专利名称：一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及病毒检测领域，具体涉及一种利用环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技术检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒及其检测方法。
技术背景传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)是世界各地养殖和野生对虾的重要病毒性病原之一。该病毒的感染宿主范围广、危 害非常严重，对细角滨对虾(Lit叩enaeusstylirostris)有很髙的致病性，能造成其幼体和仔虾 高达90%的死亡率；也会导致凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)慢性矮小残缺综合症 (Runt-deformity syndrome, RDS)，使养殖凡纳滨对虾规格参差不齐，产量下降，造成高达 50%的经济损失。因此，国际兽疫局(O正)将IHHNV引起的疾病列为必须报告的重要的水 生动物病毒性疫病之一。目前对IHHNV引起的对虾病害尚无有效的治疗方法，只能以预防为主；而这又主要依赖 于早期快速的诊断和筛査。近年来基于临床组织病理学、免疫学以及PCR技术等的各种诊断 方法已被用于IHHNV的检测。但是现有的这些方法都存在一定的不足，例如基于组织病理 学的方法不仅操作繁琐、费时，而且灵敏度较低；基于免疫学的方法虽然具有敏感性高、检 测快速等特点，可用于大批标本的检测，但对新鲜样品进行检测时出现的假阳性问题在一定 程度上还限制着该方法的广泛应用；而PCR方法敏感、准确、快速，可替代病原学检测，但 由f需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现 场快速检测及基层普及应用。LAMP是一种新型的核酸等温扩增技术，该技术针对耙基因的6个区域设计4条特异引物， 利用一种链置换DNA聚合酶(5W DNA polymerase)在恒温条件下即可完成核酸扩增反应， 扩增出LAMP特征性梯状条带。LAMP技术在保持PCR技术优点的基础上，进一步增强了反 应的特异性和縮短了检测时间；特别是它不需使用昂贵的热循环仪，在等温条件下就能完成 反应，且扩增产物用肉眼能观察，可用于病原微生物的现场快速检测。但是在实际应用中， 由于特异性引物设ii和其检测试剂盒研制的复杂性，导致LAMP技术还未能推广于医疗卫生、 食品等领域；在水产动物病原的检测方面更是未能见到有LAMP诊断试剂盒的推出和应用。 发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于检测IHHNV的试剂盒。该试剂盒 特异性强，敏感性高，准确快速。
本发明另一目的在于提供一种利用上述试剂盒检测IHHNV的方法。该方法方便、灵敏，
增强了反应的特异性并缩短了检测时间。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现 本发明用于检测IHHNV的试剂盒包括如下组分-
(1) 组织样品的基因组DNA提取液；
(2) LAMP预反应液；
(3) 勘,DNA聚合酶；
(4) LAMP反应稳定液；
(5) LAMP反应显色液；
(6) 阳性对照DNA;
(7) 阴性对照DNA。
其中，所述组分(1)包括组织裂解液和DNA吸附液；组织裂解液为含有4 6M异硫 氰酸胍(GTC)、 20 25mM柠檬酸钠、0.5%十二烷基肌氨酸钠和0.1 0.2M/3-巯基乙醇；DNA 吸附液为含50%磁珠的悬浮液。
所述组分(2)包括20 25mMpH为8.8的Tris-HCl、 2~4mM硫酸镁、10~12mM氯化钾、 10 12mM硫酸铵、l~1.25%TritonX-100、 400 500/iM dNTP、 0.8 1.2M甜菜碱、0.8 1^M序 列如SEQ ID NO.l所示的引物IHHNV-FIP、 0.8~1//M序列如SEQ ID N0.2所示的引物 IHHNV-BIP、 0.2~0.4)tiM序列如SEQ ID N0.3所示的引物IHHNV-F3、 0.2 0.4/iM序列如SEQ ID NO.4所示的引物IHHNV-B3 。
所述组分(3)为每微升含8个活性单位的SWDNA聚合酶。
所述组分(4)由矿物油或液体石蜡油组成。
所述组分(5)为含有10。/。SYBRGreenl的荧光染料。
所述组分(6)为含有提取的IHHNV病毒基因组DNA。
所述组分(7)为含有提取的健康对虾基因组DNA。
