专利名称：乳糖诊断/测定试剂(盒)及乳糖浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种乳糖诊断/测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定乳糖浓度的方
法，属于医学/食品检验测定技术领域。
背景技术：
乳糖是婴幼儿主要的能量来源，进入体内后经小肠乳糖酶作用分解成葡萄糖和半 乳糖，半乳糖是婴幼儿脑发育的必需物质，与婴幼儿大脑的迅速成长有密切联系。为防止乳 清粉中掺加用其他还原糖如葡萄糖替代乳糖，乳糖的检测十分必要。 牛奶是一种营养丰富的食品，但如饮用不当，也会给健康带来不良影B向。很多人在 饮奶后出现腹部不适、腹胀、多屁、腹痛甚至腹泻等症状，这种现象在医学上称为乳糖不耐 受症，其原因是这些人小肠缺乏乳糖酶、不能消化牛奶中的乳糖，乳糖进入结肠后，经结肠 中的细菌发酵，产生大量气体、醋酸等物质所致。大量研究证实，患有乳糖不耐受的人还有 大部分没有任何症状、只有人体生化指标改变的隐性不耐受者，医学上称为乳糖吸收不良 或乳糖酶缺乏。 据统计，全世界都存在乳糖不耐受的问题，其中亚洲人发生率最高，为 95%-100%。据中国疾病控制中心调查，我国北京、上海、广州等地3_13岁儿童乳糖不耐受 症和乳糖吸收不良的发生率约为80%。乳糖不耐受除引起消化道症状外，还可造成人体营 养吸收不良。据国外研究，乳糖不耐受可减少钙的摄入、减少峰值骨量、增加骨丢失从而引 发骨质疏松症，乳糖不耐受可影响铁和锌的吸收，造成铁缺乏和锌缺乏，并可影响小儿的脑 发育，对人体健康危害很大。 在食品分析领域中，酶分析法是广为使用并倍受诸如ISO等国际标准机构推荐的 一种方法。酶析法理论发展成熟并且已为实验室普遍接受。使用高质量经纯化的酶可以实 现对复杂物质中特定成份的检测。该方法可以检测的目标代谢物有糖类、酸类及其盐类、醇 类和其他物质等。由此，各种食品样品均可被快速检测并获得良好的结果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶) 在340nm波长处吸光度的变化，得以测定乳糖浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现 该方法的乳糖诊断/测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全 自动生化分析仪上进行乳糖浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推 广应用。 本发明乳糖浓度测定方法如下
乳糖+水乳糖酶半乳糖+葡萄糖 葡萄糖+磷酸根葡萄糖-6-磷酸酶葡萄糖-6-磷酸+水 葡萄糖6-磷酸+还原型辅酶醛糖-e-磷酸还原酶山梨醇6-磷酸+辅酶
这种方法应用乳糖酶(lactase ;EC 3. 2. 1. 108)酶(偶)联葡萄 糖_6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase ;EC 3. 1. 3. 9)、醛糖_6_磷酸还原酶 (aldose-6-phosphatereductase ;EC 1. 1. 1. 200)酶促反应比色终点法。乳糖酶酶解乳糖 反应产生葡萄糖，再通过(偶)联合葡萄糖-6-磷酸酶、醛糖-6-磷酸还原酶的作用，最终 将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以 测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度，通过测量340nm处吸光度下降的程度，可以 测算乳糖的浓度大小。 实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单
剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明乳糖诊断/测定试剂(盒)较为理想 缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500mmol/L还原型辅酶 0. 25mmol/L 乳糖酶 6000U/L 葡萄糖-6-磷酸酶 8000U/L 醛糖-6-磷酸还原酶 10000U/L 磷酸根 7mmol/L 本发明的乳糖诊断/测定试剂(盒)可以是单剂，包括 缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、乳糖酶、葡萄糖-6-磷酸酶、醛糖-6-磷酸还原酶、磷 酸根。 试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，
直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂
试剂1 缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、磷酸根。
试剂2 缓冲液、稳定剂、乳糖酶、葡萄糖_6-磷酸酶、醛糖-6-磷酸还原酶。 还原型辅酶、乳糖酶、葡萄糖-6-磷酸酶、醛糖-6-磷酸还原酶、磷酸根在试剂1或
试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以
配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂
试剂1 缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、磷酸根。
试剂2 缓冲液、稳定剂、葡萄糖-6-磷酸酶、醛糖-6-磷酸还原酶。
试剂3 缓冲液、稳定剂、乳糖酶。 还原型辅酶、乳糖酶、葡萄糖-6-磷酸酶、醛糖-6-磷酸还原酶、磷酸根在试剂l、试 剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定乳糖浓度的方法，其还原型辅酶可以是 NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一 本实施例的乳糖诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
还原型辅酶 0. 25mmol/L 乳糖酶 6000U/L
葡萄糖-6-磷酸酶 8000U/L
醛糖-6-磷酸还原酶 10000U/L
磷酸根 7mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净 水，复溶后使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间IO分钟，起始吸光度I. 8±0. 7，
测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乳糖样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向
为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测
主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出乳糖的浓度大小。 实施例二 本实施例的乳糖诊断/测定试剂为双试剂，包括
试剂1三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
还原型辅酶 0. 25mmol/L 磷酸根 7mmol/L
试剂2三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500mmol/L 乳糖酶 6000U/L 葡萄糖-6-磷酸酶 8000U/L 醛糖-6-磷酸还原酶 10000U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间IO分钟，起始吸光度I. 8±0. 7，
