖蛋白制剂中存在的副产物导致的浑浊问题降低。在这种方法中，在自溶之后分离酵母细胞壁，随后在95-100。C对酵母细胞壁进行15-30小时的选择性水解，或在p-葡聚糖酶作用下进行选择性水解。在两种情况下，甘露糖蛋白和其它杂质都是溶解的。必须要进行若干步骤来纯化溶解的甘露糖蛋白。在WO2006/067145中描述了在葡萄酒中完全可溶并且防止葡萄酒中酒石酸盐的沉淀非常有活性的甘露糖蛋白。但是，人们仍需要下述葡萄酒添加剂，它们展示出对防止和/或延迟葡萄酒中酒石酸盐形成的改进作用，并且，副产物导致的浑浊和/或副产物沉淀非常有限或者没有。现已惊人发现，特定分子量的肽对于防止酒石酸盐的结晶来稳定红酒特别有效。发明详述定义"肽混合物"在本文中被定义为在肽中氨基酸的数量方面，具有不同长度的肽的混合物，以及，在氨基酸的类型方面，具有不同组成的肽的混合物。"肽"在本文中被定义为包含通过肽键相连的两个或多个氨基酸残基的化合物。"食品级组分"在本文中被定义为对于在食品中的使用来说安全的组分。"蛋白水解产物"在本文中被定义为经酸或酶促处理的蛋白底物，其含有变化比例的氨基酸和肽的混合物，这由水解程度和/或所用的酶的类型来决定。"酵母提取物"在本文中被定义为包含从酵母细胞提取的水溶性组分的组合物。通常，酵母提取物包含氨基酸、蛋白、肽、维生素、碳水化合物和盐，例如磷酸盐。酵母提取物还可包含5'-核糖核苷酸和/或寡核苷酸。"甘露糖蛋白"在本文中根据OIV(OrganisationInternationaledelaVigneetduVin)的RESOLUTIONOENO26/2004被定义为可通过物理化学方法或酶促方法从&cc/^ramj;c"ce"vz'w'ae细胞和/或酵母细胞壁提取的产物。甘露糖蛋白具有不同的结构，这取决于它们的分子量、它们的糖基化程度和类型以及它们的负载大小。"蛋白酶活性"在本文中被定义为外切蛋白酶和内切蛋白酶导致的总的蛋白水解酶活性。"不含蛋白酶活性"在本文中被定义为液体制剂中的蛋白酶活性将比用用于检测蛋白酶活性的方法可检测到的最小活性更低。取决于液体制剂中预计存在的蛋白酶的类型，可使用用于测量蛋白酶的特定方法，并可定义特定的蛋白酶单位。这些方法是本领域技术人员已知的。"存活微生物的总量"在本文中被定义为溶液中存在的需氧和厌氧的嗜冷微生物+需氧和厌氧的嗜温微生物+需氧和厌氧的嗜热微生物的总量。在第一个方面，本发明提供了适于防止酒石酸盐的结晶对葡萄酒加以稳定的组合物，其包含基于组合物干物质而言至少2.5%的肽混合物，其特征在于，所述肽具有优选^3且^10kDa的分子量。在本文中使用时，"分子量"，例如肽或生物分子的分子量由用于测定分子量的实验方法定义。一种此类方法是本领域非常公知的超滤。具有S3kDa的分子量的分子表示，此类分子是通过具有3kDa的分离点的超滤膜保留下来的。具有^10kDa的分子量的分子表示，此类分子透过了具有10kDa的分离点的超滤膜。此类膜可以是再生纤维素或聚醚砜类型的。在一种优选的实施方式中，本发明的组合物包含基于组合物干物质而言至少4%w/w的肽混合物(其中，所述的肽具有前文指出的分子量)，更优选至少6%，更优选至少8%，更优选至少10。/。w/w，更优选至少20%w/w，更优选至少25%w/w，更优选至少30%w/w，更优选至少40%w/w，更优选至少50%w/w，更优选至少60%w/w，更优选至少70%w/w，更优选至少80%w/w,更优选至少90%w/w,更优选至少95%w/w，更优选至少99%。本发明的组合物还可包含一种或多种生物分子，例如碳水化合物和/或寡核苷酸，这取决于制造肽混合物所用的来源。此类碳水化合物的一个例子是甘露聚糖。优选地，这些生物分子具有与上文针对本发明组合物中的肽所定义的相同的分子量。已惊人发现，本发明的组合物以有效量加入到葡萄酒中时，可通过防止或延迟酒石酸盐的结晶来稳定葡萄酒。本发明的组合物可以是固体形式的或者是液体或溶液形式的。固体制剂形式的本发明的组合物具有下述优点，此类制剂具有良好的贮藏稳定性，并且特别是微生物稳定的。缺点可能是，固体仅缓慢和/或不完全地溶解。当本发明的组合物加入其中的葡萄酒或葡萄汁在低贮藏温度(例如，15°C以下或甚至更低，例如，低于10°C)下保持时，可能出现这种情况。固体制剂形式的本发明的组合物的另一缺点可能是由于例如混合的问题，难于在葡萄酒或葡萄汁中获得均匀浓度的本发明组合物。因此，可优选向葡萄酒或葡萄汁中加入液体或溶液形式的本发明的组合物。这可通过直接以液体制剂(优选地，即制即用的)形式生产本发明的组合物来实现，优选通过厂商生产，或者，制造本发明的葡萄酒稳定化合物的固体制剂的溶液，优选通过葡萄酒制造者来进行。此类溶液可在水中或者优选在合适体积的葡萄酒或葡萄汁中制造。取决于防止酒石酸盐结晶对葡萄酒加以稳定所必需的本发明组合物的有效量，可通过将合适量(基于该有效量以及想要和实际的溶液剂量)的固体制剂溶解至葡萄洒或葡萄汁，来制备本发明组合物的溶液。例如，将溶液以100倍或1000倍稀释进葡萄酒或葡萄汁，可能是优选的。