本发明试剂盒的主要原理为①设计一组能特异识别靶DNA的六个不同序列的两个内弓I 物(t游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和F游外引物)，内引物包含靶 DNA的正义链和反义链；②其中一个内引物首先与靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成，在 具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下，由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到耙的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成的模板，产生一个原始的茎 环DNA;③内引物以原始的茎环DNA为模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环 DNA和一个新的有两倍茎长度的茎环DNA;④在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通 过链置换形成多个含有靶DNA反复重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA 累积到109拷贝，最后通过加入荧光染料来观察扩增结果。 利用本发明试剂盒检测IHHNV的方法包括如下步骤-
(1) 待检样品DNA的提取
A. 取待检样品置于离心管中，加入组织裂解液，捣烂，室温裂解；
B. 离心取上清，置于离心管中；
C. 加入DNA吸附液，室温放置，期间摇匀；
D. 离心，弃上清液，加入70%乙醇，上下颠倒混匀，使沉淀充分重悬起来；
E. 离心，弃上清液，将沉淀放置于恒温金属浴中烘干，离心管盖打开；
F. 加入ddH20，使用移液器上f吹打混匀，55'C放置，离心，上清液即为待检样品的DNA;
(2) 传染性皮下及造血组织坏死病毒的LAMP扩增
A. 根据待检测样品的数目，设置所需LAMP反应管数；
B. 吸取LAMP预反应液，加入一洁净的离心管中，然后加入&fDNA聚合酶，混合均匀， 离心，得到混合液；
C. 向反应管中分别加入上述混合液，然后在每个反应管中再分别加入LAMP反应稳定 液，离心；
D. 向上述反应管内按顺序依次分别加入阴性对照DNA、待检模板DNA和阳性对照DNA;
E. 置恒温金属浴中于64。C恒温反应；
(3) 显色检测
取出LAMP反应管，冷却至室温，离心，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依 次分别加入显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化。 利用本发明试剂盒检测IHHNV的方法优选为 (1)待检样品的DNA提取
A. 取待检样品25 30mg置于1.5 ml离心管中，加入200pL组织裂解液，捣烂，室温裂解 30分钟；
B. 12000转/分离心3 5分钟，取上清，置于1.5ml离心管中；
C. 加入15aiLDNA吸附液B，室温放置5分钟，期间摇匀3次；D. 10000转/分离心20秒，弃上清液，加入200;uL 70%乙醇，上下颠倒混匀，使沉淀充分 重悬起来；
E. 10000转/分离心30秒，弃上清液，将沉淀放置于6(TC的恒温金属浴中烘干3 5分钟；
R加入2(^LddH20，使用移液器上下吹打混匀，55'C放置5分钟，然后10000转/分离心30 秒，上清液即为待检样品的DNA:
(2) 传染性皮下及造血组织坏死病毒的LAMP扩增
A. 根据待检测样品的数目，设置所需LAMP反应管数N， N=样品数+l管阳性对照+l管 阴性对照；
B. 吸取LAMP预反应液的体积为Nx23/zL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入N 5wDNA聚合酶，混合均匀，1500 2000转/分钟离心10秒；
C. 向设定的N个反应管中分别加入24/xL上述混合液，然后在t述每个反应管中再分别 加入3(^L LAMP反应稳定液，2000转/分钟离心5秒；
D. 向上述N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照DNA、待检模板DNA和阳性对 照DNA各l/zL，盖紧管盖并做好标记；
E. 置恒温金属浴中于64。C恒温反应60分钟；
(3) 显色检测
取出LAMP反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性 对照的顺序依次分别加入lpL显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化。 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明试剂盒特异性强，可广泛应用于科研，特别是养殖现场的IHHNV的检测。本发 明检测方法快速灵敏，较PCR方法有更高的灵敏度，但不需昂贵的PCR仪，降低了成本， 结果检测方法简单直观。
具体实施例方式
以下就实施例来具体解释本发明，但实施例并不对本发明做任何限定。 实施例l待检样品的DNA提取
(1) 取待检样品30mg置于1.5 ml离心管中，加入200/iL组织裂解液，捣烂；室温裂解30
分钟；
(2) 用台式离心机12000转/分离心5分钟，取上清，置于1.5ml离心管中；
