用于微粒的有选择性激励的装置的制作方法

专利名称：用于微粒的有选择性激励的装置的制作方法
技术领域：
本发明主要地涉及核酸定序领域并且更具体地涉及一种用于通过微粒的有选择 性的激励来进行DNA(脱氧核糖核酸)定序的方法和系统。
背景技术：
图1图示了利用微粒的常规DNA定序方法。图1的方法通过定序反应104、微粒的 无选择性的激励106和光学签名(opticalsignature)检测108的循环来从微粒阵列102中 导出DNA序列数据112。微粒阵列102中的各微粒通常包含如下DNA分子，这些分子具有待 确定的未知序列和在定序反应中使用的已知序列。数以千计到数以百万计(到可能数以十 亿计或者更多)的这些微粒分布和固定于玻璃基片的表面上，如图2中在概念上所示，该图 图示了微粒阵列102的例子。微粒阵列102包括分布和固定于基片202上的DNA定序微粒 204。微粒204可以采用许多形式，比如1微米直径的珠子，这些珠子覆盖有通过油包水乳 剂PCR(聚合酶链反应)技术放大的DNA分子或者通过桥放大技术放大的DNA分子簇或者 个别未放大的DNA分子。微粒204可以随机(例如，间隔不规律)或者以有序图案(例如， 间隔规律的图案，比如方形网格图案或者六边形网格图案)分布于基片202上。基片202 通常由玻璃制成并且位于贯流分析池(flowcell)内，这允许微粒204暴露于一系列反应物 以进行定序反应。在各定序反应循环结束时，各微粒常常由于并入四种荧光团(比如Cy3、 Cy5、德克萨斯红(Texas Red)和荧光共振能量传送(FRET)对)之一而呈现光学签名，该光 学签名揭示DNA的对应碱基，即腺嘌呤(縮写为"a")、胞嘧啶(縮写为"c")、鸟嘌呤(縮 写为"g")和胸腺嘧啶(縮写为"t")。 图3A-图3C图示了可以用于DNA定序的不同类型的个别定序微粒。图3A图示了 由覆盖有克隆DNA分子304的1微米直径的珠子302形成的个别微粒204，这些分子先前已 经通过油包水乳剂PCR技术来放大。珠子302直接附着到流体306中的基片202。图3B图 示了个别微粒204，该微粒作为附着到基片202并且放置于流体306中的克隆DNA分子304 的簇。DNA分子先前已经通过桥放大技术来放大。图3C图示了个别微粒，该微粒作为附着 到基片202并且放置于流体306中的单个DNA分子304。对单个DNA分子304无放大地进 行定序。 回到图1以及图2和图3A-图3C，利用微粒的DNA定序包括对微粒阵列102进行 定序反应104以使各微粒204呈现对DNA序列信息进行揭示的光学签名。微粒阵列102暴 露于定序反应物，这实现以大规模并行方式进行各定序反应循环。例如， 一个定序反应循环 可以包括杂化锚定引物并且绑扎有荧光标记的查询引物的池。在定序反应140的各循环结 束时，各微粒呈现对与该微粒关联的DNA序列信息进行揭示的光学签名。例如，光学签名可 以归因于并入与DNA 304的碱基"a"、"c"、"g"和"t"对应的四种荧光团之一。
下一步是光学激励106微粒204并且检测108微粒的光学签名。如将参照图4A-图 4C说明的那样，常规光学激励为无选择性的。多次重复反应104、无选择性的激励106和光 学签名检测108的这一循环以对各微粒204中的DNA 304进行定序。从这一过程输出DNA 4序列数据112。 利用微粒的常规DNA定序方法受困于低吞吐量(以每秒的碱基为单位进行测量)， 因为对微粒的光学签名进行检测的速率有限。这主要由于如在常规DNA定序方法中使用的 那样使用常规无选择性的激励图案、继而使用光学显微镜方法的光学成像。图4A-图4C图 示了用来激励微粒以便使用光学显微镜方法来后续成像的常规无选择性的激励图案。具体 而言，图4A图示了与基片202上的微粒204 —起使用的宽场激励图案402，其中照射视场 (FOV)中的所有微粒。图4B图示了线扫描激励，其中微粒204由扫描基片202的光线402 照射。图4C图示了斑扫描激励，其中微粒204由扫描基片202的光斑406照射。
可以通过各种手段来生成常规无选择性的激励图案。通常通过在Kohler外照射 结构中经过显微镜光学链聚焦电弧灯源或者通过在轴外或者全内反射(TIR)照射结构中 陡角度照耀激光源来生成宽场激励图案402。通常通过经过显微镜光学链聚焦空间相干激 光并且并入扫描元件来生成线扫描激励图案404。通常通过在共焦结构中经过显微镜光学 链聚焦空间相干激光源来生成斑扫描激励图案406。 在这样的常规DNA定序方法中，通常通过对用如图4A-图4C所示无选择性的激励 图案照射的微粒的光学显微镜成像来进行对微粒光学签名的检测。这一方式的速度由于若 干原因而根本上有限。首先，光学显微镜的视场(FOV)根本上与分辨率有联系，S卩，分辨率 越高，FOV就越小。类似地，光学显微镜的景深(DOF)根本上与分辨率有联系，S卩，分辨率越 高，DOF就越小。由于需要高分辨率光学显微镜以使用常规定序方法来分辨微粒，所以FOV 和DOF相对地小。因而，对微粒基片进行成像需要采集数以百计到数以千计的更小图像，这 些图像共同覆盖载玻片如铺片。在各图像之间，必须相对于显微镜物镜精确地平移和聚焦 基片或光学显微镜，在此期间光学显微镜不能采集序列数据。其次，微粒载玻片的高分辨率 图像非常不足以代表微粒中包含的序列信息。例如，在微粒载玻片的典型高分辨率图像中， 图像中的像素数目极大地超过图像中的微粒数目。然而，假设各微粒可以呈现仅四个光学 签名之一，则各微粒载有仅2比特序列信息。因而，根据常规定序方法，采集了比生成序列 信息所必需的数据多数以千倍计的数据。 因此，需要一种更高效、更快和更便利的核酸定序方法。