固体制剂的有效量和溶液的剂量可由技术人员容易地确定，而无须过多费力，并且针对每种葡萄酒可以是不同的，因为每种葡萄酒将其具有其自身的酒石酸盐结晶行为。在一种优选的实施方式中，直接以液体制剂的形式(优选地，即制即8用的液体制剂)生产的或作为前文所述的固体制剂的溶液制造的本发明组合物具有50-500g/1的干物质含量，更优选地，100-400g/l，最优选地，200-300g/l。液体制剂或溶液的干物质含量可与前文公开的肽混合物的任何含量组合。例如，如果溶液具有50-500g/1之间的干物质含量和2.5%的肽混合物(基于总干物质)，这意味着该溶液中肽混合物的浓度在1.25至12.5g/1(w/v)之间。技术人员将理解，本发明提供了本发明组合物的液体制剂或溶液，由此针对干物质含量的所有优选范围(以g/l表示)均可与针对肽混合物含量(表示为组合物总干物质的百分比)的所有优选范围组合。高度优选的本发明的即制即用(ready-to-use)液体组合物具有大约200g/l的干重含量和10%的肽混合物含量(基于干物质)，这等于大约20g/l的肽。前文所述的本发明的组合物的液体制剂或溶液可优选用于对葡萄酒或葡萄汁的稳定。就此目的而言，溶液中不存在任何有害微生物是很重要的。此外，任何存活微生物的存在都可能对溶液的贮藏稳定性以及其作为葡萄酒稳定剂的活性保持有影响。就这些原因而言，在本发明的一种实施方式中，溶液具有小于IO，优选小于5的存活微生物总量(以菌落形成单位(CFU)/ml测量的)。更优选地，"溶液"是无菌的。按照前文所述的、以菌落形成单位(CFU)/ml测量的溶液中存在的存活微生物的总量在"材料和方法"中有所定义，并且通过测定总的平板计数(TPC)(本领域技术人员公知的方法，在材料和方法中对其有简短描述)来确定。前文所述的本发明的组合物的液体制剂或溶液优选被包装于无菌容器中，其可在运输和忙藏期间密闭。前文所述的本发明的组合物的液体制剂或溶液优选是水性溶液。前文所述的本发明的组合物的液体制剂或溶液的pH优选是这样的，所述pH使得组合物的稳定性得以随时间保持，以及例如，避免溶液的浑浊。因此，溶液的pH优选在3至8之间，更优选在4至7之间，最优选在5至6之间。前文所述的本发明的组合物的液体制剂或溶液优选随时间是微生物稳定的。因此，在一种优选的实施方式中，向溶液中至少加入稳定添加剂。更优选地，稳定添加剂是二氧化硫。更优选地，二氧化硫可以以重亚硫酸盐的形式加入溶液中，更优选地，作为重亚硫酸钠或钾(K2S205)的形式加入。除了保持甘露糖蛋白微生物稳定之外，添加二氧化硫还有另一优点。甘露糖蛋白溶液具有可在淡黄至褐色之间变化的颜色。然而，为了稳定葡萄酒使用褐色溶液对葡萄酒制造者来说并非非常喜欢的。因此，将用于葡萄酒或葡萄汁中的甘露糖溶液应当优选仅有些微的颜色。己经发现，向甘露糖蛋白溶液中加入二氧化硫可将其颜色从褐色降低至浅黄。因此，加入溶液中的二氧化硫的量优选在1至20g/1的范围内(作为加入的K2S20s的量测量的)。第一个方面的组合物可包含一种或多种另外的组分，优选是食品级的。如上文所定义地，组分优选适用于葡萄酒。合适的组分的例子是蛋白底物、蛋白水解产物、酵母提取物、羧甲基纤维素、葡萄酒添加剂或者这些组分中两种或多种的混合物。葡萄酒添加剂的例子是间酒石酸、阿拉伯胶或甘露糖蛋白。一种特别优选的葡萄酒添加剂是甘露糖蛋白。另一特别优选的组分是蛋白水解产物。用于制备蛋白水解产物的典型蛋白底物是植物蛋白，例如，小麦麸质、玉米麸质、大豆蛋白、油菜籽蛋白、豌豆蛋白、紫花苜蓿蛋白、向日葵蛋白、豆类蛋白、棉花或芝麻种子蛋白、苞谷蛋白、大麦蛋白、高粱蛋白、马铃薯蛋白、水稻蛋白、咖啡蛋白。其它可能的蛋白底物是动物蛋白，例如奶蛋白(例如酪蛋白或乳清蛋白)、蛋清、鱼蛋白、肉蛋白(包括明胶)、胶原蛋白、血蛋白(例如血红蛋白)、毛发、毛皮和鱼肉。当本发明的组合物包含蛋白水解产物时，其优选选自动物、植物或微生物来源的蛋白水解产物，更优选选自酪蛋白水解产物、卵清蛋白水解产物、明胶水解产物、牛血清清蛋白水解产物、溶菌酶水解产物、小麦蛋白水解产物、大豆蛋白水解产物、豌豆蛋白水解产物或这些组分中两种或多种的混合物。优选地，前文所述的本发明的组合物的液体制剂或溶液在上文提到的浓度下是半透明的。可根据标准方法，在200g/l的总干物质浓度下，用悬液计进行测量，将透明度作为溶液浑浊度的倒数来定量。在200g/l的干物质含量下，本发明组合物的液体制剂或溶液优选具有下述浑浊度pH4时S500NTU，优选S250NTU，更优选S200NTU，更优选S150NTU，更优选^100NTU，更优选S50NTU，最优选^35NTU;禾口/或pH8.0时S250NTU，优选^200NTU，更优选S150NTU，更优选SIOONTU，更优选S50NTU，更优选S25NTU，更优选^20，最优选Sl5NTU。本发明的组合物溶解于葡萄酒或葡萄汁中时，应当提供半透明并且稳定的葡萄酒。