麻疯树法呢基焦磷酸合酶蛋白编码序列及其在植物中的应用的制作方法

专利名称：：麻疯树法呢基焦磷酸合酶蛋白编码序列及其在植物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属分子生物学、基因工程
技术领域：
。具体地，本发明涉及一种在麻疯树中表达的jc-fps蛋白(麻疯树法呢基焦磷酸合酶蛋白，Jatrophacurcasfarnesylpyrophosphatesynthase,JCFPS)及其核酸序列。
背景技术：
：麻疯树又名小桐子，大戟科植物，在我国分布于四川、云南、广西等地。近年来，麻疯树作为一种新型的生物能源被广泛开发，除此之外，麻疯树还被用于制药、生物农药、荒地治理、制药、饲料、肥料等多个领域。麻疯树中含有多种毒素成分，毒性较强的成分为麻疯树毒蛋白、佛波醇酯。佛波醇酯(12-脱氧-16-羟基佛波醇，12-deoxy-16-hydroxyphorbol)是一种二萜类化合物，主要存在于麻疯树种子、树皮、叶、根和乳汁中。佛波醇酯有剧毒，是一种肿瘤诱发剂。麻疯树种子中除含油率高之外，其籽实粕中的相蛋白质含量高达60%，氨基酸组成平衡，是一种极为优质的植物蛋白来源，可以作为动物饲料使用。但是长期以来由于佛波醇酯等麻疯树毒素的存在，麻疯树饼粕不能被直接使用，只能丢弃或作为肥料还田，这使得这一对家畜有极大的潜在利用价值的资源被大大浪费。另外，佛波醇酯等毒素在麻疯树种子油中会有一定的残留，也在一定程度上限制了生物柴油的应用。基因工程技术的飞速发展为利用生物技术降低麻疯树毒素，提高麻疯树的利用开辟了一条新的思路，通过反义RNA或RNAi技术可以部分降低麻疯树佛波醇酯合成途径的关键基因表达，从而获得再生植株，得到麻疯树的低毒优质品系。在麻疯树异戊二烯代谢途径中，法尼基焦磷酸合酶催化异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)连续缩合反应，形成法呢基焦磷酸(FPP)，是该途径的一个关键酶。FPP是植物体内留体、皂苷、倍半萜等萜类衍生物质的前体，也是麻疯树中佛波醇酯的合成前体。对于通过基因操作降低佛波醇酯含量有重要意义。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的编码麻疯树法呢基焦磷酸合酶的cDNA序列。本发明中有关麻疯树法呢基焦磷酸合酶基因的克隆以及功能研究受到国家自然科学基金(30771745)资助。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种麻疯树JcFPS蛋白编码序列。使其包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，被所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织，所获得转基因植物将具有降低的佛波醇酯含量。本发明通过以下技术方案实现，本发明所分离出的DNA分子包括编码具有麻疯树JcFPS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQIDNO.1中从核苷酸第221-1246位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55°C条件下与SEQIDNO.1中从核苷酸第221-1246位的核苷酸序列杂交。所述的编码具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的多肽。所述的序列具有SEQIDNO.1中从核苷酸第104-1246位的核苷酸序列。本发明分离出的麻疯树JcFPS蛋白多肽，它包括具有SEQIDNO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。所述的蛋白多肽是具有SEQIDN0.2序列的多肽。本发明所提供的载体DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。该宿主细胞包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。在本发明中，“分离的”、“纯化的，，DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本发明中，术语“麻疯树JcFPS蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有麻疯树JcFPS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.1中第104-1246位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDNO.1序列的编码框第104-1246位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQIDNO.1中第221-1246位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQIDN0.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQIDNO.1中从核苷酸第221-1246位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQIDNO.1中从核苷酸第221-1246位的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的麻疯树JcFPS蛋白相同功能的蛋白的SEQIDNO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本发明中，术语“麻疯树JcFPS蛋白或多肽”指具有麻疯树JcFPS蛋白活性的SEQIDNO.1序列的多肽。