专利名称：α-淀粉酶,其编码基因及其表达的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，更具体地，本发明涉及α-淀粉酶，其编码基因，含有 该基因的重组质粒和菌株，以及表达方法。
背景技术：
淀粉(Starch)是一种碳水化合物，几乎完全是以α-D-葡萄糖为单位聚合而 成的，链平均长度为500-1000个葡萄糖残基。淀粉中能溶于热水的一部分叫直链淀粉 (Amylase)，不能溶解的叫支链淀粉(Amylopectin)，曾称为α -直链淀粉或红直链淀粉 (Erythroamylose)，这两种成分是淀粉颗粒的主要成分，含量可以达到75% -80%。直链淀粉分子量在10_2000kD之间，以α _1，4糖苷键型缩合而成，卷曲成螺旋形， 遇碘呈紫蓝色，每个糖链含有几千个葡萄糖残基，直链淀粉在62o-68onm呈最大的光吸收。 支链淀粉分子量在50-400000kD之间，主要以α-1，4糖苷键型缩合而成，少量由α_1，6糖 苷键型缩合而成，平均每24个有约1个末端葡萄糖残基的α -1，6支链出现，支链淀粉分子 分支很多，在热水中膨润成淀粉糊，遇碘呈紫红色，在530-550nm呈最大光吸收。淀粉几乎存在于所有的绿色植物多数组织中，是植物营养物质的一种储存形式， 在显微镜下以颗粒形状存在于植物有机体中。就目前的情况来看能够作为淀粉原料的作物 主要是玉米，其次是薯类、稻谷和小麦，2004年我国粮食总产量达到46947. 2万吨，而这四 种粮食作物年产量占我国粮食作物总产量90%以上，所以在我国淀粉资源是相当丰富的。淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的通称，广泛存在于动植物和微生物中。由于淀粉 酶在工农业上的重要价值，因此很早就有人对淀粉酶进行研究。1833年Payen和Persoz 已首次从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀分离到淀粉酶。1894年日本人高峰让吉用麸皮培 养米曲霉(Aspergillus oryzae)用水提取，再以酒精沉淀，得到作为消化剂的酶，即高峰 淀粉酶。1919年法国Boidin和Effront首次用枯草杆菌生产淀粉酶，为微生物酶的工业 生产奠定基础。1949年，日本人成功的进行的α-淀粉酶的深层发酵，从而促进了酶的大 规模生产的发展。淀粉酶按照水解淀粉方式的不同大致可分为四大类(1) α-淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1)，它以糖原或淀粉为底物，从分子内部切开α-1，4糖苷键而使底物水解成糊精和 少量的葡萄糖和麦芽糖。(2) β _淀粉酶(EC 3. 2. 1. 2)从底物的非还原末端依次间隔的切 开α -1，4糖苷键，因此作用于直链淀粉时所得的产物为麦芽糖，而作用于支链时只能得到 50% -65%麦芽糖，残留下40%左右的极限糊精。(3)葡萄糖淀粉酶(EC 3. 2. 1. 3):习惯上 简称糖化酶，从底物非还原性末端依次水解α-1，4糖苷键和分支点α_1，6糖苷键，生成葡 萄糖。(4)异淀粉酶(EC 3.2.1.9)只水解糖原或支链淀粉分支点α-1，6糖苷键，切下整 个侧枝。从催化专一性上看，把α-淀粉酶归为糖苷水解酶类(glycosyl hydrases)的 第13家族，属于α-葡萄糖苷水解酶(α-Glycosyl hydrases, EC 3.2.1)，α -淀粉酶 (a-amylase)又称为液化淀粉酶，其系统名称为α-1，4_葡聚糖_4_葡聚糖水解酶(α_1， 4-glucan-glucanhydrolase EC 3.2. 1.1)，常用名 α-淀粉酶，又名 α-1，4 糊精酶，是一种内切酶，能水解淀粉分子中的α-1，4糖苷键，将其任意切成长短不一的短链糊精和少量的 低相对分子质量糖类，直链淀粉和支链淀粉均以无规则的形式进行分解，从而使淀粉糊的 粘度迅速下降，即“液化”起作用，故α "淀粉酶又称为液化酶。α -淀粉酶水解淀粉机制在上个世纪50年代后逐渐得到阐述α _淀粉酶对于直 链淀粉的作用第一步是将直链淀粉任意地迅速地降解成小分子糊精、麦芽糖和麦芽三糖， 第二步缓慢地将低聚糖水解为葡萄糖和麦芽糖。水解终产物有α-极限糊精、部分低聚糖、 麦芽糖和葡萄糖。在α-1，4糖苷键水解地过程中，葡萄糖单位间的C1-0-C4键地Cl-O键 间断裂。α -淀粉酶液化淀粉导致淀粉部分解聚，失去粘性和遇碘呈色的性质，水解物的还 原力增加，当到达消色点附近时随还原力增加而反应速度降低，逐渐达到水解极限。但是不 同来源的α _淀粉酶，不同来源的淀粉、对淀粉的预处理方式、处理温度以及溶液PH等因素 都会影响这一水解过程，导致α -淀粉酶作用于淀粉的水解极限不同，生成低寡糖组成存 在差异和结构不同的极限糊精。不同来源的α-淀粉酶，水解淀粉的极限不同。当α-淀粉酶作用于淀粉时，随 着粘度的下降，碘反应由蓝变紫，再变为红色，直至无色，反应液的还原力逐渐的加强，到达 消色点附近时随还原力的增加反应速度逐渐降低，此时的水解率因酶的来源而异，细菌、霉 菌、麦芽的α-淀粉酶为10-20% ；胰液、唾液和细菌糖化型α-淀粉酶约为40%。α-淀粉酶广泛存在于包括人、动物、植物、真菌和细菌等各种生物中，从1956 年首次报道分离α-淀粉酶开始，目前已经分离并鉴定的超过120种α-淀粉酶，从 数量上看微生物来源的α-淀粉酶占大部分。