专利名称：：甲壳素脱乙酰酶的生物制备方法
技术领域：
：本发明涉及生物技术的酶工程领域，更具体地涉及利用基因工程的手段获得产生甲壳素脱乙酰酶工程菌来制备乙酰酶的方法。
背景技术：
：甲壳素是一种高分子物质，在自然界的含量仅次于纤维素，全球虾蟹壳年产量近2,000万吨。甲壳素不溶于水、稀酸、稀碱和其他有机溶剂，很大程度上限制了其应用范围。目前应用最多的是甲壳素的脱乙酰衍生物——壳聚但是，甲壳素脱去乙酰基成为壳聚糖的过程必须要具备浓碱(至少40%以上)和较高温度(9(TC以上)的条件，这不但对生产设备提出了很高的要求，而且遇到了"生产过程中的浓碱如何处理"的难题。据统计我国的甲壳素产量已超过了4000吨大关，市场对甲壳素的巨大需求和甲壳素生产中的严重污染之间存在着不可调和的矛盾，针对甲壳素脱乙酰酶的研究便应运而生。甲壳素脱乙酰酶(chitindeacetylase,EC3.5丄41)是一种催化甲壳素分子脱除乙酰基、形成壳聚糖的酶，将这种酶应用于壳聚糖的制备，不仅可以有效地解决目前壳聚糖生产中的环境污染问题，而且可以生产出目前化学法不能生产的、适用于特殊行业(医药、环保等)需求的壳聚糖产品，如乙酰基程度均匀、分子量范围分布窄的壳聚糖产品、以及具有特定乙酰基位置的壳聚寡糖等。但是由于该酶在生物界中并不普遍存在，所以它的来源问题一直困扰着它的应用。围绕这个问题，主要的研究进展体现在如下方面1真菌来源的甲壳素脱乙酰酶1974年Yoshio最初在接合菌纲的鲁氏毛霉中首先发现了甲壳素脱乙酰酶的存在，20年后Kafezopulos采用了硫酸铵沉淀、三次凝胶层析结合的方法分离得到了电泳纯的甲壳素脱乙酰酶。以后，研究者们又陆续从犁头霉、构巢曲霉、黑根霉、短帚霉、灰色小克银汉霉及啤酒酵母等微生物中检测到了甲壳素脱乙酰酶活性的存在。2细菌来源的甲壳素脱乙酰酶我国学者黄慧莉等在枯草芽孢杆菌中发现了甲壳素脱乙酰基酶活性，并对其酶学特性进行了研究，发现与真菌来源的酶学性质相似。3病原体来源的甲壳素脱乙酰酶1990年日本研究者在炭疽病病原菌中较早的发现了甲壳素脱乙酰酶，并用生化分离技术分离得到纯度较高的酶，其酶学性质与真菌来源的酶有较大差异。2006年，研究者又在病原菌侵袭内阿衣巴中证实了该酶的存在。虽然甲壳素脱乙酰酶存在于一些生物体内，但是其含量都是微乎其微的。依靠传统的生化技术、分离获得甲壳素脱乙酰酶的主要过程是从特定的微生物的菌丝体或培养液出发，采用高速离心分离的办法获得含有甲壳素脱乙酰酶的粗提取液，再组合使用若干种柱层析分离方法，以获得纯度较高的酶产品。该过程耗时长、得率低，仅能满足实验室的需要。所以，用基因工程的方法构建表达该酶的工程菌，为大量、快速生产甲壳素脱乙酰酶提供了一条有效的途径。构建酶工程菌株首先需要特定的基因片段。不同生物来源的基因片段往往对基因能否表达、基因的表达形式和基因的表达条件起着至关重要的作用。然而，一旦获得良好的酶工程菌株，进而采用发酵的方法来获得生物酶，那么不仅可以解决生物材料来源的问题，还可以大大的简化费时费力的生物酶纯化过程。为了进一步扩大甲壳素及壳聚糖的应用范围并保护其知识产权，本领域迫切需要解决甲壳素脱乙酰酶的来源问题，而用基因工程的方法和手段制备生物酶是其先决条件。目前，我国尚无任何关于甲壳素脱乙酰酶制备方法的专利。
发明内容为了克服传统的生化技术、分离获得甲壳素脱乙酰酶的耗时长、得率低，仅能满足实验室的需要的缺点，本发明的目的是提供一种可以快速、大量制备甲壳素脱乙酰酶的方法。本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现一种甲壳素脱乙酰酶的生物制备方法，它包括下列步骤(a)制备含基因序列如SEQIDNO.l所述甲壳素脱乙酰酶的重组表达载体；(b)制备含有步骤(a)所述重组表达载体的转化体；(c)表达和纯化甲壳素脱乙酰酶。