该术语还包括具有与天然麻疯树JcFPS蛋白相同功能的SEQIDN0.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括麻疯树JcFPS蛋白的活性片段和活性衍生物。本发明的麻疯树JcFPS蛋白多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与麻疯树JcFPS蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用麻疯树JcFPS蛋白多肽的血清获得的多肽或蛋白。在本发明中，“麻疯树JcFPS蛋白保守性变异多肽”指与SEQIDNO.1的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2为本发明的麻疯树JcFPS与巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)HbFPS的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。表287%identityin1289ntoverlapQuery205TCTCCTTTTTGAAGCTATGGCGGATCTGAAATCAACATTCTTGGAGGTCTATTCTGTTCT264IIIMillIllllllllllllllNilMillMillIIISbjct47TCTCC-GTTTGMTCCATGGCGGATCTGMGTCMCTTTCTTGMGGTCTACTCTGTCCT105Query265CAAGAAGGAGCTACTTCAAGACCCGGCTTTCGAATGGACACCAGATTCTCGTGAATGGGT324miiiiiiiihiιIiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiillmillSbjct106CAAGCAGGAGCTCCTTGAGGATCCGGCTTTCGAATGGACACCAGATTCCCGTCAATGGGT165Query325CGAAAGGATGCTGGACTACAATGTGCCTGGAGGGAAGCTGAATAGGGGGCTCTCTGTGAT384IlIIIllllllllllllllllllllllllllllllllllllllIIISbjct166TGAGCGGATGTTGGACTACAATGTGCCTGGAGGGAAGCTGAATAGGGGGCTTTCTGTAAT225Query385TGACAGCTACAAATTGTTGAAAGATGGACAGGAATTAACAGAAGAAGAAATCTTTCTCGC444IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIlllllllllllllllllllllIlllllSbjct226TGACAGCTACAAATTGTTGAAAGAAGGACAGGAATTAACAGAAGAAGAGATCTTTCTTGC285Query445AAGCGCTCTTGGTTGGTGTATTGAATGGCTCCAAGCCTATTTCCTTGTCCTTGATGATAT504IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIlllllllllIIIIlllllSbjct286AAGTGCTCTTGGTTGGTGTATTGAATGGCTTCAAGCCTATTTTCTTGTACTTGATGACAT345Query505TATGGATAGCTCTCATACACGACGTGGTC-GACCATGTTGGTTTATGGTGCCCMGGTTG563lllllllllllllllllllllllllllIIlIlIIIIIIIllllllllllllSbjct346TATGGATAGCTCTCATACACGACGTGGTCAG-CCTTGCTGGTTTAGGGTGCCCMGGTTG404Query564GTCTTATTGCAGCAAATGATGGGATTTTGCTTCGAAATCACATTCCCAGGATTCTTAAAA623111111111111111111111111111111111111111111111111111111111Sbjct405GTCTGATTGCAGCAAATGATGGGATTTTGCTTCGCAATCACATTCCCAGGATTCTTAAAA464Query624AGCACTTCCGAGGGAAAGCATACTATGTAGATCTTCTAGATTTATTTAATGAGGTGGAGT683111111111111111111111111111111111111111111111111111111111Sbjct465AGCACTTCCGAGGGAAGGCATACTATGTAGATCTTCTAGATTTGTTTAATGAGGTGGAGT524Query684TTCAAACAGCCTCAGGACAGATGATAGATCTGATTACAACACTTGAAGGAGAAAAGGATT743111111111111111111111111111111111111111111111111111111111Sbjct525TTCAAACAGCCTCAGGACAGATGATAGATCTAATTACAACACTTGAAGAAGAAAAGGATT584Query744TATCGAAGTACAATTTATCGCTTCACCGGCGAATTGTTCAGTACAAAACTGCCTACTACT803IlllIlIlllIIIIlIlIlllllllllllllllllllllllllllllllllSbjct585TATCCAAATACACTTTGTCACTCCACCGGAGAATTGTTCAGTACAAAACTGCCTACTACT644Query804CATTTTACCTTCCTGTTGCTTGTGCATTGCTCATGGCTGGTGAGAATCTGGACAGCCATA863llllllllllllllllllllllllllllllllIlIllllllllllllllIIISbjct645CATTTTACCTTCCTGTTGCTTGTGCATTGCTCATAGCGGGCGAGAATCTGGACAATCATA704Query864TTGATGTACA-GMTATTCTTGTCCAGATGGGMTCTACTTCCMGTACAGGATGATTAT922IIIIlllιIlIlllllllllllllllllllllllllllllllllllllllSbjct705TTGTTGTAAAAGAC-ATTCTTGTTCAGATGGGMTCTACTTCCMGTACAGGATGATTAT763Query923TTGGATTGCTTTGGTGATCCCAAGACAATTGGCAAGATAGGGACAGATATTGAAGATTTT982lllllllllllllllllllllllllllllIlllllIlllllIIIIIIISbjct764TTGGATTGCTTTGGTGATCCCGAGACAATTGGTAAGATAGGAACAGATATAGAAGATTTT823Query983AAGTGCTCTTGGTTGGTCGTGAAGGCTTTGGAGCGATGCAATGAAGAACAAAAGAAAGT-1041IIIIlllllllllllllllllllIlIllllllllllllllMillSbjct824AAGTGTTCATGGTTGGTCGTGAAGGCTTTAGAACTTTGCAATGAAGAACAAAGGAAAGTG883Query1042TCTACATGAGCATTATGGGAAACCTGACCCAGCCAGTGT-GTCAAAGGTGAAAGTCCTCT1100IIlIIIIIIIIIIIIIIllllllllllllllIllllllllIIISbjct884T-TATATGAGCACTATGGGAAAGCTGACCCAGCCAGTGTAG-CMAGGTGMGGTCCTTT941Query1101ATGATGAGCTGGACCTTCAGGGGGTATTTATGGAGTATGAGAACCAAAGCTATGATAAAC1160IlllllllllιllllllllllllllllllllllllllllllllllIIIISbjct942ATAATGAGCTGAAGCTTCAGGGGGTATTTACGGAGTATGAGAATGAAAGCTATAAGAAAC1001Query1161TAGTMCCTCCATTGAGGCTCACCCTAGCMGGCAGTGCMGCAGTGTTGMGTC-TTTC1219llllllllIIIIIIlllllllIllllllllllllllllllIlSbjct1002TAGTAACCTCTATTGAAGCTCATCCTAGCAAGCCGGTGCAAGCAGTGTTGAAGTCCTTT-1060Query1220CTTG-CCAAAATTTACAAGAGACAGAAATAAAAGAAAAGAAAATAAGAATATGCAGA-AG1277IIIllllllllllllllllllllllllllIIlIIIIIIIIISbjct1061-TTGGCCAAAATTTACMGAGACAGAAATAMA-AGM-AAAATGGG--TATCCAGATA-1114Query1278CACAGTCMTGATTGGATGATGCCGMTMTGC-GATTTTA-TTTGGGMTTGTATCATT1335IimiIiiiiiiiiιιiiiiiiimiMilliiiiiiiiSbjct1115CATGGACAAAGACTGGATGACGCTGMTMTGCAGGTTT-AGTTTGG-AGTTGTATCTTT1172Query1336MTTTCCTMTT-MGGAT-G---ATT--GCA---A-CTCTTTGTTGMCATTTTGATAT1384IllllllllIIIIIIIIlIIIIIllllllllllllllSbjct1173AGTTTCCTMTTGMG-ATTGCTTATTCTGCTTGTAGCACATGGTTAAACATTTTGATAT1231Query1385TGGTAG-TCTTTGCTTATTT-GAAATTTGATTGMTGATTCTCATCTTTMTMGATTTT1442IINIlIlIlIIIIIIIlIIIIlIlIlllllllllllllllSbjct1232TTGMGGTCCTTMTTGTTTTGGMTT-GMTGAGTGGTTTTCATCATTMTMGATTT-1289Query1443AATCCATTTGA-Taaaaaaaaaaaaaaaa1470IlMillIlllllllllllllllSbjct1290AAGCCATTTTAATCAAAAAAAAAAAAAAA1318Query麻疯树JcFPS的核苷酸序列Sbjct巴西橡胶树HbFPS的核酸序列(AB294712)表3为本发明的麻疯树JcFPS蛋白的氨基酸序列与巴西橡胶树HbFPS的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。表393%identityin342aaoverlap,97%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麻疯树JcFPS氨基酸序列Sbjct巴西橡胶树HbFPS氨基酸序列(GenBankAccessionNo.AAM98379)本发明还包括麻疯树JcFPS蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然法呢基焦磷酸合酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。