专利名称：治疗炎性肠病的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗炎性肠病(IBD)，尤其是溃疡性结肠炎和克罗恩病的方法 以及用于治疗的装置。
背景技术：
溃疡性结肠炎和克罗恩病是炎性肠病(IBD)的表现形式。其他形式的IBD 包括淋巴细胞结肠炎和胶原性结肠炎。目前用高剂量的甾体来治疗爆发型溃 疡性结肠炎患者。抗TNFoc的ni期临床试验也在进行当中。这两种药物是广 谱炎症抑制剂，在约50%的情况下有效但产生严重的副作用。通常，爆发型 结肠炎患者还可能复发。在对药物治疗没有响应的爆发型结肠炎患者中，必 须立即进行手术干预。溃疡性结肠炎总是局限在大肠(结肠)。在爆发型结肠炎 中，切除结肠并构建外部回肠造瘘(ileostoma)。恢复和可能地进一步药物治疗 直肠残肢炎症之后，在大多数患者中进行回肠直肠吻合术或骨盆陷凹重建术 以恢复肠连续性。这两种手术都会导致每天约六次的稀粪并且破坏了水和矿 物质的平衡。
克罗恩病患者通常在小肠的最远端部分和大肠的第一段(回盲区)处患有 炎症，但炎症也可位于胃肠道的任何部分。虽然抗炎药如甾体和硫唑嘌呤能 够暂时减轻疾病，但药物治疗不能治愈疾病。约50%的患者需要手术切除狭 窄或成瘘肠段；其中一半患者将复发而需要进一步的手术治疗。因此，非常 希望能够在个体患者中特异性地关闭IBD的炎症并防止疾病复发的方法。
WO2005113037公开了一种滤器以及从生物液体样品中去除选定物质的 方法。滤器包括外壳、进口和出口。外壳内提供多个过滤面并对过滤面施加 至少一种涂层。所述至少一种涂层包括至少两个结合模块，这两个模块相互 间又选择性地结合。 一个结合模块选择性地结合于过滤面，另一个结合模块 被构造成能够选择性地结合选定物质，而将该物质从液体样品中去除。当液 体样品通过进口、外壳和出口时，选定物质通过涂层选择性地结合于过滤面上。液体样品是血液样品。 一种选定的液体组分是例如选自白细胞、粒细胞 和淋巴细胞的的血液组分。
从血中分离白细胞的过滤介质和装置例如在JP2003265596 ; US5885457 ; JP04187206 ; US4936993 ; JP03000074 ; JP02167071 ; JP02009823; JP10057477中描述。
发明目的
本发明的目的是提供治疗IBD，尤其是溃疡性结肠炎和克罗恩病的方法。
本发明的另一个目的是提供该方法中使用的装置。
通过本发明的简短说明，通过附图所示的优选实施方式以及所附的权利 要求书，本发明的其他目的将显而易见。
发明概述
在IBD的炎症过程中，T-细胞与白细胞相互作用。某些辅因子刺激白细 胞释放有害物质。这些有害物质破坏肠细胞。从活跃IBD患者的肠活检组织 获得的物质的流式细胞术分析，我们在活化的T淋巴细胞以及活化的中性粒 细胞和嗜酸粒细胞上鉴定到白细胞表面标记物，这些细胞富集在炎症部位， 而且存在于循环的外周血中。
本发明建立在以下假设的基础上，即这些活化的细胞能够启动和维持 IBD的炎症，并且从循环去除它们能够减轻炎症、甚至消除炎症。所述概念 包括以下观点每位患者的炎症状态在白细胞活化的程度、类型和侵袭性T 细胞的相对比例方面是独特的，参数随患者个体以及疾病的严重性而变化， 并且受到给予患者的药物的影响。本发明不需要使用本领域已知的非特异性 白细胞吸附剂，例如棉花和其他聚合物纤维。在本发明的内容中，IBD主要 包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，以及特征为水样腹泻、内窥镜检查正常但在 肠粘膜下层有胶原组织病理学蓄积的胶原性结肠炎，和特征为肠粘膜中存在 大量淋巴细胞且伴随腹泻的淋巴细胞结肠炎。
根据本发明，对IBD患者进行结肠镜检查。取一个或多个患病肠组织活 检样本。从单个或混合的活检材料制备单细胞悬液。采用针对CD4、 CD8、 CD3、 CD15、 CD19的抗体，通过流式细胞术测定单细胞悬液中T淋巴细胞、B淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞的存在。此外，使用针对活化标
