专利名称：检测鸭病毒性肠炎的pcr方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属分子生物学领域，确切地说利用分子生物学检测鸭病毒性肠炎的PCR方法及试 剂盒，特别是鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗株的检测。
背景技术：
鸭病毒性肠炎(duck vi「al enteritis, DVE)，俗称"鸭瘟"、"大头瘟"或"烂肠瘟"。是鸭、 鵝和其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病。流行广泛传播迅速，发病率高和死 亡率大。
近十多年来，我国养鸭业获得迅速发展，据2002年根据联合国粮农组织(FA0)统计， 我国鸭存栏约6. 61亿只，占世界总量的69. 7%，可见我国是第一鸭生产大国。而且以每年10% 15%的速度递增，新建的大规模养殖场逐渐增多，鸭产品的年产值己经接近300亿元人民币， 而且远销欧盟、东南亚、日本、韩国等地，随着国民经济的进一步发展，鸭产品空间还会不 断扩大，所以养鸭业存在巨大的潜力。但由于各地多渠道引进种鸭或蛋，国内禽产品市场交 流频繁，集约化饲养缺乏管理经验，防疫工作措施不当，环境污染严重，导致鸭的各种疾病 不断发生，而且越来越复杂，但危害较为严重的仍为病毒性传染病，每年引起鸭死亡占到15% 20。/。，严重制约着我国养鸭业的持续稳定发展。截止目前，我国从国外引进种鸭(蛋)2000 万只，鸭瘟是每次进出境种鸭(蛋)必检的项目。
目前诊断鸭病毒性肠炎的常规检测方法有1.临床综合诊断；2.病毒的分离和鉴定； 3.微量血清中和试验；4.琼脂糖凝胶沉淀试验(AGP); 5.酶联免疫吸附试验(ELISA); 6. 免疫荧光或免疫酶检测技术。而且一种方法难以确定诊断，最后要经过以上几种方法试验进 行综合判断。这些方法用于鸭瘟诊断耗时长，敏感性、特异性差，不利于快速、准确诊断该 病。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单、特异性强、敏感性高、成本低、适于大规模检疫和 防疫监测的检测鸭病毒性肠炎的PCR方法及试剂盒。 检测鸭病毒性肠炎的PCR方法的引物 Pl (37154-37173): 5 ' — CAAGGCTCTATTCGGTAATGAT—3 ' P2 (37580-37599): 5 ' — GAAGGCGGGTATGTAATGTACA—3 '。 检测鸭病毒性肠炎的PCR方法,包括以下步骤 (1)常规方法提取待检样品基因；
4(2) 将引物Pl、 P2与PCR混合液加入PCR反应管中混合后加入待检样品DNA，加入待 检样品基因；
(3) 将放入PCR反应管放入PCR检测仪中进行反应；
(4) 取PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳；
结果判定有扩增产物约446bp,核苷酸序如序列表SEQ IDNO. 1，为阳性；无扩增产物 约446bp为阴性；
步骤(2)所述的PCR混合物包括PCR缓冲液、dNTP 、 rTaq酶； 按引物P1 (10umol/L) luL 、 引物P2 (10umol/L) luL、
10XPCR缓冲液(10mraol/L) 5nL 、 dNTP (1O國ol/L) 4 u L、 rTaq酶(5U/uL) 0.25uL、 待检病毒DNA模板 3 n L、
加纯水至总体积50uL ;
本发明检测鸭病毒性肠炎的PCR的方法，阳性对照品为鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗株，质量浓 度选自0.07ixg/ uL的102 109倍倍递增稀释液。
步骤(3)按①温度94。C、时间5min， 1个循环；②温度94'C、时间30s ，温度47'C、 时间30s ,温度72"C、时间35s ， 35个循环，进行PCR反应； 检测鸭病毒性肠炎的PCR的试剂盒它包括
溶液1: 1比1比例的引物P1、 P2;
溶液2:包括5: 4: 0. 25比例的10XPCR缓冲液(1O鹏ol/L) 、 d, (10腦1/L)、 rTaq酶(5U/uL);
