专利名称：一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种肝素酶I的制备方法，尤其涉及一种由氯化钙全程保护之下的 SP-Sepharose FF层析分离制备肝素酶I的方法。
背景技术：
肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，最初是从肝素黄 杆菌中发现并分离出来的，其后，又陆续在一些微生物和动物组织中发现存在肝素酶。肝 素酶的应用十分广泛，如清除血液中残存肝素、防止凝血、生产低分子肝素、研究肝素的结 构。目前有学术论文报道的肝素酶大约有10多种，得到较为细致研究的只有来自肝素黄杆 菌的3种酶，分别是肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III。肝素酶I是一种分子量大约43kd的 单体蛋白质，其等电点为9.0，是这3种酶中裂解肝素能力最强的酶，其应用和研究也最为 广泛。肝素酶I的纯化工作有许多研究报道，但因肝素酶是一种很容易失活的酶，已报 道的纯化工艺中大都存在活性损失很大、收率低等缺点。Yang等人(J Biol Chem, 1985, 260(3) 1849-1857)用羟基磷灰石吸附/洗脱处理、QAE-葡聚糖柱层析、等电聚焦、凝胶过 滤等四步纯化，首先制得纯肝素酶I，活性收率大约Daniel等人(J Bio Chem, 1992, 267(34) =24347-24355)用羟基磷灰石吸附/洗脱处理、QAE-葡聚糖凝胶层析、羟基磷灰石 HPLC、Mono-SFPLC、GPC-HPLC等五步纯化，最终获得纯的肝素酶I，活性回收率10. 8% ；马小 来等人(食品与药品，2005，32 (5) 446-450)使用羟基磷灰石吸附/解吸、DEAE-S印harose 柱层析、CM-Cellose柱层析等三步纯化法，纯化得到肝素酶I，活性收率13. 4% ；Xiaolai Ma 等人(J Chrom B, 2006,843 (2) :209_215)通过硫酸铵沉淀、octyl-s印harose 柱层析、 CM-650柱层析、SP-650柱层析、s印hadex G-100柱层析等五步纯化法获得纯化的肝素酶I， 收率达到17. 8%，为所见的肝素酶I最高纯化收率。在前述最高纯化收率的工艺(J Chrom B, 2006,843 (2) =209-215)中，首次提 出氯化钙在酶液中的存在对肝素酶I具有保护作用，并应用于纯化步骤中。但仔细考察 该纯化工艺，其实氯化钙的保护作用并没有在所有步骤中得到体现。在硫酸铵沉淀和 octyl-sepharose柱层析两步需要使用大量硫酸铵，而钙离子与硫酸根离子结合形成沉淀 导致系统中钙离子浓度远低于设计值。这导致肝素酶I不能得到氯化钙的有效保护。从报 道的纯化表也可以看出，octyl-sepharose柱层析步骤肝素酶的收率严重低于其它步骤。为了提高肝素酶I的纯化收率及比活，本发明建立了一种全新的纯化制备工艺， 使肝素酶I在纯化过程中始终处于氯化钙的保护之下，从而获得高达30%的纯酶活性收 率，制备的肝素酶I比活高达223IU/mg，与现有最高技术相比，比活增加了两倍多，纯化收 率增加将近一倍。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种肝素酶I的制备方法，该方法能够大大提高肝素酶I的纯酶活性收率。本发明包括下述顺序的步骤(1)肝素酶的发酵制备将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中，23°C， 150rpm，培养1天。然后按5%接种量接入发酵培养基，23°C，150rpm，培养2-3天。菌液 10000rpm，4°C离心15-30分钟，收集沉淀，悬浮在100ml、50mMTris_HCl①缓冲液中，冰浴超 声1小时(150ff,5s,5s)。4°C，lOOOOrpm，离心30min,向其中滴加0. 5g/ml的鱼精蛋白8ml, 搅拌，4°C，lOOOOrpm,离心30min，上清即为粗酶液。