因此，在一种优选的实施方式中，溶解于水中产生干物质含量为1g/1的溶液时本发明组合物具有S4NTU的浑浊度，优选S2NTU，更优选S1NTU，和/或，溶解于水中的12%乙醇(v/v)中产生干物质含量为1g/1的溶液时并且在pH3.5时的本发明组合物具有S20NTU的浑浊度，优选S10NTU，进一步更优选S5NTU，最优选S1NTU，和/或当溶解于白葡萄酒中产生干物质含量为0.2g/1的溶液时本发明组合物具有SIONTU的浑浊度，优选S5NTU，进一步更优选^2NTU，最优选^1NTU。根据本发明第一方面的组合物可根据若干方法来制备。例如，可使用液相或固相肽合成来生产肽混合物，或者可通过水解肽源来制备。优选地，第一方面的组合物是通过对肽源(优选地，来自天然来源的肽源，例如蛋白底物、蛋白水解产物、酵母提取物等)进行酶促水解来制备的。因此，在第二个方面，本发明提供了制备根据本发明第一方面的组合物的工艺，所述工艺包括水解肽源的步骤，所述肽源包含^2.5%的、具有前文定义的肽分子量的肽混合物。可通过选择合适的酶和pH条件、温度和时间，通过受控蛋白水解，来水解肽源，以便形成具有^3kDa且^10kDa的分子量的肽。可使用本领域技术人员已知的化学方法(例如，如"SavoryFlavours",1995,byT.W.Nagodawithana,EsteekayAssociatesInc.,Wisconsin,USA的第233-237页所述)或酶促方法来进行水解。优选地，通过酶促方法进行水解。水解肽源的酶促方法也是本领域技术人员已知的(Adler-Nissen,J(1986)Enzymichydrolysisoffoodproteins,ElsevierAppl.Sci.Publ.)。li可用作为肽源的合适蛋白底物是酪蛋白、卵清蛋白、牛血清清蛋白、溶菌酶、小麦蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、酵母或这些组分中两种或多种的混合物。优选地，蛋白底物是酵母。可用作为肽源的合适的蛋白水解产物是酪蛋白水解产物、卵清蛋白水解产物、明胶水解产物、牛血清清蛋白水解产物、溶菌酶水解产物、小麦蛋白水解产物、大豆蛋白水解产物、豌豆蛋白水解产物、酵母提取物或这些组分中两种或多种的混合物。按照前文所述对肽源水解之后，所述肽源可包含基于总干重而言少丁-2.5%的肽混合物，其特征在于，肽具有3kDa和10kDa之间的分子量。为增加所述肽混合物的浓度，所述肽混合物任选可被富集。富集可使用本领域已知的分离技术(例如HPLC、尺寸排除色谱、凝胶透过色谱、选择性沉淀)来实现。用于富集第一个方面的肽混合物的一种优选分离技术是膜过滤，优选是超滤或渗滤(diafiltration)，这在适于增加肽混合物的量以产生根据第一个方面的组合物的条件下进行。技术人员知道如何在适于产生包含基于总干重而言至少2.5%w/w的、具有3至10kDa之间的分子量的肽混合物的组合物的条件下进行膜过滤，优选是超滤或渗滤。膜过滤技术，特别是超滤和渗滤，是本领域技术人员已知的。用于第三个方面的工艺中的超滤或渗滤膜是具有合适分离点的聚醚砜(PES)膜、亲水性聚醚砜膜(PESH)、再生纤维素膜或陶瓷膜。在一种实施方式中，对肽混合物的富集是通过这样来进行的使用分离点为3kDa的膜对经水解的肽源进行超滤步骤，收集得到的驻留物，以及任选地，使用分离点为lOkDa的膜对所述驻留物进行第二个超滤步骤并收集得到的透过物。或者，使用分离点为10kDa的膜对经水解的肽源进行超滤步骤，收集得到的透过物，任选地，使用分离点为3kDa的膜对得到的透过物进行第二个超滤步骤并收集得到的驻留物。肽源的水解和/或肽混合物的富集之后，可对肽混合物进行浓縮以及任选地按照标准技术(例如冷冻干燥或喷雾干燥)进行干燥。肽混合物作为液体被收集的情况下，第二个方面的工艺可包含最后一个灭菌过滤步骤，其目的是产生可原样包装的无菌溶液。蛋白酶是可用于从天然来源(例如肽源)生产肽混合物级分或其组合物的酶，其可作为杂质存在于肽混合物级分或其组合物中。当肽混合物或其组合物作为固体被分离时，这些杂质的存在不会造成问题。但是溶液中痕量蛋白酶活性的存在可能导致肽混合物或其组合物的降解，并且导致肽混合物或其组合物在防止酒石酸盐沉淀对葡萄酒加以稳定的方面的活性减少。为产生不含蛋白酶活性的、根据第一个方面的组合物，第二个方面的工艺可包括下述步骤对根据第一个方面的组合物的溶液进行适于失活蛋白酶的处理，优选通过对根据第一个方面的组合物的溶液进行70°C或更高温度的热处理来进行，优选地，在80°C至140°C之间的温度下进行，其中，热处理优选进行2秒至60分钟之间的时间。适于失活蛋白酶活性的任何处理可都可用于该方面。更优选地，使用加热步骤来使酶活性失活。用于热处理中的温度优选是70。C或更高，优选地，温度在80。C至140。C之间。热处理的持续时间优选使得所有酶活性都被去除。热处理的持续时间将取决于所使用的温度。例如，较低的温度将需要较长的热处理持续时间，而较高的温度将仅需要较短的时间。因此，80°C处理30分钟将在要求保护的范围内，130°C处理7秒钟也在要求保护的范围内。优选通过使用通常用于食品或饮料工业的条件，使用UHT处理来进行热处理。