记物如CD69、 CD62L、 CD25、 CD27、 HLA-DR、 CD44和CD66b的抗体来 探究粘膜侵袭性免疫细胞的活化状态。原则上，每位患者的炎症状态在活化 程度、细胞侵袭类型方面是独特的，参数随疾病严重性以及给定药物而变 化。基于该研究结果，使用白细胞分离柱来靶向清除主要引起炎症的细胞 群。为清除活化的T和B淋巴细胞，使用偶联于固体支持物的能够识别活化 标记物CD69的抗体。为清除活化的中性粒细胞，使用针对肠归巢分子或 CD66b的抗体；用上面固定有整联蛋白(x4 (37抗体的支持物装载的分离柱能 够清除这种类型的白细胞。因此，从发生炎症的肠部位引流至肠粘膜而导致 额外的局部炎症的淋巴结中活化的外周循环中的血细胞也能通过这种基于抗 体的外周血白细胞分离法来清除。这将妨碍或者甚至抑制肠自体反应性T细 胞的进一步补充。
根据本发明，公开了一种白细胞分离柱，其装载有大表面容积比的合适 的固体支持物，所述支持物表面载有能够结合外周血中循环的活化白细胞的 抗体，所述活化的白细胞选自T淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞。使 来自IBD炎症患者的外周血通过柱，将导致活化的白细胞与抗体偶联，从而 将这些白细胞从循环中清除。通过动态平衡机制，排除循环外周血中活化的 白细胞将导致转移至肠的活化白细胞数量减少，从而降低肠道中活化白细胞 的数量。在本申请中，术语"抗体"包括抗体，尤其是单克隆抗体及其保留 相应抗体的抗原/抗体结合能力的片段或修饰形式，包括重组改变的抗体及其 抗原结合片段。
这种"定制的"白细胞分离术能够筛选出导致肠粘膜细胞特异性活化的 活化的白细胞，从而清除炎症过程中的重要因子并逆转爆发型结肠炎。在克 罗恩病患者中，相同的原则应用于白细胞；但在该情况下，白细胞活化靶向 位于肠壁较深处的抗原。通过鉴定导致炎症的抗原，可以选择抗原，将抗原 以固定在固体支持物上的状态递呈给通过柱的白细胞，并以该方式结合活化 的白细胞。
基于肠道类型和炎症活化的程度，使用白细胞分离柱来靶向清除主要的 导致炎症的细胞群。尤其优选去除外周血中的活化的T淋巴细胞。
从IBD患者的外周血中去除活化的T淋巴细胞，优选使它们与CD69抗 体或整联蛋白(x4(37抗体相接触；这些抗体可单独使用或联用。可以相应的方式去除活化的中性粒细胞和嗜酸粒细胞，即使它们分别与CD66b和CD9抗体
相接触。
根据本发明，IBD患者外周血中也可鉴定到这些活化的中性粒细胞和嗜 酸粒细胞。
根据本发明第一个优选的方面，通过使用固体支持物上包括两种或多种 抗体的柱，来清除活化的T白细胞和/或活化的中性粒细胞和/或活化的嗜酸粒 细胞。优选地，每种抗体使用单独的支持物。
根据本发明第二个优选的方面，以对应数量的单独柱中设置单独的支持 物，每种支持物具有不同的抗体。优选各柱串联。
根据本发明第三个优选的方面，将通过结肠镜检查获取的IBD患者的几 种活检组织进行合并，机械处理形成单细胞悬液，通过流式细胞术分析鉴定 选自T淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞、任选活化的B淋巴细胞的存 在，所述方法包括使它们接触特定抗体，尤其是CD4、 CD8、 CD3、 CD15和 CD19的抗体。
根据本发明第四个优选的方面，通过使侵袭性免疫细胞接触针对活化标 记物如CD69、 CD62L、 CD25、 CD27、 HLA-DR、 CD44和CD66b的抗体， 来确定结肠镜检查获取的IBD患者的粘膜侵袭性免疫细胞的活化状态。
T淋巴细胞倾向于迁移到表达oc4(37整联蛋白受体的肠壁粘膜中，结合内 皮上表达的MAdCAM-1 (粘膜定居因子细胞粘附分子-l)。根据本发明，这种 侵袭性T细胞可通过白细胞分离法从外周血中去除，该方法采用表面上固定 有oc4(37整联蛋白受体的抗体的支持物构成的柱。