(3) 加入15pL DNA吸附液(内含白色物质，用前充分摇匀)，室温放置5分钟，期间摇 匀3次；(4) 用台式离心机10000转/分离心20秒，弃上清液，加入200mL 70%乙醇，上下颠倒混 匀，使沉淀充分重悬起来；
(5) 用台式离心机10000转/分离心30秒，弃上清液，将沉淀放置于6(TC的恒温金属浴中 烘干5分钟，离心管盖打开；
(6) 加入20MLddH20，使用移液器上下吹打混匀，55'C放置5分钟，然后10000转/分 离心30秒，上清液即为待检样品的DNA。
实施例2传染性皮下及造血组织坏死病毒的LAMP扩增
(1) 根据待检测样品的数目，设置所需LAMP反应管数N， N=样品数+l管阳性对照+l 管阴性对照；
(2) 吸取LAMP预反应液C的体积为Nx23/zL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入 N/iL5^DNA聚合酶，混合均匀，1500 2000转/分钟离心10秒；
(3) 向设定的N个反应管中分别加入24/iL上述混合液，然后在上述每个反应管中再分 别加入30/xL LAMP反应稳定液，2000转/分钟离心5秒；
(4) 向上述N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检模板DNA和阳性对照 各l/zL，盖紧管盖并做好标记；
(5) 置恒温金属浴中于64。C恒温反应60分钟。 实施例3显色检测
取出LAMP反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性 对照的顺序依次分别加入lpL显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化；建议在黑色背 景下观察。 实施例4结果判断
在阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下若待检样品反应 管液体呈绿色，该样品结果为IHHNV阳性；若待检样品反应管液体呈橙色则表明该样品
IHHNV检验结果为阴性；若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，
应重新检测。一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒及其检测方法 SEQUENCE LISTING
<110〉中国科学院南海海洋研究所
<120> —种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒及其检测方法
<130〉
<160〉 4
〈170> Patentln version 3. 2
<210〉 1
〈211〉 45
<212> 腿
<213> 人工序列
<柳〉1
gctctctcct ccatcggtag gtttttcgac gacatcagga aagcg 45
<210〉 2
〈211〉 44
<212> DNA
<213〉 人工序列
<210〉 3
<211〉 19
〈212〉 DNA <213〉人工序列
〈400> 3
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〈212〉 腿
〈213〉 人工序列
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〈400〉 4
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权利要求
1.一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括如下组分(1)组织样品的基因组DNA提取液；(2)LAMP预反应液；(3)BstDNA聚合酶；(4)LAMP反应稳定液；(5)LAMP反应显色液；(6)阳性对照DNA；(7)阴性对照DNA。
2. 如权利要求1所述用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒，其特征在 于所述组分(1)包括组织裂解液和DNA吸附液。
3. 如权利要求1所述用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒，其特征在 于所述组分(2)包括20 25mMpH为8.8的Tris-HCl、 2 4mM硫酸镁、10 12mM氯化钾、 10 12mM硫酸铵、l 1.25%TritonX-100、 400 500#M dNTP、 0.8-L2M甜菜碱、0.8 1//M序 列如SEQ ID NO.l所示的引物IHHNV-FIP、 0.8 lgM序列如SEQ ID N0.2所示的引物 IHHNV-BIP、 0.2~0. M序列如SEQ ID N0.3所示的引物IHHNV-F2、 0.2~0.4/uM序列如SEQ ID N0.4所示的引物IHHNV-B3。
4. 如权利要求1所述用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒，其特征在 于所述组分(3)为每微升含8个活性单位的SWDNA聚合酶。