(2)粗酶的SP柱分离将步骤⑴所得粗酶液上一根用10-50mM的Tris-HCl 平衡过的SP柱，以同样缓 冲液平衡3个柱体积，然后以缓冲液中氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集0. 25M-0. 3M氯化 钠浓度的肝素酶洗脱峰若干管。(3) SP柱精纯化将步骤⑵所得肝素酶透析后上一根用10-50mM的Tris_HCl 平衡过的SP柱，以 同样缓冲液平衡3个柱体积，然后以同样浓度的Tris-HCl 缓冲液洗脱，收集活性较高的洗 脱峰若干管。(4) SP柱终纯化将步骤(3)所得肝素酶透析后上一根用10-25mM的Tris_HCl 平衡过的SP柱，以 同样缓冲液平衡3个柱体积，然后以缓冲液中含氯化钠0-0. 5M线形梯度洗脱，收集氯化钠 浓度为0. 33-0. 44M的肝素酶活性峰的洗脱液若干管，合并、对洗脱液进行透析，以截留分 子量10kd的超滤离心管浓缩，冷冻保藏。(5)肝素酶活性测定在5ml石英比色皿中加入在30°C预热过的2. 5ml肝素浓度 为 lmg/ml 的 Tris-HCl (50mM，含 CaCl2 10mM, pH7. 0)缓冲液，移取 5-20 u 1 酶液，摇勻后 在232nm测定吸光值，读取每分钟的变化量。根据摩尔消光系数计算单位时间产生的双键 的摩尔数，并由此计算酶液的单位活性(IU/ml)。(6)蛋白质测定向5ml考马斯亮蓝溶液中加蛋白0. 1ml，摇勻，测定A595，根据标 准曲线换算蛋白浓度步骤⑴所述的种子培养基的组成为牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，酵母粉0.5%， NaCl 为 0. 5%, pH7. 0。步骤(1)所述的发酵培养基组成(g/L)为肝素8，K2HP042. 5，NaH2P042. 5，NH4C1 2. 0，MgCl2 0. 5，组氨酸 0. 5，甲硫氨酸 0. 5，微量元素(NaMo03，CuCl2，FeCl2，CoCl2，MnCl2， CaCl2，lXl(T4M)。步骤(1)、(2)、(3)、(4)所述Tris-HCl ①缓冲液含 lOmM CaCl2、pH6. 5-8. 0，优选 pH 范围为7. 0-7. 5。步骤(3)所述Tris-HCl②缓冲液含氯化钠5_75mM、含肝素0. 01-0. 5%，氯化钠含 量的优选范围为25-45mM，肝素含量的优选范围为0. 1-0. 2%，肝素的种类优选为高纯度肝
o本发明所述制备方法中，所有纯化步骤都保证了保护剂CaCl2的存在，极大地保持 了肝素酶I的稳定。本发明所制备的肝素酶I比活高达223IU/mg，每升发酵液可最终得到30IU的纯化肝素酶，纯化工艺活性收率达高到30%，与已有报道的最高值相比，比活增加 了两倍多，收率增加了将近一倍。本发明所述制备方法，还具有工艺简单、产品单次制备量 大、试剂成本低的特点，可用以工业大规模制备高纯度肝素酶I。
具体实施例方式下面结合实例对本发明所述内容作进一步阐述。实施例一肝素酶的发酵制备从肝素黄杆菌平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养 基(牛肉膏 0. 5%，蛋白胨 1%，酵母粉0. 5%，NaCl 0. 5%,pH 7.0)中，23°C，150rpm，培养 1 天。然后按接入1L发酵培养基。发酵培养基组成(g/L)肝素8，K2HP04 2. 5,NaH2P04 2.5， NH4C1 2. 0，MgCl2 0. 5，组氨酸 0. 5，甲硫氨酸 0. 5，微量元素(NaMo03，CuCl2，FeCl2，CoCl2， MnCl2, CaCl2，lXl(T4M)。23°C，150rpm，培养 2 天。菌液 lOOOOrpm，4°C 离心 20 分钟，收集 沉淀，悬浮在100ml、50mM Tris-HCl (pH7. 5，含CaCl2 10mM)缓冲液中，冰浴超声1小时 (150W, 5s，5s)。