因此，对流式细胞术检验活检组织表明活跃性炎症的IBD患者应用基于 抗体的白细胞分离法，能够清除引起局部肠道炎症的特定细胞群。引入静脉 内途径，例如在肘前静脉中连接肝素化管路，该管路与蠕动泵相连，蠕动泵 以每分钟约30毫升的速率泵送血。血通过经设计的抗体白细胞分离柱，例如 在对侧肘前静脉中重新引入管路。例如，患者经过60分钟的白细胞分离法， 能够从大约一半或一半稍少一些的血容量(60 x 20 ml = 1800 ml)中清除活化的 细胞。不管一次白细胞分离术清除的血容量多少，在l-3周的时间内重复处理 3-5次，以去除血中新产生的肠活化免疫细胞。然后，通过上述流式细胞术再 次检査肠活检组织单细胞。
根据本发明尤其优选的方面，公开了一种治疗炎性肠病(IBD)的方法，该方法包括(a)提供从患者炎症组织获取的肠活检组织样品；(b)机械处理该样 品以获得细胞悬液；(C)鉴定悬液中选自T淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细 胞的活化白细胞的细胞表面标记物；(d)产生针对活化的白细胞的抗体；(e)将 针对活化的白细胞的抗体固定在通用支持物或单独支持物上；(f)提供用该支 持物装载的柱；(g)将患者外周血的一部分通过柱，然后重新灌注到患者体 内，而使活化的白细胞与支持物上的抗体偶联而从血流中清除。优选在单独 的柱中提供负载有针对活化的T白细胞和针对活化的中性粒细胞和/或活化的 嗜酸粒细胞的抗体的支持物，可串联或并联。还优选，该方法采用单个柱， 柱装载有单独的支持物，支持物上固定有分别针对活化的T淋巴细胞、活化 的中性粒细胞和活化的嗜酸粒细胞和任选的活化的B淋巴细胞中的两种或多 种的抗体。优选地，本发明柱的排空容积为20-100毫升，特别是30-50毫 升，但其他更大的容积，例如一直到500毫升也是可行的。如果釆用较大容 积的柱，重要的是在处理结束时排空柱以使血液损失最少。这可通过例如用 盐水冲洗柱直到冲洗介质己更换柱中大多数或基本上所有的血液。与血液接 触的柱和管路表面应能够防止凝血；因此优选使用表面肝素化的柱和管路。 提供或修饰表面使其不会激活凝血系统的方法是本领域众所周知的。通常， 一次治疗过程有三分之一或三分之二的患者血液，优选约一半或一半稍少一 些的血液通过柱。通常，-一次治疗不足以减轻或长时间消除或基本上抑制症 状。因此，优选从开始治疗起在1-3周的时间内重复治疗2或3次直到5次和 更多次。肠活检组织样品是从患者获取的多个该样品之一，所述样品合并后 进行机械处理而形成细胞悬液。就外周循环中活化的T淋巴细胞而言，尤其 适用于本发明方法的是CD69抗体或整联蛋白(x4(37抗体，这些抗体也优选固 定在本发明的支持物上。肠粘膜中活化的T淋巴细胞的存在优选通过使细胞 悬液或从悬液分离的细胞接触针对一种或多种活化标记物CD69、 CD62L、 CD25、 CD27、 HLA-DR、 CD44、 CD66b的特异性抗体来检测。 "提供抗体"包括从商业或其他来源获取抗体。 现在将参考附图所示的优选实施方式更详细地描述本发明。
附图简要说明
图1-4显示了外周血和肠粘膜的CD4+ T细胞和中性粒细胞上活性标记物 的表达。图5-9显示了在MACS (磁力活化细胞筛选)柱上分离活化的外周血 CD4+T细胞和中性粒细胞的作用。
图IO显示了与患者循环系统相连的本发明的柱。
具体实施例方式
材料和方法
摔^游欲桌与劳y吝结肠镜检查期间收集带有爆发型溃疡性结肠炎的 IBD患者的活检组织样品，立即转移到充满生理盐水的试管中并在1小时内
进行进一步的处理。采用大致匹配的玻璃匀浆器获取活检细胞的单细胞悬
液。然后用PBS配制的含0.05% NaN3、 0.1%牛血清白蛋白(BSA)和0.4%二水 合柠檬酸三钠的荧光活化细胞筛选(FACS)缓冲液洗涤细胞2次。
用0.83重量y。氯化铵水溶液溶解来自同一个体的肝素化外周血，在