微生物中能产生α-淀粉酶的属有 Bacillus， Thermomonospor, Acinetobacter, Pseudomonas, Streptomyces, Aspergillus， Penicillus等。目前在工业上大量使用的α -淀粉酶主要来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，黑曲霉(Aspergillus niger)禾口米曲霉(Aspergillus oryzae)。α-淀粉酶具有相当大的商业价值，广泛应用于淀粉深加工工业、酒精工业、啤酒 工业、柠檬酸工业、味精及淀粉糖化工业、制药工业及纺织业。目前我国40多家酶制剂厂 中，淀粉酶是相当一部分厂家的主要酶制剂产品。国内生产其中适用于不同用途的α-淀 粉酶有10余种剂型，但以吸附型居多，包被型或高纯度剂型较少。在我国α-淀粉酶主要 生产菌株是枯草芽孢杆菌和黑曲霉。但是这些生产菌株几乎都从自然界筛选得到或经过人 工诱变的菌株，酶的性质并不十分优良，加之酶的后处理工艺落后，产品利润普遍不高。在 中国具有自主知识产权的基因工程菌株实现工业化生产的α-淀粉酶的报道极少。因此，目前本领域还有必要找到性能优越的新的α-淀粉酶的编码基因，开发出 高性能的淀粉酶，更新和完善淀粉酶的种类，为淀粉原料的深加工提供更好的条件，开创新 的酶法工艺，提高收得率、降低消耗、提高产品质量、增加效益，从而可以进一步促进淀粉原 料深加工行业的发展，显著提高经济效益和社会效益。
发明内容
本发明的目的在于提供α-淀粉酶，其编码基因，含有该基因的重组质粒和菌株， 以及表达方法。
在本发明的第一方面，提供一种分离的α _淀粉酶，所述的α -淀粉酶的氨基酸序 列如SEQ ID NO 11所示，其中，第14位氨基酸选自Tyr或His ；第124位氨基酸选自Asp或Asn ；第133位氨基酸选自His或Arg ；第134位氨基酸选自Arg或Gln ；第164位氨基酸选自Asp或Gly ；第180位氨基酸选自Glu或Lys ；第211位氨基酸选自Glu或Lys ；第264位氨基酸选自Gln或Pro ；第272位氨基酸选自Asn或Thr ；第310位氨基酸选自Gly或Ser ；第373位氨基酸选自Pro或Ser ；或第396位氨基酸选自Tyr或Hi s。在一个优选例中，所述的α -淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :7， SEQ ID NO :8，SEQ ID NO 9 或 SEQ ID NO 10 所示。在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸包含一核苷酸 序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码所述α -淀粉酶的多核苷酸；或(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。在一个优选例中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID N0:1, SEQ ID NO :2， SEQ ID NO :3，SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 5 所示。在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体包含所述的多核苷酸。在一个优选例中，所述的载体是大肠杆菌质粒。在另一优选例中，所述的载体选自pTrcHis2_BSAmy、pTrcHis2_BCAmy、 pTrcHis2-BL16Amy>pTrcHis2-BLAmy pTrcHis2_BPAmy。在本发明的另一方面，提供一种细胞，其包含所述的载体，或其基因组中整合有所 述的多核苷酸。在一个优选例中，所述的细胞是大肠杆菌细胞。在另一优选例中，所述的细胞是包含所述核酸分子或用所述载体转化的大肠杆菌 BL21。在本发明的另一方面，提供一种生产所述的α -淀粉酶的方法，包括培养所述的 细胞，从培养物中分离出表达产物。在本发明的另一方面，提供一种组合物，所述组合物中含有所述的α-淀粉酶；以 及食品学上可接受的载体。在本发明的另一方面，提供所述的α -淀粉酶的用途，用于水解糖原或淀粉。在本发明的另一方面，提供一种水解糖原或淀粉的方法，所述方法包括用所述的 α -淀粉酶处理糖原或淀粉。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
图1 来自枯草芽孢杆菌的编码α -淀粉酶的核酸序列BS-Amy (SEQ ID NO :1)及 其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO :6)。图2 来自蜡状芽孢杆菌的编码α -淀粉酶的核酸序列BC-Amy (SEQ ID NO 2)及