发明内容
本发明的实施例包括一种通过有选择地激励核酸微粒并且使用图像处理算法以 提取微粒的光学签名来对核酸如DNA或者RNA(核糖核酸)进行快速定序的方法。术语"核 酸"在这里包括DNA和RNA两者。这一方式的一个优点在于它允许相对低分辨率的光学显 微镜对有选择地激励的微粒进行成像，这能够实现用极大视场(FOV)和景深(DOF)进行对 微粒光学签名的检测。这一方式的另一优点在于利用有选择性的激励的微粒的相对低分辨 率图像是序列信息的比利用无选择性的激励的微粒的高分辨率图像更高效的数据表示，这 能够极大地减少定序所需的采集数据的量。 在一个实施例中，一种用于对核酸微粒进行定序的方法包括使用一个或者多个 定序反应物对核酸微粒进行定序反应；在激励图案中有选择地激励核酸微粒；以不足以分 辨个别微粒的分辨率对激励的核酸微粒进行光学成像；以及使用与激励图案有关的信息来 处理激励的核酸微粒的光学图像以确定至少光学签名的存在或者不存在。光学签名的存在
5或者不存在表明核酸的序列信息。虽然以不足以分辨个别微粒的分辨率获得激励的核酸微 粒的图像，但是以足以分辨个别微粒的分辨率进行对核酸微粒的有选择性的激励。可以使 用相同或者不同反应物来重复定序反应、有选择性的激励和图像处理步骤以完成定序。
在一个实施例中，一种用于核酸微粒的光学激励的装置包括用于生成激光束的激 光器、耦合成接收第一激光束的光纤、耦合到第一光纤并且用于接收经由光纤递送的第一 激光束的干涉图案生成模块，其中干涉图案生成模块将第一激光束分成第二激光束和第三 激光束并且通过第二激光束与第三激光束之间的干涉来生成用于有选择地激励目标的激 励图案。 干涉图案生成模块可以包括用于将第一激光束分成第二激光束和第三激光束的 分光器以及反射第三激光束的镜，其中该镜在一定范围内可移动以变化第三激光束的光路 长度。取而代之，干涉图案生成模块可以包括用于将第一激光束分成第二激光束和第三激 光束的分光器以及耦合到第三激光束并且旋转以调制第三激光束的光学相位的窗口。
本发明的核酸定序方法由于至少两个原因而快速和高效。首先，由于增加了用于 检测微粒光学签名的F0V和DOF，所以极大地减少了扫描和聚焦所需的机械运动。其次，由 于减少了定序所需的采集数据的量(通过使用不足以分辨个别微粒的低分辨率图像，这是 在处理光学图像时通过使用与激励图案有关的信息来实现的)，所以极大地减少了定序所 需时间。 在说明书中描述的特征和优点并非包罗所有，并且特别地，本领域普通技术人员 根据附图、说明书和权利要求将清楚许多附加特征和优点。另外，应当清楚，在说明书中使 用的语言主要地已经出于可读性和指导目的而加以选择并且可能未被选择用来界定或者 限制本发明的主题。


通过结合附图考虑下文具体描述可以容易地理解本发明实施例的教导。
图1图示了利用微粒的常规DNA定序方法。
图2图示了微粒阵列的例子。 图3A、图3B和图3C图示了可以用于DNA定序的不同类型的个别定序微粒。
图4A、图4B和图4C图示了用来激励微粒的常规无选择性的激励图案。
图5图示了根据本发明一个实施例的通过使用结构化照射来有选择性的激励微 粒的核酸(例如，DNA或者RNA)定序方法。 图6A、图6B和图6C图示了根据本发明一个实施例的如何通过激励图案序列来有 选择地激励微粒。 图7A图示了根据本发明一个实施例的用于有选择地激励微粒的结构化照射装置。 图7B图示了根据本发明另一实施例的可以与图7A的结构化照射装置一起使用的 不同类型的干涉图案生成模块。 图7C、图7D和图7E图示了根据本发明实施例的来自图7A或者图7B的结构化照 射装置的光束可以如何耦合到流体中以照射微粒。 图8具体地图示了根据本发明一个实施例的用于DNA定序的图5的图像处理步
图9图示了根据本发明一个实施例的可以如何将检测的光学图案建模为微粒荧 光团分布函数与激励图案的乘积。 图10图示了根据本发明一个实施例的在频域中的采样图案与用来生成激励图案 的激光束几何形状之间的关系。 图11在概念上图示了根据本发明一个实施例的标识用于各微粒的DNA碱基对的 过程。 图12图示了根据本发明一个实施例的用于校准图5中所示结构化照射装置的过 程。 图13在概念上图示了根据本发明一个实施例的用于通过微粒的有选择性的激励 来进行DNA定序的硬件系统。 图14图示了根据本发明一个实施例的用于图13的定序硬件的控制系统架构。
具体实施例方式