FACS缓冲液中洗涤2次，获得白细胞悬液。
将该细胞悬液与偶联荧光染料的单克隆抗体避光在室温下单独孵育30分 钟。最后洗涤之后，将细胞悬浮在500ialFACS缓冲液中进行分析。
所有抗原(CD4、 CD69、 CD66b)使用偶联异硫氰酸荧光素 (FITC)、藻红蛋白(PE)或多甲藻素叶绿素蛋白(PerCP)的鼠抗人mAb。也进行 同种型匹配的对照标记，采用偶联荧光染料鼠抗人IgM k和IgG2bK作为非特 异性染色的对照。用于流式细胞术分析的所有抗体都购自美国圣地亚哥的BD 生'物禾斗学/药学公司(Becton Dickinson (BD) Biosciences/Pharmingen ， San Diego， USA)。抗-FITC偶联微珠(偶联特异性抗体的纳米大小的超级磁性颗 粒)购自德国美天旎生物技术有限责任公司公司(Miltenyi Biotech, GmbH， Germany)。
魔式纷應^分析，在双激光FACS Calibur流式细胞仪上(美国加利福尼亚 州圣乔治的BD免疫细胞计数系统公司(BD Immunocytometry systems, San Jos6， CA， USA))进行流式细胞术分析。每个样品计数1万个细胞并进行分 析。数据处理采用BD公司(Becton Dickinson)的Cell Quest Pro软件。
/^智應i;S^/i,将第一插管1形式的静脉通路引入肘前静脉8。第一插 管1与第一肝素化管路2相连，蠕动泵3作用于管路2，每分钟泵送约30毫 升血液。在其另一端，肝素化管路2与容积50毫升的白细胞分离柱4的一端 相连，白细胞分离柱4中填充有颗粒性固体支持物5如Sepharose ,支持物上固定有针对从患者收集的活化的T白细胞的抗体。固定有抗体的固体支持
物5通过第一和第二过滤体10、 ll保持在原位。白细胞分离柱4的另一端与 第二肝素化管路6相连，管路6在其另一端与第二插管7相连。第二插管7 被引入对侧的肘前静脉9中。这样，静脉血从肘前静脉8通过柱4流动到对 侧的肘前静脉9中，在柱4中活化的T淋巴细胞与支持物5上的抗体偶联而 保留在柱中。白细胞分离过程通常是60分钟，能够清除约一半或一半稍少一 些的血液中的活化细胞(取决于患者体重60 x 20 ml = 1800 ml)。例如在1-3周 的时间内重复上述过程3-5次以除去血中新产生的肠活化免疫细胞。然后，通 过上述流式细胞术再次检查肠活检组织单细胞。以相应的方式完成活化的中 性粒细胞和/或活化的嗜酸性细胞的分离性输血。本发明亲和色谱法中使用的 使抗体附连于固体支持物的其他方法在Nisevitch M和Firer， MA， J Biochem Biophys Methods 49 (2001) 467-480中描述，其内容被纳入本文作为参考。
实施例1
M4CS分庸，对2毫升来自健康供者的肝素化外周血用SEB (4 )ag/mL)和 抗-CD28单克隆抗体(IO pg/mL)在37°C下刺激2小时，得到活化的T细胞和 中性粒细胞。为了获得活化细胞和静息细胞的混合物，再加入2毫升未刺激 的血液。将白细胞固定，通过低渗溶胞作用除去红细胞。对白细胞进行洗涤 并与偶联FITC的抗CD69或CD66b—起孵育。4'C下避光孵育10分钟后，洗 涤细胞并与抗FITC微珠再孵育15分钟。在MACS柱上分离细胞；在不同试 管中收集阴性和阳性馏份。最后，洗涤细胞并通过FACS进行分析。
实施例2
mo ,患者游,/Vf虛浙厲^^,活众游CD" 7V银教，我们对10位Mb克 罗恩病患者和12位溃疡性结肠炎患者的血液和结肠活检组织的单细胞悬液进 行研究。IBD患者的外周血中显示活化表型的CD4+T细胞，因为发现T辅助 细胞表达非常早期的活化标记物(图1)。在IBD患者的结肠活检组织中，大多 数CD4+ T细胞表达CD69活化标记物，作为蓄积在结肠肠壁中的导致结肠自 体免疫性破坏的炎症T细胞的反应征兆(图2)。外周血中发现的活化的T细胞 是类似的T细胞，在肠淋巴结中活化从炎症结肠段引流趋向炎症部位，是应 该清除的细胞群。