在一实施例中，所述步骤(a)如下①选取处于对数生长期的总状毛霉菌丝体为材料，从中抽提总RNA;②使用通用引物T17AP进行逆转录反应，用基因特异的简并引物(5，-GATGATGGMCCYAACTGYTC-3，，M=A/C，Y=C/T)和通用引物AP扩增基因的3'末端；根据得到的3'末端信息，设计基因特异性的引物(5'-TCGGCTACTGTTTTAGTCAGG-3，)，合成5'端第一链cDNA并加尾；进而运用基因特异性引物(5'-ACCGTCTTGAATACCACGCAT-3，)和AP引物扩增得到5'末端cDNA;拼接5'和3'末端cDNA序列，从而得到总状毛霉甲壳素脱乙酰酶的全长cDNA;③釆用PCR的引物为正向5，画GCGGATCCCTTACTTCTGGCACAATTTTAC國3，，反向5，-CCGCTCGAGTTAAGACAGTAAAGAACCAAG-3，，以全长cDNA为模板，进行PCR反应，收集含所述基因序列如SEQIDNO.l的DNA片段；④将步骤③所得的DNA片段和表达载体进行双酶切作用，然后用DNA连接酶连接，获得甲壳素脱乙酰酶的重组表达载体。在一实施例中，所用的内切酶为5am/和^0/。在一实施例中，所述的表达载体为pET28a(质粒大小为5369bp)，用限制性内切酶丑am/和^72o/双酶切切除的序列158-198bp之间的片段。在一实施例中，所述的表达载体重组表达区域包含6个组氨酸序列标签。在一实施例中，所述的转化体为大肠杆菌BL21。本发明的有益效果发明人经过广泛而深入的研究和试验，发现到相比于其他几种霉菌(根霉，曲霉和青霉)，总状毛霉的培养液和菌丝体中均能检测到较高的、对于甲壳素晶体底物的脱乙酰酶活性，所以其中必定含有编码基因。本发明人根据其他一些已发现的脱乙酰酶基因的共性，设计了基因特异性的简并引物，结合逆转录-聚合酶链式反应和快速扩增cDNA片段末端技术，从总状毛霉总RNA中捕获了该基因的全长cDNA。本发明首次从总状毛霉中获取了甲壳素脱乙酰酶基因(共2个，分别为Cdal和Cda2)，并优选其一即Cda2，进而获得了该基因的重组表达载体，在原核宿主大肠杆菌内表达，得到了甲壳素脱乙酰酶。本发明设计基因特异性简并引物，采用逆转录-聚合酶链式反应和快速扩增cDNA片段末端技术，结合重组DNA的方法，利用已有的原核表达载体，得到了能够产生甲壳素脱乙酰酶的大肠杆菌菌株。为生物制备甲壳素脱乙酰酶提供了可靠的来源。在国内首次在原核细胞大肠杆菌内表达了总状毛霉来源的甲壳素脱乙酰酶基因。与从生物体内提取、纯化得到酶的传统的方法相比，具有生产周期短、提取成本低、产品酶得率和产量较高等优点。本发明人经过条件优化，进一步提高了甲壳素脱乙酰酶基因在大肠杆菌内的表达效率。本发明针对变性的包涵体蛋白质，实现了液相色谱柱上复性。并与总状毛霉的另一甲壳素脱乙酰酶基因(Cdal)的重组蛋白作了比较。以下结合附图和具体实施方式来进一步说明本发明。图1表示将甲壳素脱乙酰酶核心序列插入表达载体pET28a后形成的重组质粒。pET28a-Cda2重组质粒(Kan表示卡那霉素抗性标记；Ori表示复制起点；lacl表示阻遏蛋白编码序列；Cda2表示甲壳素脱乙酰酶编码序列；florigin表示转录起始位点)。具体实施方式为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。应理解，这些实施案例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规方法，未详细说明的技术属于常规技术。本发明采用的基因及cDNA克隆和基因重组方法没有特别限制，可以采用分子生物学领域常规的分子克隆技术。本发明主要的方法包括出发菌种筛选、cDNA克隆、DNA重组、原核表达和蛋白质纯化方案。