专利名称：毕赤酵母工程菌株的构建方法和右旋糖酐酶的制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域和蛋白质的分泌表达领域，特别是分泌表达右旋糖酐酶的毕赤酵母工程菌株的构建，以及右旋糖酐酶的制备工艺。
背景技术：
在制糖工业中，由于受甘蔗品种、天气、土壤以及糖厂生产环境的影响，物料中都含有不同量的葡聚糖，造成直接的糖分损失高达1.0%左右；葡聚糖的存在使制糖工艺过程困难增加，主要体现在虛假旋光度的存在、糖液粘度增加、过滤困难、结晶不正常、能耗增加、品质降低等，因此而造成的糖分损失更是直接糖分损失的3—5倍，即传统制糖过程中因葡聚糖原因造成糖分损失4%左右。因此，如何减少葡聚糖以及控制其负面影响是我国糖业界一个迫切需要解决的问题。
我国90%以上的制糖企业采用亚硫酸法制糖工艺，此工艺为了消除葡聚糖等大分子物质的影响，采用的清净工艺通常加入石灰、二氧化硫、聚丙烯酰胺(絮凝剂)、表面活性剂，杀菌剂和脱色剂等数种物质当作提纯剂除去葡聚糖、淀粉等，但其清净效率不高、造成环境污染，清净前后的纯度差、并增加了外源的非糖物质，造成产出的白糖中葡聚糖的含量较高，这也就决定了后工序不可能结晶出高品质糖；直接影响其作为食品原料的加工性状，如造成饮料浑浊、影响巧克力等糖果的成形和包装等。随着人们对食糖及添加食糖的食品质量的要求越来越高，葡聚糖的负面影响显得越来越严重。因此，改进现有清净工艺，提高清净工艺的效率、减少葡聚糖造成的损失及其负面影响是我国制糖行业升级的关键技术瓶颈之一。
右旋糖酐酶是一种具有催化葡聚糖降解的活性蛋白质，可以在较温和的条件下，除去葡聚糖，将其转化成小分子的单糖或寡糖，降低粘度、加快沉降过滤速度、减少蒸煮时间、降低蒸汽消耗、提高糖的品质等，增加蔗糖的回收率。右旋糖酐酶在制糖中的作用效果非常显著，据制糖专家James报道，在制糖过程中加入右旋糖酐酶后，糖分回收提高3—5%,糖的质量也明显提高。右旋糖酐酶的应用能够显著的提升制糖产业的品质和竟争力。酶法清净工艺对于提高效率、降低能耗和减少排污有显著效果，是典型的绿色化学处理工艺。高效右旋糖酐酶及复合酶制剂的开发成功，能够实现节能降耗、提升品质、提升竟争力， 可有效消除葡聚糖在制糖行业的负面影响，无疑对制糖行业清洁生产、技术进步及促进产 业发展具有显著的积极意义。
目前右旋糖酐酶主要是从薄青霉(Penicillium lilacinum )和细丽毛壳属(Chaetomium sp.)等菌株培养得到，亦有利用上述来源的基因进行工程菌构建的报道，但制备的右旋 糖酐酶不能很好地适应制糖过程中的温度和pH,且制备成本高，因此尚未有大量应用于 制糖工业中的右旋糖酐酶的报道。
发明内容
本发明的目的是
(1) 提出能分泌表达毕赤酵母工程菌株的构建方法；
(2) 提出利用毕赤酵母工程菌株制备右旋糖酐酶的工艺，其具有培养基碳源普通廉 价，工艺条件简单，制造成本低等优点。
本发明的技术方案如下
一种毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤 (1 ).设计寡核苷酸引物(Primerl: GCGCGAATTCATGACATTAATCT和Primer2: ATCGCGGCCGCGTTTATGGACCATTG),引物中分别引入限制性内切酶EcoRI和Notl, 以油脂酵母1390基因组DNA为模板；克隆得到右旋糖酐酶基因，并进行测序鉴定。
(2) .利用分泌表达载体pPIC9K，将EcoRI和Notl双酶切后的右旋糖酐酶基因插入 pPIC9K的多克隆位点(EcoRI和Notl)，并通过连接、转化、酶切等分子生物学技术搡作， 构建出整合分泌型表达载体(pPIC9K—139)。
(3) .用限制性内切酶BglII，对重组表达载体(pPIC9K—139)线性化，电击转化毕 赤酵母GS115,借助a—facor分泌信号肽，实现右旋糖酐酶的高效分泌表达，在含有G418 的YEPD平板上进行筛选，测定右旋糖酐酶酶活，得到重组毕赤酵母工程菌株(GS115 —139),该毕赤酵母工程菌株(GS115—139)的右旋糖酐酶可为多拷贝。
一种利用上述毕赤酵母工程菌株(GS115 — 139)制备右旋糖酐酶的工艺，其特征包 括如下工序
(1 )培养基配方基础培养基由10 x Basal salt+250 x PTMl+5。/。(w/v)葡萄糖+0.02。/。泡敌组成；
(2) 接种将毕赤酵母工程菌株(GS115—139)接种到上述培养基中培养；
(3) 诱导接种培养一定时间后，在培养基中流加甲醇诱导产右旋糖酐酶，甲醇浓 度在0~1%范围；
