专利名称：一种生产重组高活性锰超氧化物歧化酶的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种生产重组高活性锰超氧化 物歧化酶的方法。
背景技术：
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是一类广泛存在于生物体内的金 属酶，能够保护需氧细胞免受正常代谢过程中产生的活性氧(reactive oxygen species, R0S)的毒害，其主要催化下列反应202__+2H+ — H202+02, H2O2随后被过氧化氢酶(CATs)和 过氧化物酶清除。SOD家族有多种同功酶，按分子所含金属辅基的不同，可将其分为铜锌超氧化物歧 化酶(Cu，Ζη-SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和胞外超氧 化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase, EC-S0D)四类，这四类 SOD 都催化同 一种催化反应。由于不同类型的SOD在一级结构上无同源性，它们之间的理化特性及稳定 性差别很大，不同种属不同组织来源的同种SOD也略有差别。锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，Mn_S0D)是哺乳动物的三 种超氧化物歧化酶之一，位于线粒体内，对维持胞内ROS平衡具有重要的作用。ROS对多种 生理过程的调节具有重要作用，如信号转导、凋亡、分化和衰老。ROS不仅和多种病理状态 的病因有关，而且参与肿瘤的形成过程。Mn-SOD可以从动物血提取，但由于存在动物源性的问题，在应用的过程中可能会 存在免疫原性，同时动物源性还可能带入其它污染，存在不安全问题。所以，利用基因工程 技术进行人Mn-SOD的生产是一种可行且便捷的方法。基因工程Mn-SOD的生产存在的问题 之一是由于诱导后的过量表达来不及正确折叠形成不溶性的包涵体，需要进一步的变性、 复性才有可能获得活性Mn-SOD，另外，即使是可溶性表达，也普遍存在活性不高的问题，这 也是由于其折叠过程的不正确造成的。因此，本领域需要进一步研究开发获得高活性Mn-SOD的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产重组高活性锰超氧化物歧化酶的方法。在本发明的第一方面，提供一种生产锰超氧化物歧化酶的方法，所述方法包括(1)重组表达锰超氧化物歧化酶，获得含有可溶性表达的锰超氧化物歧化酶的细 胞(细胞培养物)；(2)破碎步骤(1)获得的细胞，离心获取上清；(3)将步骤(2)获得的上清进行热变性，热变性温度为75士2°C，热变性时间为 10 士 5分钟；热变性后冷却，离心(优选离心10 士 2分钟)获取上清；(4)纯化步骤(3)得到的上清，获得纯化的锰超氧化物歧化酶；和(5)在纯化的锰超氧化物歧化酶中加入锰离子，获得激活的锰超氧化物歧化酶。
在一个优选例中，步骤(2)中，采用超声破碎细胞在另一优选例中，步骤(1)中，采用大肠杆菌重组表达锰超氧化物歧化酶。在另一优选例中，步骤(3)中，热变性温度为75士2°C (优选75士 1°C，更优选 750C )，热变性时间为10士2分钟(优选10士 1分钟；更优选10分钟)。在另一优选例中，所述的热变性在水浴中进行。在另一优选例中，热变性后冷却至0_4°C (优选0°C )。在另一优选例中，步骤(4)中，采用DEAE-FF阴离子交换树脂进行纯化。在另一优选例中，所述的锰超氧化物歧化酶是人锰超氧化物歧化酶。在另一优选例中，步骤(5)中，按照摩尔比锰超氧化物歧化酶锰离子(Mn2+)为 1 (5-100)在纯化的锰超氧化物歧化酶中加入锰离子。在另一优选例中，按照摩尔比锰超氧化物歧化酶锰离子为1 (10-30)在纯化 的锰超氧化物歧化酶中加入锰离子。更优选地，按照摩尔比锰超氧化物歧化酶锰离子为1 20在纯化的锰超氧化物 歧化酶中加入锰离子。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