实验l(1)选择合适的甲壳素脱乙酰酶来源菌株可采用常规的方法培养霉菌，选取处于对数生长期的总状毛霉菌丝体为材料，从中抽提总RNA;以总状毛霉(Mwcorracewoms)为材料，采用马铃薯葡萄糖液体培养基，在28。C、200rpm摇床震荡培养，收集菌丝体时间为20h，分离和收集菌丝体和培养液部分，对于收集得到的菌丝体，采用Trizol法(超绝UNIQ-10柱总RNA抽提试剂盒)抽提总RNA。以部分脱乙酰基的甲壳素晶体作为底物，测定甲壳素脱乙酰酶的酶活力，以选择该酶活性(或活力单位数)较高的出发菌株。本发明人经过研究发现，总状毛霉的培养液和菌丝体中均能检测到较高的对于甲壳素晶体底物的脱乙酰酶活性，因此，作为出发菌株是合适的。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注*数据来自对数生长末期，**数据来自稳定期末期。实验2(2)甲壳素脱乙酰酶全长cDNA克隆设计系列基因特异性简并引物，用逆转录-聚合酶链式反应和快速扩增cDNA末端的方法获得甲壳素脱乙酰酶基因的全长cDNA-Cda2;根据快速扩增cDNA末端方法，使用通用引物T17AP进行逆转录反应，用基因特异的简并引物(5，-GATGATGGMCCYAACTGYTC-3，，M=A/C，Y=C/T)和通用引物AP扩增基因的3'末端；根据得到的3'末端信息，设计基因特异性的引物(5'-TCGGCTACTGTTTTAGTCAGG-3')，合成5'端第一链cDNA并加尾；进而运用基因特异性引物(5'-ACCGTCTTGAATACCACGCAT-3，)禾口AP引物扩增得到5'末端cDNA;拼接5，和3'末端cDNA序列，从而得到总状毛霉甲壳素脱乙酰酶的全长cDNA序列-Cda2，该cDNA全长为1355bp，所述核苷酸序与SEQIDNO.2相同。正确地克隆得到甲壳素脱乙酰酶全长cDNA是构建表达载体的关键。本发明人经过研究，合成了基因特异性的简并性引物(位于基因中部)，采用分子生物学中常用的分子克隆技术，从对数生长期的总状毛霉RNA库中"钓"到了2个甲壳素脱乙酰酶全长cDNA，为后续工作奠定了必要的基础。总状毛霉来源甲壳素脱乙酰酶的全长cDNA之一(即Cda2)及其推测氨基酸序列。总状毛霉甲壳素脱乙酰酶全长cDNA-Cda2及其推测氨基酸序列，附图中67-1257bp为重组表达所用核心序列，所述核苷酸序与SEQIDNO.l相同。实验3(3)DNA重组可采用常规的DNA重组技术。但是，由于全长cDNA序列中包含有5'端和3'端非编码序列以及可能的信号肽序列，所以需要使用PCR技术将所需核心序列分离出来，供DNA重组的连接使用。用PCR的方法，从cDNA中截取基因表达核心序列片段，并在两端导入特定的限制性内切酶作用位点和保护碱基；使用5"m/和J^o/限制性内切酶所得的片段进行双酶切。所用PCR的引物正向引物CDA2國F5，-GCGGATCCCTTACTTCTGGCACAATTTTAC-3，反向引物CDA2-R5'-CCGCTCGAGTTAAGACAGTAAAGAACCAAG-3，PCR扩增体系(25^L):总DNA2^iL10Xbuffer2.5"正向引物CDA2-FluL反向引物CDA2-RluLdNTP1yL~酶0.5"ddH20_17"总体积25mLPCR反应程序94。C预变性4min;94。C变性30s，53。C复性45s，72。C延伸1.5min，35个循环;72""C延迟10min。从全长cDNA中切取的基因表达核心序列为1191bp,见SEQIDNO.l。如图1所示，表示将甲壳素脱乙酰酶核心序列插入表达载体pET28a后形成的重组质粒。pET28a-Cda2重组质粒(Kan表示卡那霉素抗性标记；Ori表示复制起点；lacl表示阻遏蛋白编码序列；Cda2表示甲壳素脱乙酰酶编码序列；florigin表示转录起始位点)。选用的表达载体为pET28a(质粒大小为5369bp)，用限制性内切酶5am/和^72o/双酶切切除的序列158-198bp之间的片段。