附图和下文描述仅通过示例涉及本发明的优选实施例。应当注意根据下文讨论， 将容易理解这里公开的结构和方法的替代实施例作为在不脱离要求保护的本发明的原理 情况下可以运用的可行替代实施例。 现在将具体参照在附图中图示其例子的本发明的若干实施例。注意只要实际上可 行就可以在图中使用相似或者同样的参考标号并且这些参考标号可以表示相似或者同样 的功能。附图仅出于示例的目的而描绘本发明的实施例。本领域技术人员根据下文描述将 容易认识到可以运用这里示例的结构和方法的替代实施例而不脱离这里描述的本发明原理。 图5图示了通过使用结构化照射来有选择性的激励微粒的核酸(例如，DNA或者 RNA)定序方法。虽然这里的公开内容在DNA定序的上下文中描述核酸定序方法，但是对术 语"定序"的使用并不使本发明的范围限于DNA定序，并且这里的"定序"还包括RNA定序或 者其它类型的核酸定序。"定序"或者"序列"这里也旨在于覆盖所有序列变化，比如单核苷 多态(SNP)、基因拷贝数变化、单碱基复制、倒位、插入和删除以及这样的定序的所有应用， 比如基因定型、基因表达分析和医学应用。 具有DNA的微粒阵列502先经历定序反应504的循环。定序反应504包括将微粒 暴露于一系列反应物并且在一系列温度孵化微粒。作为定序反应循环的终产物，各微粒呈 现对与该微粒关联的序列信息进行揭示的光学签名。光学签名可以归因于并入一个或者多 个光学可检测的标记，比如荧光染料、胶态金和量子点。例如，可以设计各定序反应504使 得光学签名归因于并入与DNA 304的碱基"a"、"c"、"g"和"t"对应的四种荧光团之一。注 意微粒可以是图3A-图3C中所示类型之一或者适于DNA定序的某一其它类型。也注意可 能需要进行多个附加常规步骤以预备具有来自DNA样本的DNA的微粒阵列，这些不是本发 明的主题并且在这里不加以描述。 与常规DNA定序方法对照，如参照图6A-图6C更具体说明的那样，然后用有选择 性的激励图案有选择地激励506微粒204。然后使用光学显微镜对有选择地激励的微粒阵 列进行成像508。然后，确定510当前有选择性的激励图案是否是将要应用的最后图案。如果它不是最后图案，则然后改变512激励图案，并且重复步骤506、508、510中的激励和成像 循环。 图6A-图6C图示了微粒如何如在步骤506、508、510中的激励和成像循环中所示 由激励图案序列有选择地激励。参照图6A，在时刻N在微粒204上生成有选择性的激励图 案602。参照图6B，在时刻N+l在微粒204上生成另一有选择性的激励图案604。参照图 6C，在时刻N+2在微粒204上生成又一有选择性的激励图案606。 注意这些有选择性的激励图案602、604、606是"有选择性的"，因为它们以非平凡 图案序列激励微粒204。对照而言，图4A-图4C中所示常规激励图案以平凡图案无区别地 激励空间区域从而随着空间和/或时间产生该区域的图像(即，摄影副本)。例如，图4A的 宽场扫描激励在两个维度中随着空间产生该区域的图像。图4B的线扫描激励在一个维度 上随着空间而在一个维度上随着时间产生该区域的图像。图4C的斑扫描激励在两个维度 上随着时间产生该区域的图像。换而言之，常规激励用来生成单个高分辨率图像，该图像是 微粒阵列502的摄影副本。对照而言，根据本发明的有选择性的激励用来生成微粒阵列502 的低分辨率图像序列，其中低分辨率图像不是微粒阵列502的摄影副本；取而代之，有选择 性的激励对低分辨率图像集合(分辨率未高到足以分辨个别微粒204)中的序列信息进行 编码，并且使用对有选择性的激励图案的了解来处理图像以对序列信息进行解码。使用常 规激励也几乎仅需简易地平移平凡激励图案，比如矩形402、线404或者圆406。对照而言， 根据本发明的有选择性的激励的使用需要更复杂的图案改变，比如特征尺寸和/或定向的 改变以及更复杂图案的使用。 如将参照图7A-图7B说明的那样，在一个实施例中，有选择性的激励图案602、 604、606由用于结构化照射(也称为图案化激励或者驻波激励)的合成孔径光学装置生成。 生成有选择性的激励图案602、604、606并且优化成微粒阵列502。例如，如将参照图10说 明的那样，有选择性的激励图案602、604、606确定频域中的样本分布。频域中的样本分布 程度与微粒阵列的特征尺寸608匹配。以足以分辨个别微粒的分辨率进行对核酸微粒204 的有选择性的激励。例如，周期为微粒中心204之间间距的两倍的正弦波照射可以用来生 成有选择性的激励图案602、604、606，尽管可以在其它例子中使用各种其它照射周期。
激励图案的序列和数目也被设计成保证激励的微粒阵列502的相对低的分辨率 图像仍然产生微粒204的光学签名的高效而完整和准确的表示，并且对应地产生微粒阵列 502中的序列信息。例如，如将参照图10说明的那样，有选择性的激励图案602、604、606确 定频域中的样本分布。频域中的样本数目与微粒阵列502的光学签名的特征密度匹配。
回到图5，在最后激励图案510完成最后激励和成像循环之后，确定514当前FOV 是否为用于微粒阵列502的最后FOV。如果当前FOV不是最后FOV，则微粒阵列502平移 (移动台架)516至下一 FOV，并且针对该下一 FOV重复步骤506、508、510、512中的激励和 成像循环。例如，可以移动516微粒阵列502以暴露微粒阵列502的另一 FOV。取而代之， 可以移动生成有选择性的激励图案的结构化照射装置以暴露微粒阵列502的另一FOV。
在已经对整个微粒阵列502进行成像之后(即，在步骤514中的最后FOV之后)， 确定518微粒阵列是否应当经历另一定序反应循环。如果当前反应504不是最后反应，则 用相同或者不同定序反应物进行定序反应504的新循环，然后重复步骤506至518。在最后 定序反应循环518之后，对微粒阵列502的光学签名数据进行图像处理520以提取微粒阵
8列502中的DNA分子中包含的序列数据522。 图7A图示了根据本发明一个实施例的用于有选择地激励微粒的合成孔径光学结