11实施例3
凌#/^///^虛/^#^^^"，皆众游^丝/^,智蘑，中性粒细胞是先天免 疫系统的一部分，参与局部炎症的活化与维持。IBD患者的外周血中，大多 数中性粒细胞少量表达CD66b，而一部分中性粒细胞大量表达象征活化表型 的CD66b(图3)。活跃型IBD患者的结肠活检组织中大部分中性粒细胞是 CD66bHi(图4)，表明先天免疫系统的活化同样涉及肠炎的启动。
实施例4
^^//#7應^;^#兹众游0^+ r,^一欲應，从外周血中清除表达CD69 活化标记物的活化的T淋巴细胞(图5)，采用特异性抗体和柱可以识别趋向炎 症结肠粘膜的细胞。用活化标记物CD69标记的T淋巴细胞水悬液通过负载 偶联第二抗体的抗-FITC磁珠的柱。在柱洗脱液中成功分离并富集非活化的T 淋巴细胞，表明大多数CD69+细胞可从外周血中清除(图6)。
实施例5
A，^i ^獰餘贫众游将表达高水平细胞表面标记物 CD66b的活化的中性粒细胞(图7)与偶联第二抗体的抗-FITC磁珠一起孵育并 进行柱纯化。大多数表达中等到高水平CD66b活化标记物的活化的中性粒细 胞被俘获在柱中，而从外周血中清除(图8)。
实施例6
/SD ,康者游示银丝治#,对IBD患者进行结肠镜检査。取一些活检组 织。从合并的活检组织制备单细胞悬液。采用针对例如CD4、 CD8、 CD3、 CD15、 CD19的抗体，通过流式细胞术鉴定单细胞悬液中的活化的白细胞， 即T淋巴细胞、B淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞。此外，采用针对活 化标记物如CD69、 CD62L、 CD25、 CD27、 HLA-DR、 CD44禾D CD66b的抗 体来测定粘膜侵袭性免疫细胞的活化状态。
制备白细胞分离柱，它包括针对活化的白细胞和粘膜侵袭性免疫细胞的 抗体。柱容积可在宽范围内变化，但出于经济原因和保持血液损失最少的考 虑，优选容积约30-50毫升。通过能使抗体与固体支持物共价偶联的任何技术使抗体固定在合适的支持物如Sepharose⑧上。例如，具体患者中采用针对活 化标记物CD69的抗体以清除活化的T细胞，采用针对肠归巢分子或针对 CD66b的抗体以清除活化的中性粒细胞，或针对CD9的抗体以清除活化的嗜 酸粒细胞。可用固定有一种或多种抗体的支持物预先填充柱，或者可单独制 备，例如通过非共价固定方案，例如利用含蛋白A (protein A)或链霉亲和素 的支持物分别与抗体或生物素化抗体的Fc区域结合。现成或单独制备的白细 胞分离柱与患者外周循环系统相连，以类似于人工肾脏的方式，持续足够的 时间以使一些血液容积，优选约3-5个血液容积通过其中。实施例7
俘莸淳定浙應#或獰定潘應#游资^游^浙應分庸乾*柱包括负载 整联蛋白a4(37抗体的支持物，能够清除表达肠归巢分子的T细胞(图9)，因 而在基于抗体的白细胞分离柱过程中清除了导致其他局部炎症的从炎症肠部 位引流趋向肠粘膜的淋巴结中活化的外周血细胞。用带有抗CD69抗体的支 持物填充的柱能够清除血流中活化的T和B淋巴细胞，从而抑制肠自体反应 性T细胞的进一步补充。以类似的方式，用带有抗CD66b抗体的支持物填充 的柱能够清除活化的中性粒细胞；相应地为清除活化的嗜酸粒细胞，优选 CD9抗体。这些支持物可串联或并联使用，例如平行或连续相连的柱，每个 柱包含一种支持物或一个柱包含几种支持物，例如一种带有CD69，另一种带 有CD66b。为在给定大小和固体支持物的柱中优化T细胞清除，可改变支持 物表面抗体的密度、抗体亲和力以及通过柱的血液流速等。
因此，对流式细胞术研究活检组织表明活跃性炎症IBD患者进行基于抗 体的白细胞分离法，以清除导致局部肠道炎症的特定细胞群。例如，将静脉 通路引入肘前静脉，肘前静脉连接肝素化管路，该管路与蠕动泵相连，蠕动 泵以每分钟约30毫升的速率泵送血。血通过本发明的白细胞分离柱，例如在 对侧肘前静脉中重新引入。患者经过60分钟的白细胞分离，能够从大约一半 的血容积中清除活化的细胞(60 x 20 ml = 1800 ml)。在1-3周的时间内重复治 疗3-5次，以去除血中新产生的肠活化免疫细胞。然后，通过上述流式细胞术 再次检査肠活检组织单细胞。