将上述所得的片段，用DNA连接酶将其连接起来，获得甲壳素脱乙酰酶的重组表达质粒；所得的重组质粒总共为6526bp，重组表达区域包含6个组氨酸序列标签。实验4(4)原核表达可采用常规的大肠杆菌BL21系统和pET载体系列。最佳表达条件的确—、,:把重组表达质粒转化入缺陷性大肠杆菌宿主菌；所述缺陷型宿主菌为大肠杆菌BL21。已构建完成插入Cda2基因的pET28a质粒，转化入大肠杆菌BL21。以含卡那霉素的LB培养基作为培养和诱导表达的基本条件，先后对诱导时的温度(16°C、20°C、25°C、30°C、37°C及42°C)、诱导剂IPTG浓度(0.05、0.1、0.5和lmM)和诱导时间(1、2、3及4h)进行了优化研究。结果可知，当培养温度为37°C、IPTG浓度为O.lmM、诱导后表达lh时，根据SDS-PAGE结果扫描显示，表达的甲壳素脱乙酰酶已占细菌总蛋白的30%以上。实验5(5)蛋白质的纯化对于部分可溶的甲壳素脱乙酰酶，可采用常规的亲和层析分离。对于包涵体蛋白质，可采用常规的蛋白质变性-复性技术路线进行分离。在另一优选例中，本发明人对不同的蛋白质变性-复性方案进行了大量的实验，探索得出了利用液相色谱法对变性溶解蛋白质进行柱上复性的纯化蛋白质方案。包涵体重组蛋白质的纯化己构建完成插入Cda2基因的pET28a质粒，转化入大肠杆菌BL21。培养温度为37"C、IPTG浓度为O.lmM、诱导后表达时间2h后收集菌体细胞。将菌体细胞破碎、洗涤和分离，溶解后待上样，在AKTA快速蛋白液相色谱的Ni-Sepharose柱上用6-0M脲线性梯度进行重折叠(梯度体积使用30ml,流速为0.5ml/min)，用10-500mM咪唑线性梯度洗脱重折叠的目的蛋白(梯度体积为10ml，流速为lml/min)，得到电泳纯的甲壳素脱乙酰酶。结果显示，重组Cda2基因得到的蛋白质活力高于重组Cdal基因得到的蛋白质，证实在总状毛霉中所得到的两个甲壳素脱乙酰酶基因片段中，Cda2更适合于重组载体的构建。在国内首次在原核细胞大肠杆菌内表达了总状毛霉来源的甲壳素脱乙酰酶基因。与从生物体内提取、纯化得到酶的传统的方法相比，具有生长周期短、提取成本低、产品酶得率和产量较高等优点。本发明人经过条件优化，进一步提高了甲壳素脱乙酰酶基因在大肠杆菌内的表达效率。本发明针对变性的包涵体蛋白质，实现了液相色谱柱上复性。并与总状毛霉的另一甲壳素脱乙酰酶基因(Cdal)的重组蛋白作了比较。本方法与常规生化制备方法的比较，结果见表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。附本发明所涉及的DNA核苷酸序列如下SEQUENCELISTING<iio>上海海洋大学<120>甲壳素脱乙酰酶的生物制备方法<130>说明书序列表<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>1191<212>DNA<213>Mucorracemosus<400>cttsctttctggcacaatttt3CtSCCC333ttg3tCCC3aaaacgtgtctgtaccttcg603tt3CtC333cc3cssgc3tC33tCCCtCtg33g33tgtgttt3ttstsgccctgstacc120tcattagttg3t3tcgtctctgctgaatggcct3ctsgctggcaaaaagct3Ct3CC33C1803ttcsttgcc3tgt3t33Ctctsttgsttggsccssggct240CCC33t3ttCcsgtgcgtsctctgcttgctgacggttcttt333C3tgscsggct3ttct300tcctcttctgatcctgattgctggtggtctgctagtggttgt