典型地，UHT可在130-145。C的温度下进行，持续时间为2-10秒。在130°C或更高的温度下进行足够时间的热处理，例如，130。C下进行7秒的热处理，将获得不含蛋白酶活性并且通常不含任何酶活性的溶液。通过使用加热步骤，通常将使得根据第一个方面的组合物的溶液中存在的微生物中的至少部分被灭活或杀死。优选地，热处理是如上文所述的UHT处理，因为，在后一种情况下，溶液中可能存在的所有微生物或微生物芽孢将被杀死或灭活。第二个方面的工艺可包括对根据第一个方面的组合物进行灭菌，优选地，在溶液的情况下，进行灭菌过滤，以除去所有微生物。后者可使用木领域技术人员已知的特定过滤器来实现。优选地，在蛋白酶失活后进行灭菌过滤，更优选地，这作为包装之前的最后一个步骤进行。在生产工艺的最后，可按照本领域技术人员已知的方法，对根据第一个方面的组合物进行无菌包装。可使用的无菌容器可以是若干种材料生产的。合适的容器可以是纸板盒中的无菌袋。这些袋可与可通过螺纹盖穿入的密封装置一起提供。本领域技术人员应当理解，本发明的工艺还可包含下述步骤，其中，通过本领域技术人员已知的方法来干燥根据第一个方面的组合物的溶液，例如通过冻干或喷雾干燥来进行，以产生固体形式的组合物，例如，粉末或颗粒形式的。在第三个方面，本发明提供了根据第一个方面的组合物的用途。优选地，本发明提供了根据第一个方面的组合物在对葡萄酒的稳定中的用途。更优选地，本发明提供了根据第一个方面的组合物在抵挡酒石酸盐的结晶而对葡萄酒进行的稳定中的用途。根据第一个方面的组合物可以用于任何类型的葡萄酒中，例如，白葡萄酒、粉红葡萄酒、起泡葡萄酒和红葡萄酒。优选地，根据第一个方面的组合物用于白葡萄酒和粉红葡萄酒中。特别地，在第四个方面，本发明提供了通过防止和/或延迟酒石酸盐的结晶来稳定葡萄酒的工艺，其中，向葡萄酒或将要在葡萄酒生产中使用的葡萄汁中加入根据第一个方面的组合物。根据第一个方面的组合物优选在熟化期间加入，即在发酵之后但在装瓶之前。本发明极其适用于白葡萄酒和粉红葡萄酒，但也可用于红葡萄酒或起泡葡萄酒。根据第一个方面的组合物以能达成稳定效果的有效量加入。通常，第一个方面定义的肽混合物可以以每升葡萄酒或葡萄汁10-1000mg之间的浓度加入到葡萄酒或将要在用于生产葡萄酒的发酵中使用的葡萄汁中。已经通过将第一个方面中定义的肽混合物以每升葡萄酒10至400mg的最终浓度加入葡萄酒，获得了良好的结果。在一种优选的实施方式中，第一个方面定义的肽混合物以每升10-300mg的浓度加入到葡萄酒或将要在用于生产葡萄酒的发酵中使用的葡萄汁中，更优选地，每升20至250mg，进一步更优选地，每升25至200mg，最优选地，每升30至150mg。技术人员将理解，将要加入的量还将取决于葡萄酒的类型、取决于例如其它葡萄14酒稳定剂的添加或存在以及取决于加入之前葡萄酒中KHT的过饱和程度。通常，在酒石酸盐结晶方面不稳定的葡萄酒具有可在0.5至6天之间变化的Tcrys。根据本发明第五个方面的经稳定的葡萄酒可通过将根据第一个方面的组合物以适于防止和/或延迟酒石酸盐结晶的浓度加入到葡萄酒中来获得。优选地，所述葡萄酒包含相对每升葡萄酒而言10-1000mg第一个方面定义的肽混合物。更优选地，葡萄酒包含相对每升葡萄酒而言10-400mg第一个方面定义的肽混合物，更优选地，每升10-300mg，更优选地，每升20至250mg之间，进一步更优选地，每升25至200mg之间，最优选地，每升30至150mg之间。所述经稳定的葡萄酒的特征在于根据"方法1"测量时，Tcrys经稳定的葡萄酒/Tcrys不稳定的葡萄酒为至少2，优选至少5，更优选至少IO，进一步更优选在10至40之间。因此，在第六个方面，本发明提供了生产针对酒石酸盐的结晶来说稳定的葡萄酒的工艺，所述工艺包括下述步骤对葡萄酒过滤并且对经过滤的葡萄酒装瓶或包装，其中，在过滤之后向葡萄酒中加入根据第一个方面的组合物。可恰在加入到葡萄酒之前，通过将组合物混合到水或葡萄酒中，来制备过滤之后加入到葡萄酒中的溶液，或者，所述溶液可以是第一个方面的组合物的(即制即用)溶液，如上文详细所述。因此，溶液可不含蛋白酶活性和/或无菌，和/或其还可包含如上文所述的稳定剂。可通过在装瓶或包装之前将液体制剂与葡萄酒混合来进行向葡萄酒中的添加，或者可在填装葡萄酒之前将其直接加入到瓶子(或包装)中。如果合适的话，本发明的一个方面的优选特征也适用于另外的方面。现在将通过下述实施例来阐述本发明，但是实施例并不做限制之用。实施例材料和方法KHT的成核和晶体生长可通过下述方法来对葡萄酒中KHT的成核和晶体生长进行测量和定量(Moutounetetal.In:Actualit6s(Enologiques1999ViemeSymposiumInternationald，OenologiedeBordeaux(Lonvaud-Funeled.))。方法1第一种方法(指示晶体成核)测量-4。C贮藏时葡萄酒中晶体出现的时间。每天进行目视观察，检测到晶体出现所必需的时间(Tcrys)以天数表方法2第二种方法(指示晶体生长)测量葡萄酒的酒石酸不稳定性(DTI)的程度。