4°C，lOOOOrpm,离心 30min，向其中滴加 8ml 鱼精蛋白(0. 5g/ml)，搅拌，4°C， lOOOOrpm,离心30min，上清即为粗酶液。将肝素黄杆菌超声破碎液上一根50mM Tris-HCl (含10mM CaCl2, pH7. 5)平衡 过的SP柱(2. 5 X 30cm)，以同样缓冲液平衡200ml，然后以同样缓冲液中氯化钠线形梯度 o-o. 5M洗脱200ml，收集0. 25M-0. 3M氯化钠浓度的肝素酶洗脱峰若干管。合并透析后上一 根 50mM Tris-HCl (含 10mM CaCl2，pH7. 5)平衡过的 SP 柱(1. 5X40cm)，以同样缓冲液平 衡100ml，然后以含氯化钠45mM、含肝素0. 2%的同样浓度的Tris-HCl 缓冲液洗脱300ml， 收集活性较高的洗脱峰各管。透析后上一根25mM Tris-HCl (含10mM CaCl2, pH7. 5)平 衡过的SP柱(1. 5 X 40cm)，以同样缓冲液平衡100ml，然后以同样缓冲液中含氯化钠0-0. 5M 线形梯度洗脱100ml，收集氯化钠浓度为0. 33-0. 44M洗脱液的几管，合并，对洗脱液进行透 析，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，冷冻保藏。利用上述的肝素酶活性测定方法对所制得的肝素酶I进行测定，得到肝素酶I的 活性为220IU/mg，纯化活性收率为29. 5%。实施例二重复实施例一中肝素酶的发酵制备的步骤。将肝素黄杆菌超声破碎液上一根10mM Tris-HCl (含10mM CaCl2, pH7. 0)平衡 过的SP柱(2. 5 X 30cm)，以同样缓冲液平衡200ml，然后以同样缓冲液中氯化钠线形梯度 0-0. 5M洗脱200ml，收集0. 25M-0. 3M氯化钠浓度的肝素酶洗脱峰若干管。合并透析后上一 根 10mM Tris-HCl (含 10mM CaCl2，pH7. 0)平衡过的 SP 柱(1. 5X40cm)，以同样缓冲液平 衡100ml，然后以含氯化钠25mM、含肝素0. 1 %的同样浓度的Tris-HCl 缓冲液洗脱300ml， 收集活性较高的洗脱峰各管。透析后上一根10mM Tris-HCl (含10mM CaCl2, pH7. 0)平 衡过的SP柱(1. 5 X 40cm)，以同样缓冲液平衡100ml，然后以同样缓冲液中含氯化钠0-0. 5M 线形梯度洗脱100ml，收集氯化钠浓度为0. 33-0. 44M洗脱液的几管，合并，对洗脱液进行透 析，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，冷冻保藏。利用上述的肝素酶活性测定方法对所制得的肝素酶I进行测定，得到肝素酶I的 活性为225IU/mg，纯化活性收率为30. 1%。
实施例三重复实施例一中肝素酶的发酵制备的步骤。将肝素黄杆菌超声破碎液上一根30mM Tris-HCl@ (含IOmM CaCl2, pH6. 5)平衡 过的SP柱(2. 5 X 30cm)，以同样缓冲液平衡200ml，然后以同样缓冲液中氯化钠线形梯度 0-0. 5M洗脱200ml，收集0. 25M-0. 3M氯化钠浓度的肝素酶洗脱峰若干管。合并透析后上一 根30mM Tris-HCl@ (含IOmM CaCl2, pH6. 5)平衡过的SP柱(1. 5 X 40cm)，以同样缓冲液平衡 IOOml，然后以含氯化钠35mM、含肝素0. 15 %的同样浓度的Tris-HCl 缓冲液洗脱300ml，收 集活性较高的洗脱峰各管。透析后上一根20mM Tris-HCl@ (含IOmM CaCl2, pH6. 5)平衡 过的SP柱(1. 5 X 40cm)，以同样缓冲液平衡100ml，然后以同样缓冲液中含氯化钠0-0. 5M 线形梯度洗脱100ml，收集氯化钠浓度为0. 33-0. 44M洗脱液的几管，合并，对洗脱液进行透 析，以截留分子量IOkd的超滤离心管浓缩，冷冻保藏。利用上述的肝素酶活性测定方法对所制得的肝素酶I进行测定，得到肝素酶I的 活性为227IU/mg，纯化活性收率为30. 