图1A、粗酶液的比活与热变性时间的关系。图1B、总的酶活与热变性时间的关系。图2、可溶性表达的rhMn-SOD的纯化。
具体实施例方式为了得到高活性的重组锰超氧化物歧化酶，本发明人经过深入的研究，开发了一 种生产重组高活性锰超氧化物歧化酶的方法，所述方法在重组可溶性表达锰超氧化物歧化 酶后，将细胞上清进行热变性，之后纯化经过热变性的蛋白溶液，纯化产物用适当浓度的锰 离子进行激活。所述方法可获得高活性的锰超氧化物歧化酶。本发明的生产重组活性锰超氧化物歧化酶的方法，即从可溶性表达的无活性或者 低活性的脱辅基超氧化物歧化酶通过体外处理获得活性锰超氧化物歧化酶的方法，体外处 理的方法为在适当条件下加入适量的辅基-锰离子；适当的条件还包括适量辅基的加入后 转变为有活性锰超氧化物歧化酶的条件。如本文所用，术语“锰超氧化物歧化酶”、"Mn-S0D'\ "MnSOD“可互换使用。如本文所用，术语“重组人锰超氧化物歧化酶”、“rhMn-SOD”、“重组人Mn-SOD”可
互换使用，都指来源于人的经基因工程手段重组表达获得的锰超氧化物歧化酶。如本文所用，术语“具有酶活性”指具有天然存在的锰超氧化物歧化酶的生物活 性。天然存在的锰超氧化物歧化酶的生物活性例如指其抑制连苯三酚自氧化的活性。本发明提供一种生产锰超氧化物歧化酶的方法，所述方法包括(1)重组表达锰超氧化物歧化酶，获得含有可溶性表达的锰超氧化物歧化酶的细 胞；
(2)破碎步骤(1)获得的细胞，离心获取上清；(3)将步骤⑵获得的上清进行热变性，热变性温度为75士2°C，热变性时间为 10 士 5分钟；热变性后冷却，离心获取上清；(4)纯化步骤(3)得到的上清，获得纯化的锰超氧化物歧化酶；和(5)在纯化的锰超氧化物歧化酶中加入锰离子，获得激活的锰超氧化物歧化酶。可用于本发明方法的锰超氧化物歧化酶没有特别限制，可以是来源于任何物种的 锰超氧化物歧化酶。一种优选的锰超氧化物歧化酶是来源于人的锰超氧化物歧化酶。用于本发明的锰超氧化物歧化酶是重组表达的锰超氧化物歧化酶。重组锰超氧化 物歧化酶表示通过重组体DNA方法和其他人工方法制备的重组多肽，它具有与任何天然存 在的锰超氧化物歧化酶相同的或基本上相同的氨基酸序列。众所周知，根据已公开的锰超氧化物歧化酶序列，本领域技术人员可以通过PCR 扩增等方法制备锰超氧化物歧化酶的编码序列，然后将其插入表达载体，进而转化常见的 宿主细胞(如大肠杆菌)，就可以表达重组锰超氧化物歧化酶。在本发明的一个优选例中， 通过IPTG诱导使得大肠杆菌表达可溶性的锰超氧化物歧化酶，然后回收该锰超氧化物歧化酶。本领域技术人员能够选择表达载体和宿主细胞。优选的表达载体宜包括在宿主细 胞内表达克隆的基因所必需的调节元件，定位在编码锰超氧化物歧化酶的核酸附近，以便 影响其表达。优选的细菌寄主细胞是大肠杆菌细胞，一种合适的大肠杆菌的例子是常见的 大肠杆菌BL21(DE3)。对于表达重组锰超氧化物歧化酶的大肠杆菌，通过本领域人员常用的破细胞手段 (如珠磨法破碎、液氮研磨破碎、压力杯法破碎、超声破碎等)，可以获得可溶性的重组锰超 氧化物歧化酶。作为本发明的优选方式，采用超声破碎细胞可以获得良好的细胞破碎效果。破碎细胞后获得的可溶性蛋白中通常同时还包含其它杂蛋白，需要通过适当的方 法来去除杂蛋白而保留可溶性的重组锰超氧化物歧化酶。去除杂蛋白的方法在本领域中是 多种多样的，本发明人经过反复研究后，意外地发现采用热变性方法来去除杂蛋白可以获 得良好的效果，不仅使得杂蛋白尽可能多地被去除，而且对于重组锰超氧化物歧化酶的损 害最低，从而为后续获得高活性的重组锰超氧化物歧化酶提供了基础。本发明人还发现，不 经过热变性步骤去除杂蛋白而直接进行纯化，纯化效果不好，且得到的锰超氧化物歧化酶 的活性也不够理想。热变性的温度也是较为关键的因素，温度太高可能会影响到酶活性，而温度过低 可能不足以分离去除(沉淀)杂蛋白。作为本发明的优选方式，热变性温度为75士2°C;更 优选75士 1°C，最优选75°C，在所述温度下进行热变性，非但不会明显降低重组锰超氧化物 歧化酶的酶活性，而且还能够尽可能多地去除杂蛋白。热变性的时间是另一较为关键的因素，时间过长会对酶活性造成不可逆转的影 响，而时间过短可能不足以分离去除(沉淀)杂蛋白。作为本发明的优选方式，热变性时间 为10士2分钟，更优选10士 1分钟；最优选10分钟。热变性的实施可采用本领域常用的加热技术，作为本发明的优选方式，所述的热 变性在水浴中进行，水浴提供了均勻且温和的条件，从而有利于保留重组锰超氧化物歧化 酶的酶活性。