所述的修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化的氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的麻疯树JcFPS蛋白多肽时，可以将麻疯树JcFPS蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成麻疯树JcFPS蛋白表达载体。如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、麻疯树细胞和其它植物细胞。还可用Northern印迹法技术分析麻疯树JcFPS蛋白基因产物的表达，即分析麻疯树jC-fpS蛋白的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有麻疯树JcFPS蛋白核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码麻疯树JcFPS蛋白的核酸分子。本发明涉及检测样品中是否存在麻疯树JcFPS蛋白核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于麻疯树JcFPS蛋白核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。此外，根据本发明的麻疯树JcFPS蛋白核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选麻疯树JcFPS蛋白同源基因或同源蛋白。为了得到与麻疯树JcFPS蛋白基因相关的麻疯树cDNAs的点阵，本发明可以用DNA探针筛选麻疯树cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用32P对麻疯树JcFPS蛋白的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自麻疯树的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，PaloAlto。这种筛选方法可以识别与麻疯树JcFPS蛋白的基因家族的核苷酸序列。本发明的麻疯树JcFPS蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关序列。当序列较长时，常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变弓I入本发明的蛋白序列中。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，1969Solid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo.,SanFrancisco；MerrifieldJ.1963J.AmChem.Soc85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(FosterCity,CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。利用本发明的麻疯树JcFPS蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与麻疯树JcFPS蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。本发明的麻疯树JcFPS蛋白基因可通过基因工程技术用来降低麻疯树中佛波醇酯或其前体的含量，而佛波醇酯为一种植物毒素。因而本发明具有很大的应用前景。图1是麻疯树FPS蛋白的结构域分析图。图2是麻疯树FPS蛋白的疏水性分析结果。图3是麻疯树FPS蛋白的转运肽及氨基酸跨膜分析结果。其中显示，成熟FPS不具有跨膜区，为非跨膜蛋白。具体实施例方式下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(NewYork=ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1麻疯树JcFPS蛋白基因的克隆1.组织分离(isolation)麻疯树种子来源于四川省攀枝花地区，麻疯树种子采集后，放在实验室保存。2.RNA的分离(RNAisolation)将麻疯树种子的种皮剥掉，取出种仁，用研钵研碎，加入液氮后，研磨成粉后，取IOOmg移至1.5mLEP管中，抽提总RNA(两步裂解法)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。3.基因的全长克隆(CloningofFull-lengthcDNA)根据一些植物FPS的氨基酸保守序列，设计兼并引物，利用同源性基因克隆原理，采用SMARTTMRACEcDNA扩增方法(Clonetech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分四个阶段进行(1)核心序列的克隆PCR(JcFPSF+JcFPSR)得到JcFPS-I(434bp)，回收，连接到pMD_18T载体上，用M13F或M13R作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(GeneBank+EMBL)，知其核苷酸序列及编码蛋白与已知的木本植物如巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)等的FPS基因的同源性很高，故初步认为它是一个FPS基因。(2)3，-RACE根据核心序列的扩增的结果，设计两个正向特异引物(JcFPSFl和JcFPSF2)。采用二次PCR扩增方法进行。第一次PCR(JcFPSFl+AP)得到PCR产物，稀释100倍后，用其做模板，进行第二次PCR(JcFPSF2+AP)，得到JcFPS_3(657bp)，回收，连接，测序过程同(1))。(3)5，-RACE根据核心序列的扩增的结果，设计两个反向特异引物(JcFPSRl和JcFPSR2)。