(4) 分离提纯右旋糖酐酶釆用离心、过滤的方法分离细胞，然后选择适当超滤膜 截流、浓缩发酵液、进行低温喷雾干燥或载体吸附，得到右旋糖酐酶。
与现有技术相比，本发明具有如下实质性特点和显著进步
(1)成功实现右旋糖酐酶基因在毕赤酵母中的有效表达，构建了能高效分泌表达右 旋糖酐酶的工程菌株，表达量比原始斯达氏油脂酵母菌株AS2.1390高6倍以上。
(2 )本发明通过BRP分泌系统和a—facor分泌信号肽实现右旋糖酐酶在工程菌中的 分泌表达；克隆宿主菌采用生长速度快、遗传背景清楚的毕赤酵母。
(3)通过对右旋糖酐酶基因的分子定向进化与改造，以及分泌表达重组载体的构建，
实现右旋糖酐酶的高效分泌表达,并以廉价碳源为原料，实现右旋糖酐酶的发酵工艺放大；
最大限度的降低成本。
具体实施例方式
下面将结合实施例对本发明作进一步详细的说明
酶活定义为1单位酶活(U)表示为lml酶在PH为5.0，温度55。C下，lmin分解 葡聚糖(dextran) T2000产生1 m mol葡萄糖。 斯达氏油脂酵母AS2.1390的培养
(1) 培养基配方基础培养基由10 x Basal salt+250 x PTMl+5。/。(w/v)葡萄糖组成；
(2) 工艺条件温度为25 35。C， PH5.0-7.0,溶氧量大于20%;
(3) 诱导条件在培养24-48小时后，添加葡聚糖作为诱导剂。 培养96小时后测定培养液中右旋糖酐酶酶活为5U。
实施例1
一种高产右旋糖酐酶的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，其包括如下步骤
(1)设计寡核酐酸引物Primerl: GCGCGAATTCATGACATTAATCT和Primer2: ATCGCGGCCGCGTTTATGGACCATTG,引物中分别引入限制性内切酶EcoRI和Notl,以油脂酵母13卯基因组DNA为模板，克隆得到右旋糖酐酶基因；
(2 )利用分泌表达载体pPIC9K,将双酶切后的右旋糖酐酶基因插入pPIC9K的多克 隆位点(EcoRI和Notl),并通过连接、转化、酶切等分子生物学技术操作，构建出整合 分泌型表达载体pPIC9K—139;
(3)用限制性内切酶BglII,对重组表达载体pPIC9K—139线性化，电击转化毕赤 酵母GSU5，采用a—factor,实现右旋糖酐酶的分泌表达，在含有G418的YEPD平板 上进行筛选，得到重组毕赤酵母工程菌株GS115—139，该毕赤酵母工程菌株GS115—139 的右旋糖酐酶基因为多拷贝。 实施例2
一种制备右旋糖酐酶的工艺(摇瓶发酵培养)，其步骤如下
(1) 培养基配方基础培养基由10 x Basal salt+250 x PTMl+5。/。(w/v)葡萄糖+0.02。/0
甘油组成；
(2) 接种将实施例1的毕赤酵母工程菌株GS115—139按种到上述培养基培养， 培养条件为温度为28 30'C， PH5.0-5.6,转速250r/min;
(3) 诱导产右旋糖酐酶在接种培养24小时后，添加甲醇作为诱导剂，甲醇浓度在 0~ 1%范围。培养96小时后测定培养液中右旋糖酐酶酶活为26U。
(4) 分离提纯右旋糖酐酶釆用离心、过滤的方法分离细胞，然后选择适当超滤膜 截流、浓缩发酵液、进行低温喷雾干燥或载体吸附，得到右旋糖酐酶(测定其酶活为200U)。
实施例3
一种制备右旋糖酐酶的工艺(摇瓶发酵培养)，其步骤如下
(1 )培养基配方基础培养基由10 x Basal salt+250 x PTMl+5o/o(w/v)葡萄糖十0.020/0 泡敌组成；
(2) 接种将实施例1的毕赤酵母工程菌株GS115—139按种到上述培养基培养， 培养条件为温度为30 33。C, PH5.0-5.5,转速200r/min;
(3) 诱导产右旋糖酐酶在接种培养48小时后，添加甲醇作为诱导剂，甲醇浓度在 0~1%范围。培养96小时后测定培养液中右旋糖酐酶酶活为30U。
(4) 分离提纯右旋糖酐酶采用离心、过滤的方法分离细胞 然后选择适当超滤膜截流、浓缩发酵液、进行低温喷雾干燥或载体吸附，得到右旋糖酐酶(测定其酶活为200U)。 实施例4
一种制备右旋糖酐酶的工艺(30L发酵罐发酵)，其步骤如下
(1 )培养基配方基础培养基由10 x Basal salt+250 x PTMl+5。/。(w/v)葡萄糖+0.02。/0 甘油组成；
(2) 接种将实施例1的毕赤酵母工程菌株GS115—139按种到上述培养基培养， 培养条件温度为30 32'C, PH6.0-6.5,溶氧量20%;
(3) 诱导条件在接种培养24小时后，流加甲醇，甲醇浓度在0~1%范围。培养 96小时后测定培养液中右旋糖酐酶酶活为150U。