检测鸭病毒性肠炎的PCR的试剂盒的使用方法
(l)将所述溶液l: 2uL与溶液2: 9.25nL加入PCR反管内混合后，分别加入待检 样品DNA溶液、阳性对照品、阴性对照、空白对照3uL，加纯水至总体积50uL;
(2) 将加好样品的PCR反应管按顺序放入PCR检测仪中；
(3) 按①温度94。C、时间5min， 1个循环；②温度94。C、时间30s ，温度47'C、时间 30s ，温度72。C、时间35s ， 35个循环，进行PCR反应；
(4) 取8 uL PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳；
阳性对照应出现一条约446bp的DNA条带，阴性对照和空白对照没有核酸条带，试验成
卞-
待检样品经电泳出现约446bp的DNA条带，核苷酸序如序列表SEQ ID N0， 1，可判为阳性。
待检样品未出现DNA条带，或者出现的条带不是约446bp判为阴性。
本发明根据GenBank中发表的有关鸭病毒性肠炎的序列，选定其中的基因(UL30、 UL31) 经过筛选，设计并合成一对特异性引物，对鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗株、标准毒株以及各地野株 提取的病毒DNA为模板进行PCR扩增，均得到446bp的与预期大小相符的特异性条带，扩增产物 经凝胶回收后，连接到pMD18-T载体上，并进行PCR鉴定和Hind III/EcoR I双酶切鉴定测序， 序列测定结果与己发表UL30、 UL31区的进行比较，同源性达100%，没有发现变异现象。
对7种鸭易感病原体(鸭病毒性肝炎、鸭巴氏杆菌、鸭大肠杆菌、鸭沙门氏菌、鹅源禽流 感H5毒株、新城疫、小鹅瘟)，3种同类病毒(猪伪狂犬病毒、牛传染性鼻气病毒、马立克氏 病病毒；均无反应；敏感性检测表明，最小检测量2. lfg (或拷贝)。
抗凝血、粪便、脑、心、肝、脾、肺、肾、肠等DNA提取物用所本发明建立的PCR方法 检测，均扩增出大小约446 bp的DNA片段，适于临床和口岸检测。
本发明与常规的鸭瘟诊断以病毒分离和琼脂扩散试验、ELISA等血清学试验进行综合判 断以及其它PCR方法相比，灵敏度高、快速特异、操作简便、易标准化，与现有PCR方法相 比特异性强、灵敏度高，杜绝假阳性、假阴性的出现。以鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗株做阳性对照 更安全。
组装的标准化的试剂盒，性能稳定，操作方便、迅速，扩增产量高，并制定了准确的判 定标准。
图l PCR电泳图，其中h正常SPF鸡胚2: CEF细胞对照；3:标准毒株目的基因扩增
片段；M: DL2000。
图2标准毒株目的基因的PCR敏感性图，其中1、 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11: 100-1010稀 释模板；M: DL2000。
图3特异性PCR电泳结果图，其中l:鸭病毒性肝炎；2:鸭巴氏杆菌；3:鸭大肠杆菌； 4:鸭沙门氏菌；5:鹅源禽流感H5毒株；6:新城疫；7:小鹅瘟；8:标准毒株阳性对照；M:
DL2000
图4同类病毒特异性结果图，1:猪伪狂犬病毒，2:牛传染性鼻气病毒，3:马立克氏病 病毒；4:标准毒株；M: DL2000
图5已知毒株的检测结果，种l, 2， 3:己知鸭病毒性肠炎病毒；4， 5， 6: 3株疫苗毒株。
6图6疑似病料的PCR检测结果，其中1， SP070405; 2: SP080325; 3: TM050211; 4: CC070322; 5: CC070326; 6: CC041217; 7:阴性对照；8:标准毒株对照；M: DL2000。
具体实施方式
实施例l
鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗株，购自中国兽医药品监察所，宝生物工程(大连)有限公司的DNA 提取试剂盒提取DNA;