5其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO :7)。图3 来自地衣芽孢杆菌的编码α -淀粉酶的核酸序列BL16_Amy (SEQ ID NO 3) 及其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO 8)。图4 来自地衣芽孢杆菌的编码α -淀粉酶的核酸序列BL-Amy (SEQ ID NO 4)及 其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO :9)。 图5 来自短小芽孢杆菌的编码α -淀粉酶的核酸序列BP-Amy (SEQ ID NO :5)及 其编码的氨基酸序列(SEQ ID Ν0:10)。图6 五种来源的α -淀粉酶氨基酸序列的比对。图 7:大肠杆菌表达 BS-Amy、BC-Amy、BL 16-Amy、BL-Amy 和 BP-Amy 序列所编码 α-淀粉酶的最适反应ΡΗ。图 8:大肠杆菌表达 BS-Amy、BC-Amy、BL16-Amy、BL-Amy 和 ΒΡ-Amy 序列所编码 α-淀粉酶的最适反应温度。图 9:大肠杆菌表达 BS-Amy、BC-Amy、BL 16-Amy、BL-Amy 和 BP-Amy 序列所编码 α-淀粉酶的PH稳定性。图 10:大肠杆菌表达 BS-Amy、BC-Amy、BL 16-Amy、BL-Amy 和 ΒΡ-Amy 序列所编码 α -淀粉酶的热稳定性。图 11 大肠杆菌表达 BS-Amy、BC-Amy、BL 16-Amy, BL-Amy 和 BP-Amy 序列所编码 α -淀粉酶发酵过程中样品的SDS-PAGE。图 12:大肠杆菌表达 BS-Amy、BC-Amy、BL 16-Amy、BL-Amy 和 BP-Amy 序列所编码 α-淀粉酶的分子量。
具体实施例方式本发明人经过深入的研究，首次分离获得一类具有优异的水解糖原或淀粉效果的 α-淀粉酶，其具有酶活性高且稳定性(特别是热稳定性)好的特点。在此基础上完成本发 明。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原 始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化 的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化 的。如本文所用，“分离的α-淀粉酶”是指α-淀粉酶基本上不含天然与其相关的其 它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化α-淀 粉酶。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。α-淀粉酶的纯度 能用氨基酸序列分析。本发明的α-淀粉酶可以是重组蛋白(多肽)、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋 白。本发明的α-淀粉酶可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从 原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生 产方案所用的宿主，本发明的α-淀粉酶可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的 α-淀粉酶还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括α _淀粉酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然α-淀粉酶相同的生物学功能或活性的蛋 白。本发明的α-淀粉酶片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性 氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是 也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白， 或(iii)成熟蛋白与另一个化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合 所形成的蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或 分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。 根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语“ α -淀粉酶”指具有α -淀粉酶活性的SEQ ID NO=Il序列的 蛋白。该术语还包括具有与α-淀粉酶相同功能的、SEQ ID Ν0:11序列的变异形式。这些 变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-30个，较佳地1-20个，更佳地1-10 个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个 或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本 领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在 C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括 α-淀粉酶的活性片段和活性衍生物。