构化照射装置。结构化照射装置高水平地生成多个相互干涉的激光束，这些激光束的干涉 产生干涉图案。这样的干涉图案投影到微粒阵列502上并且有选择地激励微粒204。使用 多个激光束的干涉以生成干涉图案由于许多原因而有利。例如，这实现了具有极大FOV和 D0F的高分辨率激励图案。虽然这里以生成用于微粒阵列502的激励图案为例描述图7A(和 图7B)的结构化照射装置，但是应当注意图7A(和图7B)的结构化照射装置可以用于任何 其它类型的应用以生成用于任何其它类型的目标的激励图案。 参照图7A，结构化照射装置700包括激光器702、分光器704、快门705、707、光纤 耦合器708、709、成对光纤710、711和成对干涉图案生成模块712、713。激光器702的光束 703由分光器704分成两个光束740、742。成对高速快门705、707用来分别"接通"或者"关 断"各光束740、742或者分别调制各光束740、742的幅度。这样切换的激光束经由光纤耦 合器709、708耦合到成对极化维持光纤711、710中。各光纤711 、710分别连接到对应干涉 图案生成模块713、712。干涉图案生成模块713包括准直透镜714'、分光器716'和平移镜 718'，并且类似地，干涉图案生成模块712包括准直透镜714、分光器716和平移镜718。
来自光纤710的光束744由准直透镜714准直并且由分光器716分成两个光束 724、726。由致动器720来平移镜718以变化光束726的光路长度。因此，在两个激光束 724、726之间的重叠区域中在基片202上生成干涉图案722，其中通过变化光束726之一的 光程长度(即，通过使用平移镜718调制光束726的光学相位)来改变该图案。
类似地，来自光纤711的光束746由准直透镜714'准直并且由分光器716'分成 两个光束728、730。镜718'由致动器720'平移以变化光束728的光路长度。因此，在两个 激光束728、730之间的重叠区域中在基片202上生成干涉图案722，其中通过变化光束728 之一的光路长度(即，通过使用平移镜718'调制光束728的光学相位)来改变该图案。事 实上，在四个激光束726、724、728、730之间的重叠区域中在基片202上生成干涉图案722。 在一个实施例中，为了生成正弦曲线干涉图案，仅使用两个相位(0和90度)或者三个相位 (0、120和240度)并且这些相位足以用于微粒的有选择性的激励。 尽管由于图7A中所示这一实施的简易性而使用它，但是可以在本发明的范围内 使用各种其它方式。例如，还可以调制光束724、726、728、730中的一个或者多个的除了光 学幅度和相位之外或者取而代之的幅度、极化、方向和波长以改变激励图案722。也可以相 对于微粒阵列简易地平移结构化照射以改变激励图案。类似地，可以相对于结构化照射来 平移微粒阵列以改变激励图案。除了平移镜718、718'之外或者取而代之还可以使用各种 类型的光学调制器，比如声-光调制器、电-光调制器和微机电系统(MEMS)调制器。此外， 虽然这里将图7A(和图7B)的结构化照射装置描述为使用激光器702作为用于相干电磁辐 射的照射源，但是可以使用其它类型的相干电磁辐射源如SLD(超发光二极管)取代激光器 702。 另外，虽然图7A图示了使用四个光束724、726、728、730以生成干涉图案722，但 是可以通过将源激光束拆分成多于两个光束来使用更大数目的激光束。例如，64个光束可 以用来生成干涉图案722。此外，光束组合无需限于成对组合。例如，三个光束724、726、 728或者三个光束724、726、730或者三个光束724、728、730或者三个光束726、728、730或者所有四个光束724、726、728、730可以用来生成干涉图案722。通常，随需选择最小的光 束组合集合以将速度最大化。在一个实施例中，光束组合的数目与微粒阵列502中的未知 信息数量匹配。例如，一旦微粒在微粒阵列502中的位置已知，可以使用相对小数目的激 励图案来确定微粒的光学签名并且随后确定序列信息。也可以准直、汇聚或者发散光束。 虽然不同于图7A和图7B的具体实施并且对于不同应用，可以在通过引用将全部内容结合 于此的以下文献中找到与使用多个光束对来生成干涉图案有关的附加主要背景信息(i) 标题为"Multiple Beam Pair Optical Imaging"的于2000年1月28日向Mermelstein 授权的第6， 016， 196号美国专利、(ii)标题为"Optical Synthetic Aperture Array"的 于2000年10月31日向Mermelstein授权的第6， 140,660号美国专利和(iii)标题为 "OpticalSynthetic Aperture Array"的于2003年4月15日向Mermelstein授权的第 6， 548,820号美国专利。 图7B图示了根据本发明另一实施例的可以与图7A的装置一起使用的不同类型的 干涉图案生成模块。可以使用图7B的干涉图案生成模块750取代图7A的干涉图案生成模 块712或者713。虽然图7B图示了其中图7A的干涉图案生成模块712由图7B的干涉图案 生成模块750取代的情形，但是干涉图案生成模块713可以类似地由图7B的干涉图案生成 模块750取代。 参照图7B，光纤710的输出光束770由准直器754准直并且由分光器756分成两 个光束772、774。