图1:外周血CD4+ T淋巴细胞上活性标记物CD69的表达较低(3.8 %的 CD4+T细胞表达，平均荧光强度(MFI)20.0)。
图2:结肠粘膜CD4+T淋巴细胞中CD69表达升高(72.8。/。， MFI 3 3.5).
图3:大多数外周血中性粒细胞表达低水平CD66b;但11.5%表达升 高，表明细胞活化。Ml期细胞的MFI为104.3。
图4:结肠粘膜中性粒细胞具有较高的CD66b MFI(M1期629.7)，活化 的中性粒细胞群增加。
图5:分离CD69-阳性细胞之前的CD4+ T淋巴细胞5.9%的细胞表达 CD69。
图6:分离CD69-阳性细胞之后的CD4+T淋巴细胞阳性部分由61.6% CD69-阳性CD4+ T细胞构成。
图7:分离CD66b-阳性细胞之前的中性粒细胞42.7%的细胞中等到高 表达CD66b。
图8:分离CD66b-阳性细胞之后的中性粒细胞阳性部分中86.6%的中 性粒细胞中等到高表达CD66b。
图9:分离a邻7整联蛋白阳性细胞之前和之后的CD4+ T淋巴细胞 MACS之前37,4 %的细胞中等到高表达a4p7整联蛋白，MACS之后为92.9%。
权利要求
1. 一种治疗炎性肠病(IBD)的方法，所述方法包括(a)提供从患者炎症组织获取的肠活检组织样品；(b)机械处理该样品以获得细胞悬液；(c)鉴定悬液中选自T淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞的活化白细胞的细胞表面标记物；(d)产生针对所述活化的白细胞的抗体；(e)将针对所述活化的白细胞的抗体固定在通用支持物或单独支持物上；(f)提供用该支持物装载的柱；(g)将患者外周血的一部分通过柱，然后重新灌注到患者体内，使所述活化的白细胞与所述支持物上的抗体偶联而从血流中清除。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在串联或并联的单独的柱中提供所述带有针对所述活化的白细胞的抗体的支持物。
3. 如权利要求2所述的方法，所述方法包括用支持物装载的单个柱，针对所述活化的白细胞的抗体固定在支持物上。
4. 如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，排空容积为20-100毫升。
5. 如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，排空容积为30-50毫升。
6. 如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于， 一次治疗中使三 分之一到三分之二的患者血容量通过柱。
7. 如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于， 一次治疗中使大 约一半或比一半稍少一些的患者血容量通过柱。
8. 如权利要求l-7中任一项所述的方法，其特征在于，在l-3周的时间内 重复治疗3-5次或更多次。
9. 如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述肠活检组织 样品是从患者获取的数个该样品之一，并将所述样品合并后迸行机械处理以 形成细胞悬液。
10. 如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，通过使它们接触 抗CD4、 CD8、 CD3、 CD15、 CD19的特异性抗体中的一种或多种，来鉴定 活化的T淋巴细胞的存在。
11. 如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，通过使它们接触抗CD69、 CD62L、 CD25、 CD27、 HLA-DR、 CD44的特异性抗体中的一种或 多种，来鉴定活化的T淋巴细胞的存在。