测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乳糖样品与试剂1 、试剂2的体积比例为
2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测
5主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出乳糖的浓度大/J
实施例三
本实施例的乳糖诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂l
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 磷酸根 试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 稳定剂
葡萄糖-6-磷酸酶 醛糖_6-磷酸还原酶 试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 稳定剂 乳糖酶
100,1/ 50mmol/L 0. 25,1/L 7mmol/L
100,1/ 500,1/L 8000U/L 10000U/L
100,1/ 500,1/L 6000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定乳糖浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间IO分钟，起始 吸光度1. 8±0. 7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乳糖样品与试剂1、试剂2、试 剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右， 检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出乳糖的浓度大小。 申请人:经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明 的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。 总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所 需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0. 0007 ;吸光度时间反应曲线应呈下 降曲线直至终点；试剂可测有效(R > 0. 99)线形范围可达15mmol/L ;试剂测试的不准确 度，其相对偏差不超过±3% ;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《2% ;试剂 的灵敏度可达O. 0024±0. 0012 AA/mmol/L ;试剂在2-8"下保存，活性可以稳定一年；—— 本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。
权利要求
一种利用酶比色法及酶联法技术的乳糖浓度测定方法，其方法如下乳糖+水乳糖酶半乳糖+葡萄糖葡萄糖+磷酸根 葡萄糖-6-磷酸酶 葡萄糖-6-磷酸+水葡萄糖6-磷酸+还原型辅酶 醛糖-6-磷酸还原酶 山梨醇6-磷酸+辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，测算出乳糖的浓度大小测定结果。
2. —种乳糖诊断/测定试剂(盒)，主要成分包括缓冲液 20-500mmol/L稳定剂 1-4000mmol/L还原型辅酶 0. 1-0. 35mmol/L乳糖酶 1000——80000U/L 葡萄糖-6-磷酸酶 1000——80000U/L 醛糖_6-磷酸还原酶1000——80000U/L 磷酸根 1-50,1/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会 反应作用。其特征在于试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述乳糖诊断/测定试剂(盒)，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、乳糖酶、葡萄糖-6-磷酸酶、醛糖-6-磷酸还原酶、磷酸根组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述乳糖诊断/测定试剂(盒)，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、乳糖酶、葡萄糖_6-磷酸酶、醛糖_6-磷酸还原酶、磷酸根组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、磷酸根组成；试剂2，由缓冲液、 稳定剂、乳糖酶、葡萄糖_6-磷酸酶、醛糖_6-磷酸还原酶组成。还原型辅酶、乳糖酶、葡萄 糖_6-磷酸酶、醛糖-6-磷酸还原酶、磷酸根在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述乳糖诊断/测定试剂(盒)，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、乳糖酶、葡萄糖_6-磷酸酶、醛糖_6-磷酸还原酶、磷酸根组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、磷酸根组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、葡萄糖-6-磷酸酶、醛糖-e-磷酸还原酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、乳糖酶组成。还原型辅酶、乳糖酶、葡萄糖-6-磷酸酶、醛糖-6-磷酸还原酶、磷酸根在试剂1、试剂2 或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述乳糖诊断/测定试剂(盒)，其特征在于还包括稳定剂 l-4000mmol/L或0. 1% _100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(A,niaSulfate)、甘油 (Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一 种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的乳糖诊断/测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定乳糖浓度的方法、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂(盒)主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、磷酸根、乳糖酶、葡萄糖-6-磷酸酶、醛糖-6-磷酸还原酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度，从而测算出乳糖的浓度大小。
文档编号C12Q1/54GK101793775SQ200910028540
公开日2010年8月4日 申请日期2009年2月4日 优先权日2009年2月4日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司