3ct33gccC3333tttCt360gscgcct3tacagatctggttcsgtgtgc3g33cctg3g3cttggggcttgacttacgat420g3tgg3ccc33ctgctctcstaacgctttttatg3ttacc480gctaccatgttttacattggttctsaitgtt3tcgsttggccttatggtgct3tgcgtggt540attcaagacggtcstC3C3ttgcttgccscscctggtctcsccctstgst600aagtgttggctgaattctatttctcttt33sctggccsct660ggttt33C3cctcgttsttggcgccctccttstggtg3tsttgatgaccgtgttcgttgg720attgctgctcaactgggtttgsctgctgtt3tgtggsscttggatacagacg3ttgggct780gctggcctgsCt3333C3gtagccg3tgtcC33sctgctt3tg3tC33ttC3ttC333tg840ggcaagaacggtsccttcgctggtsgtggt33C3ttgtCttggcgcstg3g3tC33t33t900gcctggccsttC3333tttgcctsgtsttc3sgctgctt3caagcaagtc960attastgtcgC33Cttgtttt33t3t3tCtC33CCtt3tttscstggttg1020gatgtattg3tgcttcttctsctgccgtt3gtggagttcc3tctgctcsg1080tctgcsgccssgtcascctctaccgscgccC33tcttccg3tgctsgcagC33tgCt3tt1140agttctstctttgctttgtttgcagt3gctcttggttctttactgtctta1191<210>2<211>1355<212〉DNA<213>Mucorracemosus<400>23tgC333tC3sg3C3ctggc3gcsttg3ttgctst3gctc333tsgcai3aitgasgtcgct60gctg3tcttsctttctggcsC33tttt3Ct3CCC333ttgcgtgtctgt3120ccttcgatt3CtC333CC3Caagcatcaatccctctgssg33tgtgtttsttst3gccct180g3t3cctC3ttsgttgststcgtctctgctg33tggcct3ctsgctggcs240sgctgssttcattgccatgt3t33CtCt3ttgattggacc30033ggctccc33t3ttccsgtgcgtsctctgcttgctgscggttcttt333catgacsggc360t3ttcttcctcttctgstcctgsttgctggtggtctgct3gtggttgtsc420atttctgacgcctatacagatctggttcsgtgtgcsgsscctg3g3cttggggcttgsct權tacgatgatggsccc33ctgCtCtC3t33Cgcttttt3tgsttsccttgs540ccatgtttt3C3ttggttct33tgtt3tcgattggccttatggtgctatg600cgtggtsttctcsc3ttgcttgccscscctggtctcsccct3tgst33ct660accaagaagtgttggctgaattC七3tttctctttai333gc720gccsctggttt33cscctcgttsttggcgccctccttstggtgatattgatgsccgtgtt780cgttggattgctgctcssctgggtttgsctgctgtt3tgtggaacttggatscsg