12. 如权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，固定在支持物 上的所述针对活化的白细胞的抗体选自CD 69和整联蛋白a4p7抗体。
13. 如权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，固定在支持物 上的针对活化的中性粒细胞的抗体是CD66b。
14. 如权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，固定在支持物 上的针对活化的嗜酸粒细胞的抗体是CD9。
15. —种用支持物装载的白细胞分离柱，所述支持物上固定有针对选自T 淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞的活化的白细胞的细胞表面标记物的抗 体，所述活化的白细胞是从炎性肠病(IBD)患者的炎症肠组织获取的活检组织 样品经机械处理而获得的细胞悬液中的活化的白细胞。
16. 如权利要求15所述的柱，其特征在于，所述柱的外水体积为20-100ccmc
17. 如权利要求15所述的柱，其特征在于，所述柱的外水体积为30-50ccm0
18. 如权利要求15-17中任一项所述的柱，其特征在于，所述针对活化的 T淋巴细胞的抗体选自CD69抗体和整联蛋白(x4(37抗体。
19. 如权利要求15-17中任一项所述的柱，其特征在于，所述针对活化的 中性粒细胞的抗体选自CD66b抗体。
20. 如权利要求15-17中任一项所述的柱，其特征在于，所述针对活化的 嗜酸粒细胞的抗体选自CD9抗体。
21. —个或多个如权利要求15-19中任一项所述的白细胞分离柱并联和/或 串联的组合。
22. —种白细胞分离设备，其包括如权利要求15-21中任一项所述的柱、 与所述柱串联的血泵以及将所述泵和柱连接于患者静脉系统的装置。
23. 如权利要求22所述的设备，其特征在于，所述将泵和柱连接于患者 静脉系统的装置包括两个插管。
24. 如权利要求22或23所述的设备，其特征在于，所述泵是在与柱相连 的软管上运行的蠕动泵。
25. —种T-白细胞分离的支持物，所述支持物上固定有一种或多种针对从炎性肠病(IBD)患者的炎症肠组织分离的选自T淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞的活化的白细胞的抗体。
26. 如权利要求25所述的支持物，其特征在于，所述活化的白细胞是从 炎症肠组织获取的一个或多个活检组织样品中分离的。
27. 如权利要求25或26所述的支持物在治疗克罗恩病中的应用。
28. 如权利要求25或26所述的支持物在治疗渍疡性结肠炎中的应用。
29. 如权利要求25或26所述的支持物在治疗胶原性结肠炎中的应用。
30. 如权利要求25或26所述的支持物在治疗淋巴细胞结肠炎中的应用。
全文摘要
一种治疗炎性肠病(IBD)的方法，所述方法包括提供从患者炎症组织获取的肠活检组织样品；机械处理该样品以获得细胞悬液；鉴定悬液中选自T淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞的活化白细胞的细胞表面标记物；产生针对一种或多种所述活化的白细胞的抗体；将针对活化的白细胞的抗体固定在支持物上；提供用该支持物装载的柱；将患者外周血的一部分通过柱然后重新灌注到患者体内，使所述活化的白细胞与所述支持物上的抗体偶联而从血流中清除。还公开了对应的柱和支持物以及它们在所述方法中的应用。
文档编号A61P1/00GK101443041SQ200780016903
公开日2009年5月27日 申请日期2007年5月14日 优先权日2006年5月12日
发明者M·瑟恩, O·温维斯特 申请人:Ibd柱疗法国际股份公司