5. 如权利要求l所述用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒，其特征在 于所述组分(4)由矿物油或液体石蜡油组成。
6. 如权利要求l所述用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒，其特征在 于所述组分(5)为含有10%SYBRGreenI的荧光染料。
7. 如权利要求1所述用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒，其特征在 于所述组分(6)为含有提取的对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒基因组DNA。
8. 如权利要求1所述用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒，其特征在 于所述组分(7)为含有提取的健康对虾基因组DNA。
9. 一种使用权利要求1所述试剂盒检测IHHNV的方法，其特征在于包括如下步骤 (1)待检样品DNA的提取A. 取待检样品置于离心管中，加入组织裂解液，捣烂，室温裂解；B. 离心取上清，置于离心管中；C. 加入DNA吸附液，室温放置，期间摇匀；D. 离心，弃上清液，加入70%乙醇，上下颠倒混匀，使沉淀充分重悬起来；E. 离心，弃上清液，将沉淀放置于恒温金属浴中烘干，离心管盖打开；F. 加入ddH20，使用移液器上下吹打混匀，55'C放置，离心，上清液即为待检样品的DNA;(2) 传染性皮下及造血组织坏死病毒的LAMP扩增A. 根据待检测样品的数目，设置所需LAMP反应管数；B. 吸取LAMP预反应液，加入一洁净的离心管中，然后加入勘fDNA聚合酶，混合均匀， 离心，得到混合液；C. 向反应管中分别加入上述混合液，然后在每个反应管中再分别加入LAMP反应稳定 液，离心；D. 向上述反应管内按顺序依次分別加入阴性对照DNA、待检模板DNA和阳性对照DNA;E. 置恒温金属浴中于64°C恒温反应；(3) 显色检测取出LAMP反应管，冷却至室温，离心，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依 次分别加入显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化。
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于包括如下步骤 (1)待检样品的DNA提取A. 取待检样品25 30mg置于1.5 ml离心管中，加入200)wL组织裂解液，捣烂，室温裂解30分钟；B. 12000转/分离心3 5分钟，取上清，置于1.5ml离心管屮；C. 加入15pLDNA吸附液B，室温放置5分钟，期间摇匀3次；D. 10000转/分离心20秒，弃上清液，加入200/xL 70%乙醇，上下颠倒混匀，使沉淀充分 重悬起来；E. 10000转/分离心30秒，弃上清液，将沉淀放置于6(TC的恒温金属浴中烘千3 5分钟， 离心管盖打开；F. 加入20MLddH2(D,使用移液器上下吹打混匀，55'C放置5分钟，然后10000转/分离心30 秒，上清液即为待检样品的DNA;(2 )传染性皮下及造血组织坏死病毒的LAMP扩增A. 根据待检测样品的数目，设置所需LAMP反应管数N， N=样品数+l管阳性对照+l管 阴性对照；B. 吸取LAMP预反应液的体积为Nx23pL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入NjuL BWDNA聚合酶，混合均匀，1500 2000转/分钟离心10秒；C. 向设定的N个反应管中分别加入24/xL上述混合液，然后在上述每个反应管中再分别 加入30mL LAMP反应稳定液，2000转/分钟离心5秒；D. 向上述N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照DNA、待检模板DNA和阳性对 照DNA各l/xL，盖紧管盖并做好标记；E. 置恒温金属浴中于64。C恒温反应60分钟； (3)显色检测取出LAMP反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性 对照的顺序依次分别加入lpL显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的试剂盒。该试剂盒包括待检样品DNA提取试剂、LAMP预反应液、Bst DNA聚合酶、LAMP反应稳定液、显色液、阳性对照DNA和阴性对照DNA。本发明还公开了一种利用上述试剂盒检测IHHNV的方法。本发明试剂盒特异性强，可广泛应用于科研，特别是养殖现场的IHHNV的检测。本发明检测方法快速灵敏，成本低，不需要PCR仪和电泳仪，可直接用肉眼判定检测结果。
文档编号C12Q1/70GK101643793SQ20091004220
公开日2010年2月10日 申请日期2009年8月27日 优先权日2009年8月27日
发明者任春华, 张吕平, 晓 江, 鹏 罗, 胡超群, 哲 赵 申请人:中国科学院南海海洋研究所