选取GenBank (登录号:EF417996)中UL30、 UL31 一段序列为模板，用Primer 5. 0软 件设计并合成一对引物P1、 P2,理论扩增片段为446bp，引物的位置和序列如下 Pl (37154-37173): 5 一 一CAAGGCTCTATTCGGTAATGAT—3 ' P2 (37580-37599): 5 ' —GAAGGCGGGTATGTAATGTACA — 3 '
由大连宝生物工程有限公司合成；
按表l的反应体系；
表1 PCR反应体系组成
溶液种类体积(ia)
10 X PCR缓冲液(10mmol/L)5
dNTP (10,1/L)4
引物P1 (10nmol/L)1
引物P2 (10umol/L)1
rTaq酶(5U/ u L)0.25
病毒DNA模板3
纯H2。35. 75
总体积50
按表2的PCR反应条件;
表2 PCR扩增程序
循环阶段循环数温度(°c)时间
11945min
9430s
2354730s
7235s3 1 4'C 保存
同时用正常SPF鸡胚和CEF细胞作阴性对照；
取8 UL上述的PCR产物于iy。琼脂糖凝胶上电泳，鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗株(简称鸭胚毒) 扩增产物约446 bp，结果大小相符；正常SPF鸡胚和CEF细胞对照液均未检出产物，电泳结 果见附图l。
实施例2
将实施1中鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗株(简称鸭胚毒)PCR产物，在1.0%低熔点琼脂糖凝胶 上进行电泳，切下目的条带，按微量凝胶回收试剂盒的使用说明回收目的DNA;将纯化的目 的DNA 4. 5 u L、 T载体0. 5 U L和连接液5 P L混匀，16°C连接过夜，转化DH5 a感受态 细胞，挑取白色菌落接种5 mL LB液体培养基，37°C水浴中摇振培养12 h;经碱裂解法提 取质粒，Hind III/EcoR I双酶切鉴定为阳性质粒，送上海鼎安生物科技有限公司测序，测序 结果见序列表SEQ ID NO. 1。测序结果表明，PCR扩增片段长度为446bp,将所得序列与GenBank (登录号EF417996)己发表的序列比较，二者的同源性为100%。
实施例3 敏感性试验
将鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗株鸡胚培养物提取DNA，核酸测定仪上测定核酸质量浓度为 0.07ug/ uL，用配制的TE (pH8.0) 10倍递增稀释提取的DNA模板，每个稀释度各取3 uL 模板DNA，按实施例l检测，观察阳性条带，以出现阳性预期条带所用模板量的最高稀释度 计算其敏感性，结果最小检出量为2.1 fg，见图2。
实施例4
按实施例1方法，以鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗株(简称鸭胚毒)作对阳性对照，分别对鸭病 毒性肝炎、巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、鹅源禽流感H5毒株、新城疫、小鹅瘟，以及与 鸭病毒性肠炎病毒同类疱疹病毒猪伪狂犬病毒、牛传染性鼻气病毒、马立克氏病病毒；鸭 病毒性肝炎、鸭巴氏杆菌、鸭大肠杆菌、鸭沙门氏菌、鹅源禽流感H5毒株、新城疫、小鹅瘟 进行检测，未能扩增出任何条带，鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗株(简称鸭胚毒)扩增出约446bp条 带，见图3，图4。
实施例5
对本实验室保存的3株已知鸭病毒性肠炎病毒和购买的3株疫苗毒株，按实施例1方法 检测，结果6个样品均观察特异性扩增条带，见图5。