其中，在-4。C搅拌葡萄酒，测量初始导电率。随后，加入KHT的校准晶体，然后在达到稳定值后再测量导电率。DTI被定义为初始导电率的百分比减少。方法3第三种方法测量真实的、溶解的酒石酸浓度。将准确体积的葡萄酒转入玻璃管，将其与同样准确体积的、含有精确已知浓度的马来酸的D20混合。在完全弛豫条件下进行1HNMR谱，将内标(马来酸)积分与酒石酸积分相比。以这种方式，可以以非常高的精确度和准确度测定溶解的酒石酸浓度。肽混合物中的氨基酸测定使用6NHC1，在110°C，对经精确称重的肽混合物样品水解24小时。标准工序去除HC1后，将经水解的样品溶解于稀释酸中，通过在Eppendorf离心机中离心除去沉淀物。根据Waters的氨基酸分析系统(MilfordMA,USA)的操作手册指出的PicoTag方法，在干净的上清液上进行氨基酸分析。为达到此目的，从液体获得合适的样品，加入到稀释酸中并进行均质。从后一溶液取新的样品，干燥，并使用异硫氰酸苯酯进行衍生化。使用HPLC方法对存在的多种经衍生化的氨基酸加以定量，加起来以计算经称重样品中的总氨基酸水平。碳水化合物测定根据公知的蒽酮比色方法来测定碳水化合物的量。蛋白定量使用公知的KjeldaW方法来测定蛋白。浑浊度测定用HACH2100N浑浊度计(Hach-Lange，Diisseldorf,Germany)来测定浑浊度。总平板计数在分析之前，将液体制剂的三份样品贮藏在下文提到的特定条件下，使用总平板计数(TPC)方法，针对能在需氧和厌氧气氛下生长的嗜冷、嗜温和嗜热微生物的可能存在，对样品进行分析。通过在培养皿(Petridish)上存在的1ml液体制剂上倒入15mlPCA琼脂(PlateCountAgar,Oxoid，UK)，来进行TPC测定。TPC孵育在下文提到的6种条件之一下进行。对于每种条件而言，分析都双份重复进行。总地来说，对每份液体制剂样品，制备12个培养皿，6个需氧条件下孵育，另外6个在厌氧条件下孵育。用于测定需氧和厌氧嗜冷微生物的条件样品贮藏8°C，30天分析PCA板上进行TPC孵育8°C，需氧或厌氧，7天用于测定需氧和厌氧嗜温微生物的条件贮藏样品30°C，10天分析PCA板上进行TPC孵育3CTC，需氧或厌氧，3天用于测定需氧和厌氧嗜热微生物的条件贮藏样品55°C，10天分析PCA板上进行TPC孵育55°C，需氧或厌氧，3天正确的孵育时间后，分析每个培养皿，以测定每个皿中形成的菌落的量。每个皿中的菌落量提供了针对特定类型的微生物而言相对每毫升液体制剂的菌落形成单位(CFU)。本专利申请中定义的、作为相对每毫升液体制剂的CFU测量的存活微生物的总量为CFU/ml(厌氧嗜冷微生物)+CFU/ml(需氧嗜冷微生物)+CFU/ml(厌氧嗜温生物)+CFU/ml(需氧嗜温微生物)+CFU/ml(厌氧嗜热微生物)+CFU/ml(需氧嗜热微生物)。测量蛋白酶活性蛋白酶在N,N-二甲基酪蛋白上作用之后释放的游离氨基与三硝基苯磺酸反应，产生黄色，这可在405nm通过分光光度法测量到。含有碱性蛋白酶的酶标准物被用于校正。用10-60U/ml的活性来制造5份标准溶液。(1U被定义为37°C，pH8.5(0.1MTRIS)下，每分钟从琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯丙氨酸-对硝基苯胺(2.18mg/ml)释放7.59pmol对硝基苯胺(p-nitroanilin)所需的酶的量)。将2mlN,N-二甲基酪蛋白溶液(溶解于用8.5"/。的磷酸调节至pH8.5的、含有10g/l四硼酸二钠的borax缓冲液中，1.68g/1)与200)il标准溶液或样品溶液混合，在37°C孵育15分钟。随后加入1.2ml三硝基苯磺酸溶液(4mM，在12mMHC1中)。在37°C孵育5分钟后，在405nm测量吸光度。通过使用校正曲线，可计算未知样品的活性。甘露糖蛋白基质中测试的定量限为600U/ml。18肽混合物分析可例如通过氨基酸分析或NMR，来分析组合物中的肽混合物。可通过"材料和方法"中指出的PicoTag方法来测定组合物中的肽的量。测定肽混合物的量按照下文所述来测定组合物中肽混合物的量。对组合物进行超滤。收集被分离点为3kDa的超滤膜保留下来并且透过分离点为10kDa的超滤膜的肽混合物，干燥，称重，测定其相对于经历超滤的干组合物的量的重量百分比。总干重通过冷冻干燥和随后的称重来测定总干重。实施例1将1g牛血清清蛋白(BSA)溶解于50ml自来水中。将pH调节至8。力口入Alcalase(SigmaAldrich，含有来自5a"'〃Rs/z'c/zem/orw^的蛋tl酶)后，在60°C对BSA溶液孵育4小时。再将pH重调节至8，进行三次，每次加入额外的Alcalase。4小时后没有观察到pH下降，这表示蛋白水解已终止。通过超滤(UF)对溶液进行分级分离，先在3kDaYM-3再生纤维素膜(Amicon,Millipore,USA)上于超滤杯(stirredcell)中进行。