采用二次PCR扩增方法进行。第一次PCR(JcFPSRl+UPM)得到PCR产物，稀释100倍后，用其做模板，进行第二次PCR(JcFPSR2+NUP)，得到JcFPS_3(700bp)，回收，连接，测序(过程同(1))。(4)编码序列的克隆将核心序列、5’RACE与3’RACE测序结果序列比对并进行拼接，得到全长片段序列信息。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计寡核苷酸序列JcFPSFI5‘-ATGGCGGATCTGAAATCAACATTCTTG-3‘(SEQIDNO.3)为正向引物，寡核苷酸序列JcFPSRI5‘-TTATTTCTGTCTCTTGTAAATTTTGGC-3‘(SEQIDNO.4)为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，PCR条件为94°C5分钟，随之以94°C1分钟、58°C1分钟和72°C2分钟进行35个循环，最后以72°C延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1029bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQIDNO.3和SEQIDN0.4所示的序列。实施例2麻疯树JcFPS蛋白基因的序列信息与同源性分析本发明新的麻疯树JcFPS蛋白全长cDNA的长度为1029bp，详细序列见SEQIDN0.1，其中开放读框位于221-1246位核苷酸。根据全长cDNA推导出麻疯树JcFPS蛋白的氨基酸序列，共381个氨基酸残基，分子量43784.45，pl为5.54。详细序列见SEQIDN0.2。将麻疯树JcFPS蛋白的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB禾口Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与巴西橡胶树HbFPS基因(AB294712)在核苷酸水平上具有87%的同源性(附表2)；在氨基酸水平上,它与巴西橡胶树HbFPS(GenBankAccessionNo.AAM98379)有93%的相同性和97%的相似性(见表3)。由此可见，麻疯树JcFPS蛋白与巴西橡胶树HbFPS无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，故可以认为麻疯树JcFPS蛋白在功能上也相似。实施例3麻疯树FPS蛋白的结构特征分析1.麻疯树FPS蛋白的结构域分析将麻疯树FPS蛋白的氨基酸序列在NCBI数据库(网址为http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中检索结构域，结果显示在氨基酸序列中，存在异戊烯基焦磷酸合成酶(Trans-IsoprenylDiphosphateSynthases,TransIPPS)的催化位点(即序列表中SEQID.1自氨基端(N端)第69-303位氨基酸残基。2.麻疯树FPS蛋白的疏水性分析对转运肽剪切后的成熟FPS进行分析，就整体而言，亲水性氨基酸均勻分布在整个肽链中，整个多肽链表现为亲水性，没有明显的疏水区域。本发明的疏水性分析图是基于Kyte和Doolittle报道的氨基酸的疏水值而建立的。3.麻疯树FPS蛋白的转运肽及氨基酸跨膜分析通过TMHMM预测发现成熟FPS不具有跨膜区，为非跨膜蛋白。FPS整条链都处于膜夕卜，不具有跨膜结构域。TargetP1.IServer的分析表明，叶绿体转运肽、线粒体目标肽以及分泌途径信号肽的分值都较低，无氨基酸残基分裂位点，认为不具有转运肽。两者结合分析认为，FPS成熟后不进入任何亚细胞器，而是留在细胞质中。实施例4麻疯树JcFPS蛋白在麻疯树中进行RNA干扰含目的基因(麻疯树JcFPS蛋白基因)的RNA干扰载体的构建。根据麻疯树JcFPS蛋白的全长序列(SEQIDNO.1)(属于正义片段)，设计一对引物，PCR扩增后得到互补的反义片段，将正义片断和反义片断分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)并连上载体pHANNIBAL形成茎环结构，然后通过双酶切将茎环结构的片断连入pCAMBIA1301载体，构建成RNA干扰载体，再将其转入农杆菌中，利用农杆菌转化技术或基因枪技术转化麻疯树。利用农杆菌转化技术转化麻疯树1.用无菌牙签挑取YEB选择平板上的阳性菌落，接种于2mlYEB液体(Sm+，Kan+)，28°C，200rpm振荡培养24-36小时；2.室温下4，OOOg离心IOmin；3.弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的0D_=0.5左右；4.取生长一个月左右的麻疯树的无菌外植体，将其剪成约1平方厘米见方的小片或小段；5.将步骤(4)的小片或小段放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；6.把经浸染的小片或小段放于MS培养基上，28°C暗培养48小时；7.将小片或小段转到愈伤培养基(MS+6-BA1.Omg/L+NAA0.Img/L+Kan50mg/L+cb250mg/L)上，25_28°C光照下培养，7_15天可见愈伤组织的形成；8.约40天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan25mg/L)上进行生根培养，10天左右生根；9.等根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。利用Northernblotting检测JcFPS蛋白在转基因麻疯树植株中的表达1.RNA的提取待转基因麻疯树叶片长到2-3片叶时抽取麻疯树叶的RNA。