6个样品的扩增产物按实施例2测序，将所得核苷酸序列与GenBank (登录号EF417996)已发表的序列比较，同源性为100%。 实施例6按实例1方法，以正常健康鸭组织作为阴性对照，分别收集吉林省部分地区送检的，经 临床综合诊断、病毒的分离和鉴定、微量血清中和试验综合诊断为鸭病毒性肠炎的病料6份 (SP070405， SP080325, TM050211, CC070322, CC070326, CC041217),均观察到特异性扩增 条带，而正常健康鸭组织无扩增条带，见附图6。6个样品的扩增产物按实施例2测序，将所得核苷酸序列与GenBank (登录号EF417996) 已发表的序列比较，同源性为100%。实施例7将鸭病毒性肠炎标准强毒DPV-F37 (购自中国兽医药品监察所)1000倍灭菌生理盐水稀 释后，按每只0.2mL剂量给健康北京鸭肌肉注射，共注射4只；另设2只对照，肌肉注射灭 菌生理盐水，每只0. 2 mL;攻毒组4只北京鸭(人工感染)在攻毒后1周内全部死亡，分别采集抗凝血0. 5mL，分别 收集粪便、脑、心、肝、脾、肺、肾、肠0.5 g，加入10倍量灭菌PBS，研磨，反复冻融3 次，分别以3000r/min离心15min后取上清，按实例1方法检测，观察特异性扩增条带；结 果见表5对照组2只北京鸭处死，和攻毒同样方法采样，按实例1方法检测无特异性扩增条带为 阴性，见表5。表5鸭组织病料PCR检测结果组织类别攻毒鸭编号对照组编号12341 2抗凝血+++一 —粪++++— —脑++++一 —心++++— —肝++++一 —脾++++— —肺++— —肾++++一 一肠+十++— —9攻毒组扩增产物按实施例2测序，将所得核苷酸序列与GenBank (登录号EF417996) 已发表的序列比较，同源性为100%。 实施例8对三个种鸭场，在鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗(简称鸭胚毒)免疫后的三个月后，随机抽取30 只分别采集抗凝血0.5mL，加入10倍量灭菌PBS,研磨，反复冻融3次，分别以3000 r/min 离心15min后取上清，按实施例l方法进行检测，均扩增出了扩增出约446 bp条带。实施例9利用已建立的PCR方法，分别对来自10个不同地区的散养鸭采集的55份样品，梅河口、双 辽两家大型种鸭场的100份样品，以及近3年来进境检疫保存的验余样品的30份随机样品分别 按实施例进行了测定，结果临床样品有3份出现特异性扩增条带；见表6对3份出现特异性扩增条带的扩增物按实施例2测序，将所得核苷酸序列与GenBank (登 录号EF417996)己发表的序列比较，同源性为100%。表6采集样品的检测结果散户/鸭场 样品数 阳性数 阴性数德惠303磬石202四平1019长春16016图们312临江404长白615白城606前郭505双辽某鸭场50050梅河口某鸭场50050本实验室30030合计185318210SEQUENCE LISTING<110> 吉林大学〈120> 检测鸭病毒性肠炎的PCR方法及试剂盒<160> 1〈210〉 1〈211> 446〈212〉 DNA〈213> 鸭病毒性肠炎鸡胚化弱毒疫苗株C-KCE 〈■> 1CMGGCTCTATTCGGTMTG ATCACAAAAC TTCGGAAGCTGTTTTAAAACGCTTTATTCC60AGAAACATACTGTGAGAGTG ACGAAACCGC AGCACTGCTATCTTCGGCCGGGTTTGCAGA120AGTGCGCTTGTACCCAGGGA TGCCACTCAG CGAGGAGGAGGAAAATCGTCAAAAGCTGCG180TAGAGCTTTCGATATTCTAG CAGAAGTTCC CCATCG嵐TTMGGTCGCACATTTTACAA240TAAATATCTTCMTACTTAT CTGTGGTACG CTGTCCACGTCAGTTTGCCGTTCGCGGTCG300CGCCTCACGACAAGTACGAA TGTAGMTGC CAAACATGAGCCATTAGACGGTATCCCCGG360CMGCAGATTTMGGCAGTC GATGAGACGA TAGTGTAGATGTACGGCATTTCCAGTAAAT420GGMTGTACATTACATACCC GCCTTC44权利要求
1、检测鸭病毒性肠炎的PCR方法的引物P1(37154-37173)5′-CAAGGCTCTATTCGGTAATGAT-3′P2(37580-37599)5′-GAAGGCGGGTATGTAATGTACA-3′。