光学窗口 760插入到一个光束774的光路中并且使用检流计来旋转以调 制光束774的光路长度，由此调制对应光束774的光学相位并且生成调制光束776。让仅一 个相位调制器(旋转光学窗口 760)用于每两个光束使干涉图案生成模块750的设计紧凑 和高效。两个静止镜758、762分别反射光束772、776以生成干涉图案780而又维持近似匹 配的光路长度。 图7A和图7B的结构化照射装置与常规结构化照射装置相比具有多个技术优点。 这些优点包括 (i)使用多个激光束的干涉以生成高分辨率激励图案能够得到使用常规透镜投影 系统无法实现的极大FOV和DOF。 (ii)用来递送激光束的光纤710、711消除了来自激光器702源的振动传输，这提 供了更佳的指向稳定性和更佳的可制造性。 (iii)使用干涉图案生成模块的模块化设计提供更灵活的光束几何设计，该设计 能够通过减少制造复杂性和成本来实现使用大量光束。
(iv)基于光纤的设计能够实现一种提供更佳机械和热稳定性的紧凑和轻质装置。
紧凑组件也使自由空间光束传播最少，从而减少由大气湍流造成的扰动。
(v)图7B的干涉图案生成模块提供标定匹配的光路长度，这消除了对单个纵模激
光源的需要。 (vi)基于光纤的设计分两级进行分光(一级在分光器704而另一级在干涉图案生 成模块712、713中的分光器716、716')，从而光纤的温度变化和机械扰动并不明显影响干 涉图案。 (vii)由于仅两个相位(0和90度)或者三个相位(0、 120和240度)用于生成正 弦曲线干涉图案，所以与8个或者更多相位相比，极大地减少了数据采集所需的时间。
(viii)将快门和旋转光学窗口用于幅度和相位调制能够实现一种具有低成本、简 易控制电子器件和高光学效率的紧凑和轻质装置。例如，图7B中所示干涉图案生成模块 750的光学效率可以大于95%。 图7C、图7D和图7E图示了根据本发明实施例的来自图7A或者图7B的结构化照 射装置的光束可以如何耦合到流体中以照射微粒。具体而言，图7C图示了激光束724经过 窗口 792进入流体306以照射并且有选择地激励竖立微粒阵列502的基片202上的微粒 204。可以经过窗口 792对微粒204进行成像。图7D图示了激光束724经过基片202的背 侧(即，基片202与放置微粒204的一侧相反的一侧)进入流体306以照射倒置的微粒阵列 502。可以经过基片202对微粒204进行成像。图7E图示了激光束724经过耦合棱镜794 进入流体306以在从基片202的TIR(全内反射)照射结构中照射和有选择地激励倒置的 微粒阵列502的基片202上的微粒204。可以经过基片202对微粒204进行成像。为求简 洁，在图7C-图7E中图示了仅一个光束。 图8具体地图示了根据本发明一个实施例的用于定序的图5的图像处理520。从光 学成像508 (图5)输出的有选择性的激励的微粒的原始图像802输入到图像合成算法804 中。注意原始图像802是低分辨率图像——有选择性的激励506 (图5)和对有选择性的激 励图案的了解消除了对高分辨率图像的需要。原始图像的低分辨率不足以分辨个别微粒。 然而，图像合成算法804处理原始图像802以及与用来激励微粒的激励图案有关的信息806 和与微粒阵列502有关的信息808 (比如微粒的尺寸和位置)以生成微粒阵列502的合成 高分辨率图像810。合成图像810输入到微粒签名标识(MSI)算法812中，该算法处理合成 图像810以及与微粒阵列502有关的信息808以确定各微粒的光学签名814。微粒光学签 名数据814输入到产生DNA碱基的序列522的碱基调用(base calling)算法816中。尽 管图8的实施由于它的透明性和简易性而有利，但是各种其它方式可以用于图像处理520。
图8中的图像合成算法804利用如下性质干涉图案生成模块712、713 (图7)生 成很好地近似为正弦曲线或者正弦曲线之和的激励图案。图9图示了可以如何将检测的光 学图案建模为微粒荧光团分布函数与激励图案的乘积。如图9中一维所示，然后可以将通 过光学成像508 (图5)检测的光学图案802表达为微粒荧光团分布函数与正弦曲线函数 (或者正弦曲线函数之和)的乘积，其是傅里叶求和表示。例如，检测的光学图案902可以 是微粒荧光团分布函数(f(x))908和激励图案(gjx))910的乘积。检测的光学图案904可 以是相同微粒荧光团分布函数(f(x))908与不同激励图案(gjx))912(在这一例子中与激 励图案fe(x))910的相位相差180度)的乘积。检测的光学图案906可以是相同微粒荧 光团分布函数(f(x))908与另一不同激励图案(g3(x))914(在这一例子中与激励图案910、 912相比具有不同的周期)的乘积。 —旦将原始图像数据802表达为傅里叶求和，生成合成高分辨率图像810的问题 可能变为可以使用各种公知方法来求解的一般傅里叶求逆问题。注意图像合成算法的更一 般实施并不假设激励图案为正弦曲线或者正弦曲线之和。在这一情况下，可以将原始图像 802的数据表达为更一般的矩阵乘法。生成合成高分辨率图像810的问题然后可以变为可 以使用各种公知方法来求解的一般矩阵求逆问题。 图10图示了在频域中的采样图案与用来生成激励图案的激光束几何形状之间的 关系。如图IO中所示，这样的样本在频域中的分布取决于结构化照射装置中的激光束的几何形状。例如，如果激光束具有几何形状1002中的k矢量，则频率样本将具有直线分布 1004 (也称为2DFT分布、笛卡尔分布或者均匀分布)。对于另一例子，如果激光束具有几何 形状1006中的k矢量，则频率样本将具有非直线分布1008。 图8中的MSI算法812和碱基调用算法816取得微粒阵列的高分辨率合成图像 810作为输入并且产生用于各微粒的DNA碱基序列522。图11在概念上图示了根据本发明 一个实施例的标识用于各微粒的DNA碱基的这一过程。参照图11， 12个图像1102至1122 中的各图像示出了相同FOV，并且在这一例子中在各FOV中有两个定序微粒1172、1174。