3cg3t840tgggctgctggcctgsct3agatgtccaaactgcttatgatC33ttC3tt900C3satgggcssgsscggt3ccttcgctggtsgtggt33C3ttgtcttggcgcstgsg3tc960ccstgsgcctggccaittc3333tttgcctagtattcaagctgcttsc33g1020C33gtC3ttS3tgtcgcs3Cttgtttt3at3t3tctC33Ccttstttcga3g3tt3t3C31080tggttggatgtattgaatggaacagctgcttcttctactgccgtt3gtggagttccatct1140gctcagtctgcsgccssgtc33CCtCt3CCgacgcccaatcttccgstgctsgcsgcaat1200gctatttsgttctatctttgctttgtttgcsigtagctcttggttctttsctgtCtt33tt6L1260agtctcatcttttgstgstctCC3tttC3ttcaataaagctcttsttttt1320tatcctcgtttagacgtttc135权利要求1、一种甲壳素脱乙酰酶的生物制备方法，包括下列步骤(a)制备含基因序列如SEQIDNO.1所述甲壳素脱乙酰酶的重组表达载体；(b)制备含有步骤(a)所述重组表达载体的转化体；(c)表达和纯化甲壳素脱乙酰酶。2、根据权利要求1所述的生物制备方法，其特征在于所述步骤(a)如下①选取处于对数生长期的总状毛霉菌丝体为材料，从中抽提总RNA;②使用通用引物T17AP进行逆转录反应，用基因特异的简并引物5，-GATGATGGMCCYAACTGYTC-3，(M=A/C，Y=C/T)和通用引物AP扩增基因的3'末端；根据得到的3'末端信息，设计基因特异性的引物5，-TCGGCTACTGTTTTAGTCAGG-3，，合成5'端第一链cDNA并加尾；进而运用基因特异性引物5'-ACCGTCTTGAATACCACGCAT-3'和AP引物扩增得到5'末端cDNA;拼接5'和3'末端cDNA序列，从而得到总状毛霉甲壳素脱乙酰酶的全长cDNA;③采用PCR的引物为正向5，-GCGGATCCCTTACTTCTGGCACAATTTTAC匿3，，反向5，-CCGCTCGAGTTAAGACAGTAAAGAACCAAG-3，，以步骤②所述全长cDNA为模板，进行PCR反应，收集含所述基因序列如SEQIDNO.l的DNA片段；④将步骤③所得的DNA片段和表达载体进行双酶切作用，然后用DNA连接酶连接，获得甲壳素脱乙酰酶的重组表达载体。3、根据权利要求2所述的生物制备方法，其特征在于所述内切酶为B"m4、根据权利要求2所述的生物制备方法，其特征在于所述重组表达载体为pET28a。5、根据权利要求1所述的生物制备方法，其特征在于所述重组表达载体的表达区域包含6个组氨酸序列标签。6、根据权利要求1所述的生物制备方法，其特征在于所述转化体为大肠杆菌BL21。全文摘要本发明公开了一种总状毛霉来源甲壳素脱乙酰酶的生物制备方法，包括下列步骤(a)制备含基因序列如SEQIDNO.1所述甲壳素脱乙酰酶的重组表达载体；(b)制备含有步骤(a)所述重组表达载体的转化体；(c)表达和纯化甲壳素脱乙酰酶。本发明设计基因特异性简并引物，采用逆转录-聚合酶链式反应和快速扩增cDNA片段末端技术，结合重组DNA的方法，利用已有的原核表达载体，得到了能够产生甲壳素脱乙酰酶的大肠杆菌菌株。为生物制备甲壳素脱乙酰酶提供了可靠的来源，具有生产周期短、提取成本低、产品酶得率和产量较高等优点。文档编号C12N15/70GK101659960SQ200910054879公开日2010年3月3日申请日期2009年7月16日优先权日2009年7月16日发明者蒋霞云,邹曙明申请人:上海海洋大学