2、 检测鸭病毒性肠炎的PCR方法，包括以下步骤(1) 常规方法提取待检样品基因；(2) 将引物Pl、 P2与PCR混合液加入PCR反应管中混合后加入待检样品DNA，加入待 检样品基因；(3) 将放入PCR反应管放入PCR检测仪中进行反应；(4) 取PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳；结果判定有扩增产物约446bp,为阳性；无扩增产物约446bp为阴性。
3、 根据权利要求2所述的检测鸭病毒性肠炎的PCR方法，其特征在于步骤(2)所述的 PCR混合物包括PCR缓冲液、dNTP 、 rTaq酶；按引物P1 (10nmol/L) luL、 引物P2 (10umol/L) 1 y L、10XPCR缓冲液(10咖ol/L) 5uL 、 dNTP (10mmol/L) 4 P L、 rTaq酶(5U/ti L) 0. 25 y L、 待检病毒DNA模板 3uL、加纯水至总体积50uL 。
4、 根据权利要求2所述的检测鸭病毒性肠炎的PCR方法，其特征在于阳性对照品为鸭 瘟鸡胚化弱毒疫苗株，质量浓度选自0. 07 w g / w L的102 109倍倍递增稀释液。
5、 根据权利要求2、 3所述的检测鸭病毒性肠炎的PCR方法，其特征在于步骤(3)按 ①温度94'C、时间5min， 1个循环；②温度94。C、时间30s ，温度47。C、时间30s ，温度 72°C、时间35s ， 35个循环，进行PCR反应。
6、 根据权利要求5所述的检测鸭病毒性肠炎的PCR方法，其特征在于所述的扩增产物 约446bp，其核苷酸序如序列表SEQ ID NO. 1。
7、 检测鸭病毒性肠炎的PCR试剂盒它包括溶液l: 1比1比例的引物P1、 P2;溶液2:包括按5: 4: 0. 25比例的10X PCR缓冲液(10mmol/L) 、 dNTP (10mmol/L)、 rTaq酶(5U/nL)。
8、 根据权利要求6所述的检测鸭病毒性肠炎的PCR试剂盒，其特征在于阳性对照品为 鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗株，质量浓度选自0. 07 Pg / wL的102 109倍倍递增稀释液。
9、 检测鸭病毒性肠炎的PCR试剂盒的使用方法(O将所述溶液h 2uL与溶液2: 9.25uL加入PCR反管内混合后，分别加入待检样 品DNA溶液、阳性对照品、阴性对照、空白对照3wL，加纯水至总体积50uL;(2) 将加好样品的PCR反应管按顺序放入PCR检测仪中；(3) 按①温度94T:、时间5min, 1个循环；②温度94。C、时间30s ，温度47。C、时间 30s ，温度72。C、时间35s , 35个循环，进行PCR反应；(4) 取8 uL PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳；阳性对照应出现一条约446bp的DNA条带，阴性对照和空白对贈没有核酸条带，试验成待检样品经电泳出现约446bp的DNA条带，可判为阳性；待检样品未出现DNA条带，或者出现的条带不是约446bp判为阴性。
10、根椐权利要求9所述的检测鸭病毒性肠炎的PCR试剂盒的使用方法其特征在于所 述的约446bp的DNA条带，其核苷酸序如序列表SEQ ID NO. 1。
全文摘要
本发明公开了检测鸭病毒性肠炎的PCR方法，选择鸭病毒性肠炎UL30、UL31基因片段，经过筛选确定一对引物，对标准毒株以及各地野株提取的病毒DNA为模板进行PCR扩增，均得到约446bp条带，序列测定结果与已发表UL30、UL31区的进行比较，同源性达100％，没有发现变异现象，对6种鸭易感病毒、3种同类病毒均无反应；各种组织DNA提取物用所建立的PCR方法检测，均扩增出大小约446bp的DNA片段，最小检测量2.1fg(或拷贝)，适于临床和口岸检测，本发明灵敏度高、快速特异、操作简便、易标准化；组装的标准化试剂盒，性能稳定，操作方便、迅速，扩增产量高，以鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗株做阳性对照更安全并制定了准确的判定标准。
文档编号C12Q1/70GK101514374SQ20091006658
公开日2009年8月26日 申请日期2009年3月2日 优先权日2009年3月2日
发明者刘静波, 玉 周, 潘风光 申请人:吉林大学