该α-淀粉酶的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变 体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与α "淀粉酶的DNA杂交的DNA所编码的蛋 白、以及利用抗α-淀粉酶的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他蛋白，如包含 α-淀粉酶或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的蛋白外，本发明还包括了 α-淀粉酶的可 溶性片段。通常，该片段具有α-淀粉酶序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个 连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少 约100个连续氨基酸。发明还提供α -淀粉酶的类似物。这些类似物与天然α _淀粉酶的差别可以是氨 基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包 括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱 变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括 具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合 成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的α-淀粉酶并不限于上述例 举的代表性的蛋白。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙 酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进 行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动 物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪 氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优 化了溶解性能的蛋白。在本发明中，“ α -淀粉酶保守性变异蛋白(多肽)”指与SEQ ID NO=Il的氨基酸 序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质 相似或相近的氨基酸所替换而形成蛋白。这些保守性变异蛋白最好根据表1进行氨基酸替换而产生。表 权利要求
一种分离的α 淀粉酶，其特征在于，所述的α 淀粉酶的氨基酸序列如SEQ IDNO11所示，其中，第14位氨基酸选自Tyr或His；第124位氨基酸选自Asp或Asn；第133位氨基酸选自His或Arg；第134位氨基酸选自Arg或Gln；第164位氨基酸选自Asp或Gly；第180位氨基酸选自Glu或Lys；第211位氨基酸选自Glu或Lys；第264位氨基酸选自Gln或Pro；第272位氨基酸选自Asn或Thr；第310位氨基酸选自Gly或Ser；第373位氨基酸选自Pro或Ser；或第396位氨基酸选自Tyr或His。
2.如权利要求1所述的α-淀粉酶，其特征在于，所述的α-淀粉酶的氨基酸序列如 SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :7，SEQ ID NO :8，SEQ ID NO 9 或 SEQ ID NO 10 所示。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序 列选自下组(a)编码如权利要求1或2所述α-淀粉酶的多核苷酸；或(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 5 所示。
5.一种载体，其特征在于，所述的载体包含权利要求2所述的多核苷酸。
6.一种细胞，其特征在于，其包含权利要求5所述的载体，或其基因组中整合有权利要 求3或4所述的多核苷酸。
7.—种生产权利要求1所述的α-淀粉酶的方法，其特征在于，包括培养权利要求6 所述的细胞，从培养物中分离出表达产物。
8.一种组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1或2所述的α-淀粉酶；以 及食品学上可接受的载体。
9.权利要求1所述的α-淀粉酶的用途，其特征在于，用于水解糖原或淀粉。
10.一种水解糖原或淀粉的方法，其特征在于，所述方法包括用权利要求1所述的 α -淀粉酶处理糖原或淀粉。
全文摘要
本发明涉及α-淀粉酶，其编码基因及其表达。公开了一种具有SEQ ID NO11所示通式序列的α-淀粉酶。本发明还公开了所述α-淀粉酶的编码基因，含有该编码基因的表达载体和细胞，以及所述α-淀粉酶的制备方法和用途。
文档编号C12N15/56GK101962633SQ20091005520
公开日2011年2月2日 申请日期2009年7月23日 优先权日2009年7月23日
发明者叶秀云, 张洋, 罗鋆琳, 赖庆安, 靳伟刚 申请人:福建福大百特科技发展有限公司