接着，驻留物在10kDaPM-10聚醚砜膜(PES)(Amicon，Millipore,USA)上进行分级分离，产生驻留物和透过物。第一次超滤的透过物和第二次超滤的驻留物和透过物被冷冻干燥，计算相对于初始BSA水解产物而言的UF级分的总干重。表1中给出了若干肽级分的干重百分比。BSA中的大部分通过Alcalas^水解成小于3kDa的片段。但是，在3kDa上留下了显著的部分，10kDa膜上也留下了非常小的部分。在KHT过饱和(酒石酸浓度比饱和高26%)的白葡萄酒中，对UF级分和BSA水解产物加以测试。制备10mg/ml的溶液，将小份试样加入到葡萄酒中，以获得50、100和200mg/l的肽或BSA水解产物。每天目视监测晶体的形成。结果显示于表2中。表1:从BSA水解产物分离的UF级分的总干重(％w/w，基于BSA水解产物的干物质)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表2:酶促水解后BSA水解产物和UF级分的活性。4°C下结晶的第一天。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表2显示，经水解的BSA作为KHT结晶的抑制剂在葡萄酒中具有活性。10kDa超滤膜上留下来的UF级分(MW〉10kDa)在葡萄酒中不能完全溶解，导致葡萄酒中的沉淀和混浊。透过3kDa再生纤维素膜的UF级分(MW<3kDa)活性较低。而在3kDa再生纤维素膜上留下来并且又透过lOkDa聚醚砜膜的UF级分GkDa<MW<10kDa)是最具活性的级分。实施例2通过超滤(UF)和随后的渗滤(4-10倍)在4kDaNadi,聚醚砜亲水性膜(Microdyn-Nadir,Germany)上从酵母提取物(Maxarome,DSMFoodSpecialties)回收甘露糖蛋白。制备两套独立的分离物(A和B)。对于每套分离物而言，将1g回收的甘露糖蛋白溶解于25ml水中。在10kDaPM-10PES膜(Amicon,Millipore，USA)上于超滤杯中对溶液进行超滤。对驻留物冷冻干燥并称重，产生了分子量〉10kDa的级分。在3kDaYM-3再生纤维素膜(Amicon，Millipore，USA)上于超滤杯中对透过物加以超滤。对驻留物冷冻干燥并称重，产生了分子量3kDa<MW<10kDa的UF级分。表3中报道了UF级分的产量。按照"材料和方法"所述，针对肽和碳水化合物含量，对UF级分加以分析，结果报道于表4中。按照上文所述，在三种不同的葡萄酒中，测试UF级分和起始甘露糖蛋白的活性，结果报道于表5中。表3:从甘露糖蛋白分离的UF级分的总干重(％w/w)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表7a和表7b中。表6a:从甘露糖蛋白分离的UF级分的总干重(％w/w)(实验A)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表7a:甘露糖蛋白UF级分的活性(实验A)。4°C下结晶的第一天。法国霞多丽中测量的活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表7b:甘露糖蛋白UF级分的活性(实验B)。4°C下结晶的第一天。德国白葡萄酒中测量的活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>从表7a和表7b可以看出，3kDa再生纤维素膜上保留下来而不被10kDaPES膜保留下来的甘露糖蛋白UF级分在肽中富集，该UF级分比其它UF级分更有活性。实施例4将1g溶菌酶(Delvozyme,DSM)溶解于50ml自来水中。将pH调节至8。加入Alcalase(SigmaAldrich)后，在60°C对溶菌酶溶液孵育5小时。每小时将pH重调节至8。5小时后没有观察到pH下降，这表示蛋白水解已终止。通过超滤(UF)对溶液进行分级分离，先在10kDaPM-10聚醚砜膜(PES)(Amicon，Millipore,USA)上于超滤杯中进行。接着，在3kDaYM-3再生纤维素膜(Amicon,Millipore,USA)上在对透过物进行分级分离，产生驻留物和透过物。第一次超滤的驻留物和第二次超滤的驻留物和透过物被冷冻干燥，计算相对于初始溶菌酶起始材料而言的3种UF级分的总干重。表8中给出了若干UF级分的重量百分比。溶菌酶中的大部分通过八^^6@水解成小于3kDa的片段。但是，在3kDa上留下了显著的部分，10kDa膜上也留下了非常小的部分。在KHT过饱和的粉红葡萄酒中，对来自溶菌酶的UF级分加以测试。制备10mg/ml的溶液，将小份试样加入到葡萄酒中，以获得50、100和200mg/1的肽。每天目视监测晶体的形成。结果显示于表9中。表8:从溶菌酶水解产物分离的UF级分的总干重(％w/w，基于溶菌酶水解产物的干物质)UF>10kDa3kDa<UF<10kDaUF〈3kDa产量11782表9:酶促水解后源于溶菌酶的UF级分的活性。4°C下结晶的第一天。