合成图像集合1150图示了在第一定序反应循环之后的微粒1172、1174。在该第一 反应循环期间，微粒1172、 1174呈现与各微粒1172、 1174的第一未知DNA碱基对应的四个 光学签名之一。合成图像集合1150包括各自优化成检测四个光学签名之一的四个高分辨 率合成图像810。集合1150的第一图像1102被优化成检测与DNA碱基"a"对应的光学签 名。集合1150的第二图像1104被优化成检测与DNA碱基"t"对应的光学签名。集合1150 的第三图像1106被优化成检测与DNA碱基"g"对应的光学签名。集合1150的第四图像 1108被优化成检测与DNA碱基"c"对应的光学签名。 第二合成图像集合1160图示了在第二定序反应循环之后的微粒1172、1174。在 该第二反应循环期间，微粒1172、 1174呈现与各微粒1172、 1174的第二未知DNA碱基对应 的四个光学签名之一。合成图像集合1160包括各自优化成检测四个光学签名之一的四个 高分辨率合成图像810。集合1160的第一图像1110被优化成检测与DNA碱基"a"对应的 光学签名。集合1160的第二图像1112被优化成检测与DNA碱基"t"对应的光学签名。集 合1160的第三图像1113被优化成检测与DNA碱基"g"对应的光学签名。集合1160的第 四图像1114被优化成检测与DNA碱基"c"对应的光学签名。 第三合成图像集合1170图示了在第三定序反应循环之后的微粒1172、1174。在 该第三反应循环期间，微粒1172、 1174呈现与各微粒1172、 1174的第三未知DNA碱基对应 的四个光学签名之一。合成图像集合1170包括各自优化成检测四个光学签名之一的四个 高分辨率合成图像810。集合1170的第一图像1116被优化成检测与DNA碱基"a"对应的 光学签名。集合1170的第二图像1118被优化成检测与DNA碱基"t"对应的光学签名。集 合1170的第三图像1120被优化成检测与DNA碱基"g"对应的光学签名。集合1170的第 四图像1122被优化成检测与DNA碱基"c"对应的光学签名。 在与第一未知DNA碱基对应的合成图像集合1150中，第一微粒1172在与"a"对 应的图像1102中最亮，而第二微粒1174在与"g"对应的图像1106中最亮，但是在分别与 "t"和"c"对应的图像1104、 1108中无亮微粒。在与第二未知DNA碱基对应的合成图像集 合1160中，两个微粒1172、1174在与"a"对应的图像1110中最亮，但是在分别与"t"、"g" 和"c"对应的图像1112、1113、1114中无亮微粒。在与第三未知DNA碱基对应的合成图像 集合1170中，第一微粒1172在与"t"对应的图像1118中最亮，而第二微粒1174在与"c" 对应的图像1122中最亮，但是在分别与"a"和"g"对应的图像1116、1120中无亮微粒。因 此，在这一简单概念例子中，与第一微粒1172关联的DNA序列是"aat"，而与第二微粒1174 关联的DNA序列是"gac"。虽然上文将图11中的例子说明为使用成像的微粒的亮度以确定 序列信息，但是也可以通过检测成像的微粒的不同谱特性来导出序列信息。
在除了这一简单概念例子之外的实施例中，定序反应循环以更高或者更低频率出现，并且光学签名的数目多于或者少于四个。例如，在一个实施例中，定序反应可以在高分 辨率合成图像1102、 1104之间而不是在合成图像集合1150、 1160之间出现。在另一实施例 中，各微粒1172、1174呈现仅一个光学签名，并且光学签名的缺乏传达序列信息。在又一实 施例中，各微粒1172U174同时呈现多个光学签名。在又一实施例中，在光学签名与DNA碱 基之间的简单一一对应由用于利用光学签名对DNA序列信息进行编码(例如，两个碱基的 编码)的更复杂方案所取代。注意有多个其它常规定序化学反应。可以使用本发明的定序 方法，并且该方法兼容于多数定序化学反应。 回到图8， MSI算法812标识各高分辨率合成图像1102至1122中的微粒1172、 1174，并且提取各微粒的光学签名数据。在实践中，这可以通过如下方式来实现将图像阈 值化以标识各合成图像中可见的微粒，然后用二维高斯函数拟合各微粒的图像以估计位置 和亮度。 回到图8，碱基调用算法816取得微粒光学签名数据814作为输入并且生成各微粒 的DNA序列。第一步骤是通过微粒光学签名数据814的集合跟踪各微粒的位置。在实践中， 微粒阵列的位置在各成像循环中不相同。因而，微粒光学签名数据814的集合通常需要空 间配准。在一个实施例中，使用与定序微粒混合的配准微粒有助于空间配准。通常，配准微 粒是亮度数倍于定序微粒的l微米直径的珠子。