以正常生长的植株作为对照(条件同上)，利用TRIzoI试剂盒(GIBCOBRL,USA)提取并参考《分子克隆》有关RNA的制备章节(Sambrook等，1989)。2.RNA的定量参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度计测OD26tl；RNA含量计算=IOD260=40yg/mlo3总RNA琼脂糖凝胶电泳分离①取6ml25(倍)电泳缓冲液，加入117ml无菌水，混勻。②称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液中，于微波炉里加热融化，转入55°C水浴中。③于通风橱中取26.8ml甲醛，加入到55°C的凝胶溶液中，混勻。④迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。⑤将提取的RNA(20μg)溶解于RNA变性溶液中，在65°C下加热10分钟，然后立即放在冰上。⑥在样品中加入2ulIOX上样缓冲液，混勻。⑦在电泳液未盖过胶的条件下点样，5V/cm电压电泳5小时左右。4.RNA尼龙膜上转移①转移之前，将尼龙膜用IOXSSC浸泡。②将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2XSSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。③滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。④转移后，将膜于80°C烘烤2小时。5.膜上杂交信号的检出①将膜浸在5XDendart，s,0.1%SDS,0.lmg/ml鲑鱼精DNA，65°C下预杂交2小时。②将用GeneImagesContentsCDP-Starlabellingmodule标记的探针在沸水中变性5分钟，直接加入(1)的杂交液中，于65°C杂交16-24小时。③取出膜，置于洗膜液I(1XSSC，1%SDS)中，于65°C漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液11(0.1XSSC,1%SDS)中于65°C漂洗3次，每次15分钟。④用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照RocheDIGlabeled试剂盒说明书)。Northern杂交表明；转基因麻疯树的jc-FPS转录水平比未转基因的对照材料的表达水平明显低得多。本发明涉及的序列及记号分列如下<110>复旦大学<120>麻疯树法呢基焦磷酸合酶蛋白编码序列及其在植物中的应用<160>2<170>PatentInversion3.1<210>1<211>1471<212>mRNA<213>(JatrophacarcasL.)<220><221>CDS<222>(221)··(1246)<223><400>1AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGGGCGCAAGCGAAAGACAGTGACTCCAAGTCTCCAACGCCAAGAACAGGAATATTACATAGTCAACCAAAAGCTGTGGTCTCTCAGTATAAAATTGCCACTTTGCAACATCAATCTCTCCTCACTACTGCCCTCCCTTTTCACTGTAGCTCTCTTTCATTCCCTTGGTCTCTGAGTCTCCTTTTTGAAGCTATGGCGGATCTGAAAMetAlaAspLeuLys15TCAACATTCTTGGAGGTCTATTCTGTTCTCAAGAAGGAGCTACTTCAASerThrPheLeuGluValTyrSerValLeuLysLysGluLeuLeuGln101520GACCCGGCTTTCGAATGGACACCAGATTCTCGTGAATGGGTCGAAAGGAspProAlaPheGluTrpThrProAspSerArgGluTrpValGluArg253035ATGCTGGACTACAATGTGCCTGGAGGGAAGCTGAATAGGGGGCTCTCTMetLeuAspTyrAsnValProGlyGlyLysLeuAsnArgGlyLeuSer404550GTGATTGACAGCTACAAATTGTTGAAAGATGGACAGGAATTAACAGAAVallieAspSerTyrLysLeuLeuLysAspGlyGlnGluLeuThrGlu556065GAAGAAATCTTTCTCGCAAGCGCTCTTGGTTGGTGTATTGAATGGCTCGluGluliePheLeuAlaSerAlaLeuGlyTrpCyslieGluTrpLeu70758085CAAGCCTATTTCCTTGTCCTTGATGATATTATGGATAGCTCTCATACA7GlnAlaTyrPheLeuValLeuAspAsplieMetAspSerSerHisThr9095100CGACGTGGTCAACCATGTTGGTTTATGGTGCCCAAGGTTGGTCTTATTArgArgGlyGlnProCysTrpPheMetValProLysValGlyLeulie105110115GCAGCAAATGATGGGATTTTGCTTCGAAATCACATTCCCAGGATTCTTAlaAlaAsnAspGlylieLeuLeuArgAsnHislieProArglieLeu120125130AAAAAGCACTTCCGAGGGAAAGCATACTATGTAGATCTTCTCGATTTALysLysHisPheArgGlyLysAlaTyrTyrValAspLeuLeuAspLeu135140145TTTAATGAGGTGGAGTTTCAAACAGCCTCAGGACAGATGATAGATCTGPheAsnGluValGluPheGlnThrAlaSerGlyGlnMetlieAspLeu150155160165ATTACAACACTTGAAGGAGAAAAGGATTTATCGAAGTACAATTTATCGlieThrThrLeuGluGlyGluLysAspLeuSerLysTyrAsnLeuSer170175180CTTCACCGGCGAATTGTTCAGTACAAAACTGCCTACTACTCATTTTACLeuHisArgArglieValGlnTyrLysThrAlaTyrTyrSerPheTyr185190195CTTCCTGTTGCTTGTGCATTGCTCATGGCTGGTGAGAATCTGGACAGCLeuProValAlaCysAlaLeuLeuMetAlaGlyGluAsnLeuAspSer200205210CATATTGATGTACAGAATATTCTTGTCCAGATGGGAATCTACTTCCAAHislieAspValGlnAsnlieLeuValGlnMetGlylieTyrPheGln215220225GTACAGGATGATTATTTGGATTGCTTTGGTGATCCCAAGACAATTGGCValGlnAspAspTyrLeuAspCysPheGlyAspProLysThrlieGly230235240245AAGATAGGGACAGATATTGAAGATTTTAAGTGCTCTTGGTTGGTCGTGLyslieGlyThrAsplieGluAspPheLysCysSerTrpLeuValVal250255260AAGGCTTTGGAGCGATGCAATGAAGAGCAAAAGAAAGTTCTACATGAGLysAlaLeuGluArgCysAsnGluGluGlnLysLysValLeuHisGlu265270275CATTATGGGAAACCTGACCCAGCCAGTGTGTCAAAGGTGAAAGTCCTCHisTyrGlyLysProAspProAlaSerValSerLysValLysValLeu280285290TATGATGAGCTGGACCTTCAGGGGGTATTTATGGAGTATGAGAACCAATyrAspGluLeuAspLeuGlnGlyValPheMetGluTyrGluAsnGln295300305AGCTATGATAAACTAGTAACCTCCATTGAGGCTCACCCTAGCAAGGCASerTyrAspLysLeuValThrSerlieGluAlaHisProSerLysAla310315320325GTGCAAGCAGTGTTGAAGTCTTTCCTTGCCAAAATTTACAAGAGACAGValGlnAlaValLeuLysSerPheLeuAlaLyslieTyrLysArgGln330335340AAATAAAAGAAAAGAAAATAAGAATATGCAGAAGCACAGTCAATGATTGGATGATGCCLysGAATAATGCGATTTTATTTGGGAATTGTATCATTAATTTCCTAATTAAGGATGATTGCAACTCTTTGTTGAACATTTTGATATTGGTAGTCTTTGCTTATTTGAAATTTGATTGAATGATTCTCATCTTTAATAAGATTTTAATCCATTTGATAAAAAAAAAAAAAAAAA<210>2<211>342<212>PRT<213>(JatrophacarcasL.)<400>2MetAlaAspLeuLysSerThrPheLeuGluValTyrSerValLeuLys151015LysGluLeuLeuGlnAspProAlaPheGluTrpThrProAspSerArg202530GluTrpValGluArgMetLeuAspTyrAsnValProGlyGlyLysLeu354045AsnArgGlyLeuSerVallieAspSerTyrLysLeuLeuLysAspGly505560GlnGluLeuThrGluGluGluliePheLeuAlaSerAlaLeuGlyTrp65707580CyslieGluTrpLeuGlnAlaTyrPheLeuValLeuAspAsplieMet859095AspSerSerHisThrArgArgGlyGlnProCysTrpPheMetValPro100105110LysValGlyLeulieAlaAlaAsnAspGlylieLeuLeuArgAsnHis115120125lieProArglieLeuLysLysHisPheArgGlyLysAlaTyrTyrVal130135140AspLeuLeuAspLeuPheAsnGluValGluPheGlnThrAlaSerGly145150155160GlnMetlieAspLeulieThrThrLeuGluGlyGluLysAspLeuSer165170175LysTyrAsnLeuSerLeuHisArgArglieValGlnTyrLysThrAla180185190TyrTyrSerPheTyrLeuProValAlaCysAlaLeuLeuMetAlaGly195200205GluAsnLeuAspSerHislieAspValGlnAsnlieLeuValGlnMet210215220GlylieTyrPheGlnValGlnAspAspTyrLeuAspCysPheGlyAsp225230235240ProLysThrlieGlyLyslieGlyThrAsplieGluAspPheLysCys245250255SerTrpLeuValValLysAlaLeuGluArgCysAsnGluGluGlnLys260265270LysValLeuHisGluHisTyrGlyLysProAspProAlaSerValSer275280285LysValLysValLeuTyrAspGluLeuAspLeuGlnGlyValPheMet290295300GluTyrGluAsnGlnSerTyrAspLysLeuValThrSerlieGluAla305310315320HisProSerLysAlaValGinAlaValLeuLysSerPheLeuAlaLys325330335lieTyrLysArgGinLys340<210>3<211>27<212>DNA<213>(JartrophacurcasL.)