1234加入到葡萄酒中酶促水解前UF级分UF级分UF级分的浓度(mg/1)的溶菌酶(MW>1(3kDa<MW(MW<3kOkDa)<10kDa)Da)+0mg/11111+50mg/1沉淀沉淀113+100mg/1沉淀沉淀〉144+200mg/1沉淀沉淀〉146表9显示，10kDa超滤膜上留下来的UF级分(MW>10kDa)在葡萄酒中不能完全溶解，导致葡萄酒中的沉淀和混浊。透过3kDa再生纤维素膜的UF级分(MW<3kDa)活性较低。而在3kDa再生纤维素膜上留下来但又透过10kDa聚醚砜膜的UF级分(3kDa<MW<10kDa)是最具活性的级分。实施例5将1g蛋白胨(来自植物来源的水解蛋白，Sigma)溶解于25ml自来水中。蛋白胨不经八^^6@处理原样使用。通过超滤(UF)对溶液进行分级分离，先在10kDaPM-10聚醚砜膜(PES)(Amicon,Millipore,USA)上于超滤杯中进行。接着，在3kDaYM-3再生纤维素膜(Amicon,Millipore,USA)上在对透过物进行分级分离，产生驻留物和透过物。第一次超滤的驻留物和第二次超滤的驻留物和透过物被冷冻干燥，计算相对于初始蛋白胨起始材料而言的3种UF级分的总干重。表10中给出了若干肽级分的重量百分比。表10:从植物蛋白胨分离的UF级分的总干重(％w/w，基于起始材料的干物质)MW〉10kDa3kDa〈MW〈10kDaMW〈3kDa产量5689在KHT过饱和的白葡萄酒中，对来自蛋白胨的UF级分加以测试。制备10mg/ml的溶液，将小份试样加入到葡萄酒中，以获得50、100和200mg/l的肽。每天目视监测晶体的形成。结果显示于表ll中。表ll:来自蛋白胨的UF级分(UF)的活性。4。C下结晶的第一天。1234加入到葡萄酒中分级分离前UF级分UF级分UF级分的浓度(mg/1)的蛋白胨(MW〉1(3kDa〈MW(MW<3k0kDa)<10kDa)Da)+0mg/11111+50mg/11沉淀11+100mg/11沉淀31+200mg/11沉淀61实施例6将1g明胶(来自猪皮，Sigma)溶解于50ml自来水中。将pH调节至8。加入Alcalase(SigmaAldrich)后，在60°C孵育4小时。每小时将pH重调节至8。4小时后没有观察到pH下降，这表示蛋白水解已终26通过超滤(UF)对溶液进行分级分离，先在10kDaPM-10聚醚砜膜(PES)(Amicon,Millipore,USA)上于超滤杯中进行。接着，在3kDaYM-3再生纤维素膜(Amicon,Millipore,USA)上在对透过物进行分级分离，产生驻留物和透过物。第一次超滤的驻留物和第二次超滤的驻留物和透过物被冷冻干燥，计算相对于初始明胶起始材料而言的UF级分的总干重。表12中给出了若干UF级分的重量百分比。明胶中的大部分通过Alcalase⑧水解成小于3kDa的片段。但是，在3kDa上留下了显著的部分，10kDa膜上也留下了非常小的部分。结果显示于表13中。表12:用蛋白酶处理后从明胶分离的UF级分的总干重(％w/w，基于起始材料的干物质)MW〉10kDa3kDa<MW<10kDaMW〈3kDa产量11980表13:来自经水解的明胶的UF级分的活性。4。C下结晶的第一天。1234加入到葡萄酒中蛋白酶前的UF级分UF级分UF级分的浓度(mg/1)明胶(MW>1(3kDa〈MW(MW<3kOkDa)<10kDa)Da)+0mg/11111+50mg/1沉淀忽略*<3<3+100mg/1沉淀忽略*6<3+200mg/1沉淀忽略*8<3*由于产量太低而不可获得实施例7将lg酪蛋白(Sigma)溶解于50ml自来水中。将pH调节至8。加入Alcalase(SigmaAldrich)后，在60。C孵育4小时。每小时将pH重调节27至8。4小时后没有观察到pH下降，这表示蛋白水解已终止。通过超滤(UF)对溶液进行分级分离，先在10kDaPM-10聚醚砜膜(PES)(Amicon,Millipore,USA)上于超滤杯中进行。接着，在3kDaYM-3再生纤维素膜(Amicon,Millipore，USA)上在对透过物进行分级分离，产生驻留物和透过物。第一次超滤的驻留物和第二次超滤的驻留物和透过物被冷冻干燥，计算相对于初始酪蛋白起始材料而言的UF级分的总干重。表14中给出了若干UF级分的重量百分比。酪蛋白中的大部分通过Alcalas^水解成小于3kDa的片段。但是，在3kDa上留下了显著的部分，10kDa膜上也留下了非常小的部分。结果显示于表15中。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>*由于产量太低而不可获得实施例8中。将pH调节至8。加入Alcalase(SigmaAldrich)后，在60°C孵育4小时。每小时将pH重调节至8。4小时后没有观察到pH下降，这表示蛋白水解已终止。通过超滤(UF)对溶液进行分级分离，先在10kDaPM-10聚醚砜膜(PES)(Amicon，Millipore,USA)上于超滤杯中进行。