8%。实施例四重复实施例一中肝素酶的发酵制备的步骤。将肝素黄杆菌超声破碎液上一根20mM Tris_HCl@ (含IOmM CaCl2, pH8. 0)平衡 过的SP柱(2. 5 X 30cm)，以同样缓冲液平衡200ml，然后以同样缓冲液中氯化钠线形梯度 0-0. 5M洗脱200ml，收集0. 25M-0. 3M氯化钠浓度的肝素酶洗脱峰若干管。合并透析后上一 根20mM Tris-HCl@ (含IOmM CaCl2,8. 0)平衡过的SP柱(1. 5X40cm)，以同样缓冲液平衡 100ml，然后以含氯化钠30mM、含肝素0. 的同样浓度的Tris-HCl②缓冲液洗脱300ml，收 集活性较高的洗脱峰各管。透析后上一根15mM Tris-HCl@ (含IOmM CaCl2, pH8. 0)平衡 过的SP柱(1. 5 X 40cm)，以同样缓冲液平衡100ml，然后以同样缓冲液中含氯化钠0-0. 5M 线形梯度洗脱100ml，收集氯化钠浓度为0. 33-0. 44M洗脱液的几管，合并，对洗脱液进行透 析，以截留分子量IOkd的超滤离心管浓缩，冷冻保藏。利用上述的肝素酶活性测定方法对所制得的肝素酶I进行测定，得到肝素酶I的 活性为225IU/mg，纯化活性收率为31. 3%。实施例五重复实施例一中肝素酶的发酵制备的步骤。将肝素黄杆菌超声破碎液上一根15mM Tris_HCl@ (含IOmM CaCl2,pH7)平衡过的 SP柱(2. 5 X 30cm)，以同样缓冲液平衡200ml，然后以同样缓冲液中氯化钠线形梯度0-0. 5M 洗脱200ml，收集0. 25M-0. 3M氯化钠浓度的肝素酶洗脱峰若干管。合并透析后上一根15mM Tris-HCl@ (含 IOmM CaCl2, pH7)平衡过的 SP 柱(1. 5 X 40cm)，以同样缓冲液平衡 100ml, 然后以含氯化钠40mM、含肝素0. 的同样浓度的Tris-HCl@缓冲液洗脱300ml，收集活性 较高的洗脱峰各管。透析后上一根25mM Tris-HCl @ (含IOmM CaCl2, pH7)平衡过的SP柱 (1. 5 X 40cm)，以同样缓冲液平衡100ml，然后以同样缓冲液中含氯化钠0-0. 5M线形梯度洗 脱100ml，收集氯化钠浓度为0. 33-0. 44M洗脱液的几管，合并，对洗脱液进行透析，以截留 分子量IOkd的超滤离心管浓缩，冷冻保藏。利用上述的肝素酶活性测定方法对所制得的肝素酶I进行测定，得到肝素酶I的 活性为226IU/mg，纯化活性收率为30. 2%。
实施例六重复实施例一中肝素酶的发酵制备的步骤。将肝素黄杆菌超声破碎液上一根45mM Tris_HCl@ (含IOmM CaCl2, pH7. 8)平衡 过的SP柱(2. 5 X 30cm)，以同样缓冲液平衡200ml，然后以同样缓冲液中氯化钠线形梯度 0-0. 5M洗脱200ml，收集0. 25M-0. 3M氯化钠浓度的肝素酶洗脱峰若干管。合并透析后上一 根 45mM Tris-HCl@ (含 IOmM CaCl2,pH7. 8)平衡过的 SP 柱(1. 5X40cm)，以同样缓冲液平 衡100ml，然后以含氯化钠30mM、含肝素0. 2%的同样浓度的Tris-HCl 缓冲液洗脱300ml， 收集活性较高的洗脱峰各管。透析后上一根15mM Tris-HCl@ (含IOmM CaCl2, pH7. 8)平 衡过的SP柱(1. 5 X 40cm)，以同样缓冲液平衡100ml，然后以同样缓冲液中含氯化钠0-0. 5M 线形梯度洗脱100ml，收集氯化钠浓度为0. 33-0. 44M洗脱液的几管，合并，对洗脱液进行透 析，以截留分子量IOkd的超滤离心管浓缩，冷冻保藏。利用上述的肝素酶活性测定方法对所制得的肝素酶I进行测定，得到肝素酶I的 活性为224IU/mg，纯化活性收率为30. 5%。
权利要求