配准微粒的亮度使它们易于区别于定序微 粒，并且配准微粒与定序微粒之比低(约为1至1000)，从而并未明显影响定序吞吐量。在 配准步骤之后，第二步骤是针对微粒光学签名数据814的各集合确定各微粒的光学签名。 如上文所言，各微粒可以在微粒光学签名数据814的各集合中呈现四个光学签名之一。四 个光学签名对应于四种可能碱基调用(即，"a"、"t"、"g"和"c")。通常向各碱基调用分配 质量度量。注意各种常规算法可以用来解释原始碱基调用，这些不是本发明的主题并且在 这里不加以描述。 图12图示了用于校准图5中所示结构化照射装置的过程。完成校准以便以某一 精确度了解激励图案，从而可以通过图像处理来成功地生成DNA序列数据。例如，这一激励 图案数据806(图8)是对图像合成算法804(图8)的输入。如图7A和图7B中的合成孔径 光学结构化照射装置中的典型校准参数是各光束724、726、728、730的方向、波前、形状、幅 度、极化、波长和相对光学相位。参考图12，在一个实施例中，通过放置校准目标1202取代 微粒阵列来进行校准。校准目标1202在理论上可以是具有已知特征的任何目标。例如，校 准目标1202可以是具有基本上相同亮度的荧光1微米直径珠子的随机阵列。类似于图5 中所示过程，用激励图案有选择地激励506校准目标1202。然后使用光学显微镜对有选择 地激励的校准目标微粒阵列进行成像508。然后改变512激励图案，并且重复激励和成像循 环直至到达最后图案510。在最后激励和成像循环完成510之后，然后处理520图像。基于 对校准目标1202的了解和用于结构化照射装置的旧校准参数1206，可以预测校准图像的 内容。在预测的校准图像(基于旧校准参数)与经过图像处理520的测量的校准图像之间 的差异用来生成新校准参数1204。 图13在概念上图示了根据本发明一个实施例的用于通过微粒的有选择性的激励 来定序的硬件系统。该硬件系统包括贯流分析池1302、反应物处理模块1304、温度控制模 块1306、有选择性的微粒激励模块1308、光学成像模块1310、图像处理模块1312和序列数 据存储模块1314。微粒阵列502通常位于允许微粒暴露于定序反应物的贯流分析池1302内。反应物处理模块1304施加反应物以使微粒阵列502暴露于定序反应物。温度控制模 块1306将贯流分析池1302的反应温度控制于适合于与定序反应物反应的温度。有选择性 的微粒激励模块1308如上文说明的那样有选择地激励微粒，并且光学成像模块1310获得 有选择地激励的微粒的图像。在图像处理模块1312中使用图像处理算法来分析有选择地 激励的微粒的图像以提取微粒的光学签名并且生成序列信息。序列信息存储于序列数据存 储模块1314中。 图14图示了用于图13的定序硬件的控制系统架构。该控制系统架构包括具有 用户接口 1404的数据采集计算机1402、帧抓取器1410、相机1418、具有可编程逻辑控制 器(PLC)的台架控制器1414、(扫描)台架1420、快门1422、光束调制器1424、自动采样器 1426、泵1428、温度控制器1430、聚焦控制器1432和图像处理计算机群集1406。帧抓取器 1410通过外围部件互连(PCI)接口 1412连接到数据采集计算机1402。帧抓取器1410和 相机1418在数据采集计算机1402的控制之下一起获得有选择地激励的微粒的图像。为 求高速，PLC 1414用来控制快门1422和光束调制器1424以改变激励图案、移动台架1420 并且触发相机1418以保证紧密同步。PLC 1414通过火线接口 1416连接到数据采集计算 机1402。通过更慢的接口如RS-232来控制定时关键性更低的其它硬件，比如自动采样器 1426、泵1428、温度控制器1430和聚焦控制器1432。自动采样器1426对定序反应物进行 采样。泵1428将定序反应物抽运到贯流分析池1302中以使微粒阵列502暴露于定序反应 物。温度控制器1430将贯流分析池1302的反应温度控制于适合于与定序反应物反应的温 度。聚焦控制器1432动态调节光学成像模块1310的聚焦以在台架1420移动时保持微粒 阵列502对焦。数据采集计算机1402运行用户接口 (UI) 1404、控制各种硬件并且从相机 1418接收图像数据。通过以太网接口 1408向计算机群集1406发送图像数据进行图像处 理。扫描台架1420和聚焦控制器1432能够实现对跨越多个视场的大面积微粒阵列进行成 像。 在阅读本公开内容时，本领域技术人员将认识到用于通过微粒的有选择性的激励 来进行核酸定序的方法和系统的更多附加可选结构和功能设计。例如，也可以使用空间光 调制器(比如液晶调制器或者MEMS镜阵列调制器)和投影透镜来产生激励图案。因此，尽 管已经图示和描述本发明的具体实施例和应用，但是将理解本发明不限于这里公开的精确 构造和部件，并且可以在这里公开的本发明方法和装置的布置、操作和细节上进行本领域 技术人员将清楚的各种修改、改变和变化而不脱离如所附权利要求中限定的本发明精神实 质和范围。
1权利要求
一种用于目标的光学激励的装置，所述装置包括激光器，用于生成第一激光束；第一光纤，耦合成接收所述第一激光束；第一干涉图案生成模块，耦合到所述第一光纤，用于接收经由所述第一光纤递送的所述第一激光束，所述第一干涉图案生成模块将所述第一激光束分成第二激光束和第三激光束并且配置成通过所述第二激光束与所述第三激光束之间的干涉来生成用于有选择地激励所述目标的激励图案。
2. 根据权利要求1所述的装置，其中所述第一干涉图案生成模块包括分光器，用于将所述第一激光束分成所述第二激光束和所述第三激光束；以及镜，反射所述第三激光束，所述镜在某一范围内可移动以变化所述第三激光束的光路长度。
3. 根据权利要求2所述的装置，其中所述第三激光束的相位相对于所述第二激光束的相位而言响应于所述第三激光束的光路长度在所述范围内变化而变化。
4. 根据权利要求1所述的装置，其中所述第一干涉图案生成模块包括分光器，用于将所述第一激光束分成所述第二激光束和所述第三激光束；以及窗口，耦合到所述第三激光束并且旋转以调制所述第三激光束的光学相位。
5. 根据权利要求4所述的装置，其中所述窗口使用检流计来旋转。
6. 根据权利要求1所述的装置，还包括分光器，将所述第一激光束分成所述第一激光束和第四激光束；第二光纤，耦合成接收所述第四激光束；第二干涉图案生成模块，耦合到所述第二光纤并且用于接收经由所述第二光纤递送的所述第四激光束，所述第二干涉图案生成模块将所述第四激光束分成第五激光束和第六激光束并且通过所述第二激光束、所述第三激光束、所述第五激光束与所述第六激光束之间的干涉来生成用于有选择地激励所述目标的所述激励图案。
7. 根据权利要求1所述的装置，其中所述第一激光束的幅度可变。
8. 根据权利要求1所述的装置，其中所述目标是核酸微粒阵列。
9. 根据权利要求1所述的装置，其中所述激励图案产生频域的直线采样。
10. 根据权利要求1所述的装置，其中所述激励图案产生频域的非直线采样。
11. 一种用于对核酸微粒进行定序的系统，所述系统包括序列反应模块，配置成向所述核酸微粒施加一个或者多个定序反应物；有选择性的微粒激励模块，配置成在通过在所述核酸微粒上的多个照射光束的干涉来生成的激励图案中有选择地激励所述核酸微粒；光学成像模块，配置成以不足以分辨个别微粒的分辨率生成所述核酸微粒的一个或者多个光学图像；以及图像处理模块，配置成使用与所述激励图案有关的信息来处理所述核酸微粒的所述光学图像以及确定光学签名的存在或者不存在，所述光学签名的存在或者不存在表明所述核酸的所述序列信息，其中所述有选择性的微粒激励模块包括激光器，用于生成第一激光束；第一光纤，耦合成接收所述第一激光束；以及第一干涉图案生成模块，耦合到所述第一光纤并且用于接收经由所述第一光纤递送的所述第一激光束，所述第一干涉图案生成模块将所述第一激光束分成第二激光束和第三激光束并且通过所述第二激光束与所述第三激光束之间的干涉来生成用于有选择地激励所述核酸微粒的所述激励图案。
12. 根据权利要求11所述的系统，其中所述第一干涉图案生成模块包括分光器，用于将所述第一激光束分成所述第二激光束和所述第三激光束；以及镜，反射所述第三激光束，所述镜在某一范围内可移动以变化所述第三激光束的光路长度。
13. 根据权利要求12所述的系统，其中所述第三激光束的相位相对于所述第二激光束的相位而言响应于所述第三激光束的光路长度在所述范围内变化而变化。
14. 根据权利要求11所述的系统，其中所述第一干涉图案生成模块包括分光器，用于将所述第一激光束分成所述第二激光束和所述第三激光束；以及窗口，耦合到所述第三激光束并且旋转以调制所述第三激光束的光学相位。
15. 根据权利要求14所述的系统，其中所述窗口使用检流计来旋转。
16. 根据权利要求11所述的系统，其中所述有选择性的微粒激励模块还包括分光器，将所述第一激光束分成所述第一激光束和第四激光束；第二光纤，耦合成接收所述第四激光束；以及第二干涉图案生成模块，耦合到所述第二光纤并且用于接收经由所述第二光纤递送的所述第四激光束，所述第二干涉图案生成模块将所述第四激光束分成第五激光束和第六激光束并且通过所述第二激光束、所述第三激光束、所述第五激光束与所述第六激光束之间的干涉来生成用于有选择地激励所述核酸微粒的所述激励图案。
17. 根据权利要求11所述的系统，其中所述第一激光束的幅度可变。
18. 根据权利要求11所述的系统，其中所述激励图案产生频域的直线采样。
19. 根据权利要求11所述的系统，其中所述激励图案产生频域的非直线采样。
20. —种用于目标的光学激励的装置，所述装置包括相干电磁辐射源，用于生成第一光束；光纤，耦合成接收所述第一光束；干涉图案生成模块，耦合到所述光纤，用于接收经由所述光纤递送的所述第一光束，所述干涉图案生成模块将所述第一光束分成第二光束和第三光束并且配置成通过所述第二光束与所述第三光束之间的干涉来生成用于有选择地激励所述目标的激励图案。
全文摘要
通过使用一个或者多个反应物对微粒进行定序反应、在激励图案中有选择地激励微粒、以不足以分辨个别微粒的分辨率对微粒进行光学成像以及使用与激励图案有关的信息来处理微粒的光学图像以确定光学签名的存在或者不存在(这表明核酸的序列信息)来对核酸微粒进行定序。一种用于微粒的光学激励的装置包括递送第一激光束的光纤和耦合到光纤的干涉图案生成模块。干涉图案生成模块将第一激光束拆分成第二激光束和第三激光束并且通过第二激光束与第三激光束之间的干涉来生成用于有选择地激励微粒的激励图案。
文档编号C12Q1/68GK101790585SQ200880104704
公开日2010年7月28日 申请日期2008年8月15日 优先权日2007年8月28日
发明者S·S·洪, 朴宗范, 柳济宽 申请人:光速基因组学公司