<400>3ATGGCGGATCTGAAATCAACATTCTTG<210>4<211>27<212>DNA<213>(JatrophacurcasL.)<400>4TTATTTCTGTCTCTTGTAAATTTTGGC权利要求一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有麻疯树JcFPS蛋白质活性多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQIDN0.1中从核苷酸第221-1246位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQIDNO.1中从核苷酸第221-1246位的核苷酸序列杂交。2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的多肽。3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQIDNO.1中从核苷酸第221-1246位的核苷酸序列。4.一种分离出的麻疯树JcFPS蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQIDN0.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQIDN0.2序列的多肽。6.一种载体，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA。7.如权利要求6所述的载体，其特征在于用于构建所述植物表达载体的出发载体为p3301-BI121、pB1121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301或pCAMBIA1300。8.—种权利要求6所述载体转化的宿主细胞，其特征在于它是原核或真核细胞。9.一种产生具有麻疯树JcFPS蛋白质活性的多肽的方法，特征在于其包括如下步骤(1)将编码具有麻疯树JcFPS蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成麻疯树JcFPS蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQIDNO.1中从核苷酸第221-1246位的核苷酸序列有至少70%的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成麻疯树JcFPS蛋白的重组细胞；(3)在适合表达麻疯树JcFPS蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)分离出具有麻疯树JcFPS蛋白活性的基本纯的多肽。10.一种利用转基因技术将编码具有麻疯树JcFPS蛋白活性多肽的核苷酸序列转化入植物以提高植物中萜类物质的方法，其特征在于，通过如下步骤(1)将编码具有麻疯树JcFPS蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于植物表达调控序列，形成含麻疯树JcFPS蛋白的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQIDNO.1中从核苷酸第221-1246位的核苷酸序列有至少70%的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入植物宿主细胞；(3)通过筛选如抗生素筛选，获得转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。11.按权利要求10所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的植物宿主为水稻、小麦、大豆、玉米、烟草、油菜、高粱、棉花、苜蓿、麻疯树或拟南芥。12.—种与权利要求7所述的麻疯树JcFPS蛋白多肽多肤特异性结合的抗体，其特征在于，它包括多克隆抗体和单克隆抗体。13.一种核酸分子，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。14.一种检测样品中麻疯树JcFPS核苷酸序列的方法，其特征在于，它包括下述步骤；用权利要求10所述探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生结合；所述的样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于麻疯树JcFPS核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间，引物长度为15-50个核苷酸。全文摘要本发明属分子生物学、基因工程
技术领域：
。提供了一种编码麻疯树法呢基焦磷酸合酶的cDNA编码序列，法尼基焦磷酸合酶催化异戊烯基焦磷酸和二甲基丙烯焦磷酸连续缩合反应，形成法呢基焦磷酸，是麻疯树异戊二烯代谢途径的关键酶，有助于降低麻疯树中佛波醇酯及其前提的含量。利用本发明的麻疯树所述蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与麻疯树所述蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。本发明具有很大的应用前景。文档编号C12N9/10GK101798579SQ20091005481公开日2010年8月11日申请日期2009年7月15日优先权日2009年7月15日发明者侯嵘,周选围,林娟申请人:复旦大学