接着，在3kDaYM-3再生纤维素膜(Amicon,Millipore，USA)上在对透过物进行分级分离，产生驻留物和透过物。第一次超滤的驻留物和第二次超滤的驻留物和透过物被冷冻干燥，计算相对于初始卵清蛋白的起始材料而言的UF级分的总干重。表16中给出了若干UF级分的重量百分比。卵清蛋白中的大部分通过Alcalas浐水解成小于3kDa的片段。但是，在3kDa上留下了显著的部分，10kDa膜上也留下了非常小的部分。结果显示于表17中。表16:用蛋白酶处理后从卵清蛋白分离的UF级分的总干重(％w/w，基于起始材料的干物质)MW〉10kDa3kDa〈MW〈10kDaMW〈3kDa产量292743表17:来自经水解的卵清蛋白的UF级分的活性。4°C下结晶的第天。1234加入到葡萄酒中蛋白酶前的UF级分UF级分UF级分的浓度(mg/1)卵清蛋白CMW〉1(3kDa〈MW(MW<3kOkDa)<10kDa)Da)+0mg/11111+50mg/1沉淀沉淀<3+100mg/1沉淀沉淀6<3+200mg/1沉淀沉淀12<权利要求1.对葡萄酒加以稳定防止酒石酸盐结晶的组合物，其特征在于，其包含基于干重而言至少2.5％的肽混合物，并且，所述的肽具有≥3kDa且≤10kDa的分子量。2.权利要求1的组合物，还包含一种或多种生物分子，所述生物分子优选选自碳水化合物和/或寡核苷酸。3.权利要求1-2的组合物，其中，所述组合物是固体形式或者液体或溶液形式的。4.权利要求3的组合物，其中，所述组合物是液体或溶液，并具有50-500g/l之间的干物质含量。5.前述权利要求中任意一项所述的组合物，其还包含一种或多种组分，所述组分优选选自蛋白底物、蛋白水解产物、酵母提取物、羧甲基纤维素和葡萄酒添加剂构成的组。6.权利要求5的组合物，其中所述葡萄酒添加剂是甘露糖蛋白。7.权利要求5的组合物，其中所述蛋白水解产物是动物、植物或微生物来源的。8.前述权利要求中任意一项所述的组合物，其特征在于，所述液体或溶液在pH=4时具有S500NTU的浑浊度和/或在pH=8时具有^250NTU的浑浊度，其中，所述浑浊度是通过悬液计在200g/1的组合物干物质含量9.前述权利要求中任意一项所述的组合物，其特征在于，当所述组合物溶解于水中产生干物质含量为1g/1的溶液时，在3.5的pH下测量时，具有S4NTU的浑浊度，和/或，溶解于水中的12%乙醇(v/v).中产生干物质含量为1g/l的溶液时，并且在pH3.5下测量时，具有S20NTU的浑浊度，和/或当溶解于白葡萄酒中产生干物质含量为0.2g/l的溶液时，具有S10NTU的浑浊度。10.制备前述权利要求中任意一项所定义的组合物的工艺，所述工艺包括下述步骤水解肽源，所述肽源包含^2.5%的权利要求1定义的肽混合物。11.制备前述权利要求中任意一项所定义的组合物的工艺，所述工艺包括下述步骤富集肽源，所述肽源包含^2.5%的权利要求1定义的肽混合物。12.权利要求11的工艺，其中所述肽源是蛋白。13.权利要求11的工艺，其中对所述组合物进行下述步骤a.使用分离点为lkDa的膜进行超滤，并收集得到的驻留物；或b.使用分离点为30kDa的膜进行超滤，并收集得到的透过物；或c.步骤a)后进行步骤b);或d.步骤b)后进行步骤a)。14.权利要求9-11的工艺，其还包括对所述组合物进行适于使酶失活的处理，优选地，通过对所述溶液进行70°C或更高温度的热处理来进行，优选地，在80。C至140°C之间的温度下进行，其中，热处理优选进行2秒至60分钟之间的时间。15.权利要求9-11的工艺，其还包括对所述组合物进行灭菌，优选地，灭菌过滤。16.权利要求1-9中任一项的组合物用于对葡萄酒进行稳定的用途。17.权利要求16的用途，其中，对所述葡萄酒加以稳定防止酒石酸盐的结晶。18.权利要求16或17的用途，其中所述葡萄酒是白葡萄酒或粉红葡萄酒。19.对葡萄酒加以稳定防止酒石酸盐的结晶的工艺，所述工艺通过向将要用于生产葡萄酒的1升葡萄汁中加入10-1000mg权利要求1所定义的肽混合物来进行。20.权利要求19的工艺，其中，在过滤后和葡萄酒装瓶之前向葡萄酒中加入权利要求1-9中任意一项的组合物。21.经过稳定而防止酒石酸盐结晶的葡萄酒，其特征在于，所述葡萄酒包含每升10-1000mg的权利要求1所定义的肽混合物。22.权利要求21的葡萄酒，其特征还在于，Tcrys经稳定的葡萄酒/Tcrys不稳定的葡萄酒为至少2。全文摘要本发明描述了适用于葡萄酒的组合物，其包含基于干重而言2.5％的肽混合物，其特征在于，所述的肽具有3kDa至10kDa之间的分子量。该组合物或其溶液可有利地用于对葡萄酒加以稳定，特别是防止或延迟葡萄酒中酒石酸盐的形成。文档编号C12H1/00GK101663387SQ200880012781公开日2010年3月3日申请日期2008年4月17日优先权日2007年4月20日发明者亨德里克·路易斯·比杰尔,彼得·菲利普·兰克豪斯特申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司