一种肝素黄杆菌肝素酶I的制备方法，其特征在于所述方法包括下述顺序步骤，a、将肝素黄杆菌接到50ml种子培养基中，23℃，150rpm，培养1天；b、按5％接种量接入发酵培养基，23℃，150rpm，培养2-3天，4℃，10000rpm，离心15-30分钟，收集沉淀；c、沉淀悬浮在100ml、50mM的含CaCl2的Tris-HCl①缓冲溶液中，冰浴超声1小时，4℃，10000rpm，离心30min，滴加0.5g/ml的鱼精蛋白8ml，搅拌，4℃，10000rpm，离心30min，取上清液；d、上一根用含CaCl2的Tris-HCl①缓冲液平衡过的SP柱，以同样的缓冲液平衡3个柱体积，以含CaCl2的Tris-HCl①缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液若干管；f、洗脱液透析后上一根用含CaCl2的Tris-HCl①缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的含氯化钠、肝素Tris-HCl②缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液若干管；g、洗脱液透析后上一根用含CaCl2的Tris-HCl①缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，含CaCl2的Tris-HCl①缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，冷冻保藏。
2.如权利要求1所述的肝素黄杆菌肝素酶I的制备方法，其特征在于步骤a中所述 种子培养基的组成为牛肉膏0. 5%、蛋白胨1%、酵母粉0. 5%,NaCl为0. 5%,pH7. 0。
3.如权利要求1所述的肝素黄杆菌肝素酶I的制备方法，其特征在于步骤b中所述 发酵培养基组成为肝素8，K2HP04 2. 5，NaH2P04 2. 5，NH4C1 2. 0，MgCl2 0. 5，组氨酸0. 5，甲硫 氨酸 0. 5，微量元素 NaMo03、CuCl2、FeCl2、CoCl2、MnCl2、CaCl2 共 1 X 1(T4M，单位为 g/L。
4.如权利要求1所述的肝素黄杆菌肝素酶I的制备方法，其特征在于所述Tris-HCl 缓冲液含 10mM CaCl2、pH6. 5-8. 0。
5.如权利要求1所述的肝素黄杆菌肝素酶I的制备方法，其特征在于所述Tris-HCl 缓冲液含氯化钠5-75mM、含肝素0. 01-0. 5%，肝素的种类为高纯度肝素。
6.如权利要求1所述的肝素黄杆菌肝素酶I的制备方法，其特征在于步骤d中所述 收集洗脱液进一步为收集0. 25M-0. 3M氯化钠浓度的肝素酶洗脱峰。
7.如权利要求1所述的肝素黄杆菌肝素酶I的制备方法，其特征在于步骤d、f中所 述 Tris-HCl ①、Tris-HCl 缓冲液浓度为 10_50mM。
8.如权利要求1所述的肝素黄杆菌肝素酶I的制备方法，其特征在于步骤中g所述 Tris-HCl ①、Tris-HCl 缓冲液浓度为 10_25mM。
9.如权利要求1所述的肝素黄杆菌肝素酶I的制备方法，其特征在于步骤f、g中所 述收集洗脱液进一步为收集0. 33M-0. 44M氯化钠浓度的肝素酶洗脱峰。
全文摘要
本发明提供了一种肝素酶I的制备方法，以肝素黄杆菌为原料，将肝素黄杆菌接到种子培养基中培养、再接到发酵培养基、离心收集沉淀、沉淀超声破碎、再离心而得到肝素黄杆菌肝素酶I的粗酶液，通过对粗酶液进行三次SP-Sepharose FF层析纯化得到高纯度的肝素黄杆菌肝素酶I。其中三次SP-Sepharose FF层析纯化都由氯化钙全程保护，大大增加了纯酶活性收率。本发明具有工艺简单、容易放大、产品单次制备量大、试剂成本低等特点，制备的肝素酶I比活高达223IU/mg，纯酶活性收率高达30％，与现有最新方法相比，比活增加了两倍多，纯化收率增加将近一倍。
文档编号C12R1/20GK101886067SQ200910039360
公开日2010年11月17日 申请日期2009年5月11日 优先权日2009年5月11日
发明者李坦, 李锂, 马小来 申请人:深圳市海普瑞药业股份有限公司