作为本发明的优选方式，热变性后立即将重组锰超氧化物歧化酶的酶液冷却，从 而有利于较多地沉淀掉杂蛋白。优选地，将酶液冷却至0-4°C (优选0°C)。经历热变性后的酶液可进一步进行纯化。一种优选的纯化方法为阴离子树脂吸附 法；优选的阴离子树脂包括DEAE阴离子交换树脂(如DEAE-FF阴离子交换树脂)；优选的 纯化方法包括连续NaCl梯度洗脱；优选的NaCl洗脱的浓度范围为0-0. 5M。获得纯化的重组锰超氧化物歧化酶后，需要对该酶进行激活以得到活化的重组锰 超氧化物歧化酶，用于激活的锰离子浓度的高低也可影响到其酶活性的高低。作为本发明 的优选方式， 按照摩尔比锰超氧化物歧化酶锰离子为1 (5-100)在纯化的锰超氧化物 歧化酶中加入锰离子；更优选地，按照摩尔比锰超氧化物歧化酶锰离子为1 (10-30)在 纯化的锰超氧化物歧化酶中加入锰离子；最优选地，按照摩尔比锰超氧化物歧化酶锰离 子为1 20在纯化的锰超氧化物歧化酶中加入锰离子。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1、重组人Mn-SOD的可溶性表达设计以下引物正向5-GACATATGAAGCACAGCCTCCCCGACC-3，(SEQID NO 1)；反向5，-GCAAGCTTGCATAACGATCGTGGTTTAC-3，(SEQID NO :2)。以人胎盘cDNA(购自Invitrogen)为模板，用前述引物进行PCR扩增获得人 Mn-SOD的编码序列。前述获得的序列用Ndel/Hindlll酶切后插入到pET28a表达载体(购自 Invitrogen)的相应位点中，测序鉴定获得正确插入的重组表达载体。将该重组表达载体常 规方法转化大肠杆菌BL21 (DE3)，获得转化子。挑取转化平板上的单克隆菌落，接种至30mL LB培养液中(含100 μ g/mLAmp)， 置于37°C摇床过夜培养(10 12h)后，以2%接种量转入二级瓶中，继续培养。菌密度 至0D6000. 5 0. 6时，于37°C和12 °C下分别加入终浓度0. 5mmol/L IPTG诱导4小时， IOOOOrpm离心收集菌体，弃上清，菌体超声破碎，离心后获得上清表达的重组人Mn_S0D。实施例2、上清中加入不同浓度Mn2+对Mn-SOD激活的作用前述获得的细胞培养物进行超声破碎，离心后收集上清，其中含有可溶性的重组 人Mn-SOD以及其它杂蛋白。在获得的含有可溶性的重组人Mn-SOD (rhMn-SOD)的上清中加入不同浓度的Mn2+， 观察不同浓度Mn2+对Mn-SOD激活的作用。结果见表1。rhMn-SOD活性的测定方法采用微量连苯三酚法。酶活性定义如下25°C时，Iml反 应液中每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为一个活性单位。
rhMn-SOD比活性的测定定义为每mg蛋白所含的酶活力单位数。单位为U/mg。表 1