(4) 分离提纯右旋糖酐酶釆用离心、过滤的方法分离细胞，然后选择适当超滤膜 截流、浓缩发酵液、进行低温喷雾干燥或载体吸附，得到右旋糖酐酶(测定其酶活为 訓OU)。
实施例5
一种制备右旋糖酐酶的工艺(30L发酵罐发酵)，其步骤如下
(1 )培养基配方基础培养基由10 x Basal salt+250 x PTMl+5。/。(w/v)葡萄糖+0.020/。 泡敌组成；
(2) 接种将实施例1的毕赤酵母工程菌株GS115—139按种到上述培养基培养， 培养条件温度为28-32。C, PH5.0-7.0,溶氧量23%;
(3) 诱导条件在接种培养48小时后，流加甲醇，甲醇浓度在0~1%范围。培养 96小时后测定培养液中右旋糖酐酶酶活为165U。
(4) 分离提纯右旋糖酐酶釆用离心、过滤的方法分离细胞，然后选择适当超滤膜 截流、浓縮发酵液、进行低温喷雾干燥或载体吸附，得到右旋糖酐酶(测定其酶活为 1180U)。序列表
〈110〉广州甘蔗糖业研究所
<120>毕赤酵母工程菌株的构建方法和右旋糖酐酶的制备工艺
〈140> 200910039057.1 〈141> 2009-04-28
〈160> 2
〈210> 1
〈211〉 23
〈212> ■
<213>寡核酐酸引物
<400> Primerl
GCGCGAATTC ATGACATTAA TCT 23
<210> 2 〈211〉 26 〈212〉 ■
<213>寡核酐酸引物 〈400> Primer2
ATCGCGGCCG CGTTTATGGA CCATTG 2权利要求
1.一种毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤(1)设计寡核酐酸引物Primer1GCGCGAATTCATGACATTAATCT和Primer2ATCGCGGCCGCGTTTATGGACCATTG，引物中分别引入限制性内切酶EcoRI和NotI，以油脂酵母1390基因组DNA为模板，克隆得到右旋糖酐酶基因；(2)利用分泌表达载体pPIC9K，将双酶切后的右旋糖酐酶基因插入pPIC9K的多克隆位点(EcoRI和NotI)，并通过连接、转化、酶切等分子生物学技术操作，构建出整合分泌型表达载体(pPIC9K-139)；(3)用限制性内切酶Bgl II，对重组表达载体(pPIC9K-139)线性化，电击转化毕赤酵母GS115，采用α-factor，实现右旋糖酐酶的分泌表达，在含有G418的YEPD平板上进行筛选，得到重组毕赤酵母工程菌株(GS115-139)。
2. 根据权利要求l所述的毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于所述的毕赤 酵母工程菌株(GS115—139)的右旋糖酐酶基因为多拷贝。
3. —种制备右旋糖酐酶的工艺，其特征包括如下工序为.(1 )培养基配方基础培养基由10 x Basal salt+250 x PTMl+5。/。(w/v)葡萄糖+0.020/0 泡敌组成；(2) 接种将如权利要求1或2所述的毕赤酵母工程菌株(GS115—139)接种到上 述培养基中培养，培养条件为温度25 35。C， PH5.(K7.0，溶氧量大于20%;(3) 诱导产右旋糖酐酶接种培养24—48小时后，流加甲醇，甲醇浓度在0~1%范围；(4) 分离提纯右旋糖酐酶采用离心、过滤的方法分离细胞，然后选择适当超滤膜 截流、浓缩发酵液、进行低温喷雾干燥或载体吸附，得到右旋糖酐酶。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域和蛋白质的分泌表达领域，提出一种用于制造右旋糖酐酶的毕赤酵母工程菌株的构建方法，包括步骤(1)设计寡核苷酸引物并以油脂酵母1390基因组DNA为模板；克隆得到右旋糖酐酶基因；(2)利用分泌表达载体pPIC9K，将右旋糖酐酶基因插入pPIC9K的多克隆位点(EcoRI和NotI)，构建出整合分泌型表达载体pPIC9K-139；(3)对重组表达载体pPIC9K-139线性化，实现右旋糖酐酶的高效分泌表达，筛选得到重组毕赤酵母工程菌株GS115-139。本发明成功实现右旋糖酐酶基因在毕赤酵母中的有效表达，构建了能高效分泌表达右旋糖酐酶的工程菌株；实现右旋糖酐酶的发酵工艺放大。
文档编号C12N15/81GK101638666SQ20091003905
公开日2010年2月3日 申请日期2009年4月28日 优先权日2009年4月28日
发明者卢英华, 张远平, 敬科举, 曾练强, 李雨虹, 梁达奉, 蚁细苗, 亭 郭, 钟映萍, 陈龙军, 黄玉南 申请人:广州甘蔗糖业研究所