rhMn-SOD 活 性(U/ml)蛋白含量 (mg/ml)比活提高倍数上清1602.369.61Mn2+浓 度(mM)0.110062.3437.46.3112102.3526.17.61010902.3473.96.8可见，当Mn2+浓度为ImM时，rhMn-SOD活性最高。实施例3、热变性方法除上清中杂蛋白前述获得的细胞培养物进行超声破碎，离心后收集上清，得到粗酶液。超声破碎菌体后所得的粗酶液分别在60、65、70、75、80°C水浴条件下，热变性5、 10、15、20min，热变性后立即浸入水中(水温0°C )冷却，离心lOmin，取上清酶液，测定比 活。获得的比活测定结果见图1A。可见，75°C IOmin的热变性效果是最佳的，上清中比活提高2. 5倍，而此时总的酶 活也没有明显降低，见图1B。因此，确定75°C IOmin为rhMn-SOD粗酶液热变性条件。实施例4、上清中脱辅基rhMn-SOD的纯化脱辅基是指分子中不含有辅因子Mn的SOD蛋白，该实施例中脱辅基的rhMn-SOD 通过在培养诱导过程中不加入辅因子Mn而获得。用2 X 15cm层析柱，DEAE-FF阴离子交换柱事先用20mM Tris-HCl，pH 8. 0的缓冲 液平衡，然后经热变性处理后的上清液上样，用相同的缓冲液平衡至基线平稳后，用含0 0. 5M NaCl梯度洗脱，分部收集，测定每管的0D280和酶活，把有酶活的收集液合并，测总酶 活和总蛋白含量。合并酶活高的收集管，即得纯化的活性重组rhMn-SOD。可溶性表达的rhMn-SOD的纯化结果见图2。纯化后脱辅基重组人Mn-SOD上清中加入不同浓度Mn2+对Mn-SOD激活的作用见表 2。Mn2+处理在室温和最适pH条件下(如pH8. 0)进行。表2
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权利要求
一种生产锰超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，所述方法包括(1)重组表达锰超氧化物歧化酶，获得含有可溶性表达的锰超氧化物歧化酶的细胞；(2)破碎步骤(1)获得的细胞，离心获取上清；(3)将步骤(2)获得的上清进行热变性，热变性温度为75±2℃，热变性时间为10±5分钟；热变性后冷却，离心获取上清；(4)纯化步骤(3)得到的上清，获得纯化的锰超氧化物歧化酶；和(5)在纯化的锰超氧化物歧化酶中加入锰离子，获得激活的锰超氧化物歧化酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，采用超声破碎细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用大肠杆菌重组表达锰超氧 化物歧化酶。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，热变性温度为75士2°C，热变性 时间为10士2分钟。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的热变性在水浴中进行。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，热变性后冷却至0-4°C。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，采用DEAE-FF阴离子交换树脂 进行纯化。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的锰超氧化物歧化酶是人锰超氧化物 歧化酶。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，按照摩尔比锰超氧化物歧化 酶锰离子为1 (5-100)在纯化的锰超氧化物歧化酶中加入锰离子。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，按照摩尔比锰超氧化物歧化酶锰离子为 1 (10-30)在纯化的锰超氧化物歧化酶中加入锰离子。
全文摘要
本发明涉及一种生产重组高活性锰超氧化物歧化酶的方法。所述方法在重组可溶性表达锰超氧化物歧化酶后，将细胞上清进行热变性，之后纯化经过热变性的蛋白溶液，纯化产物用适当浓度的锰离子进行激活。所述方法可获得高活性的锰超氧化物歧化酶。
文档编号C12N9/02GK101955918SQ20091005500
公开日2011年1月26日 申请日期2009年7月17日 优先权日2009年7月17日
发明者吴梧桐, 李素霞, 袁勤生, 陈车生 申请人:华东理工大学