一种抗水貂病毒性肠炎精制蛋黄抗体及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种抗水貂病毒性肠炎精制蛋黄抗体及其制备方法，所述抗体通过向分离的高免蛋黄中加入醋酸缓冲液进行稀释，其中，蛋黄与醋酸缓冲液的体积比为1：2，用酸调PH至4.8；按每毫升稀释蛋黄液加11μL辛酸的比例在室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，低温下静置2h，然后以10000r/min的转速离心30min，弃沉淀；上清液经125μm尼龙筛过滤后，加入1/10体积的0.01mol/L的PBS，用碱调PH至7.2；将40％甲醛溶液与该上清液混合，使甲醛的终浓度达到0.1％(V/V)，充分搅拌均匀即得，是针对水貂病毒性肠炎的特异性治疗制剂，抗体纯度高、效价高、性质稳定。
【专利说明】-种抗水紹病毒性肠炎精制蛋黄抗体及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其是一种抗水貂病毒性肠炎精制蛋黄抗体及其制备 方法。
【背景技术】
[0002] 水貂病毒性肠炎是由细小病毒（MEV)引起的，W剧烈腹泻为主要特征的急性、接 触性传染病，与猫泛白细胞减少症有亲缘关系。特别是幼龄水貂有较高的发病率和病死率， 该是世界公认的危害水貂饲养业较严重的病毒性传染病之一。
[000引在20世纪40年代末和50年代初，本病曾对加拿大、丹麦、芬兰、挪威和瑞典等一 些国家的养貂业造成巨大的威胁和损失。美国、苏联、英国都有此病流行。我国首发于1980 年，由于国内外引种，种貂串换检疫不严格或不检疫，造成本病传染扩大，先后在迂宁、黑龙 江、山东、江苏等省都曾发生过，且造成巨大经济损失，该病是危害水貂主要传染病之一。
[0004] 水貂病毒性肠炎常呈暴发性流行，根据国内外发病貂场的统计，幼貂发病率为 50%?60%，成年貂发病率为10%?30%，病死率为25%?30%，有的报道，幼貂病死率可 达 90%。
[0005] 目前主要用疫苗免疫来预防该疾病的发生。由于还没有针对病毒性疾病的特效药 物，因此临床治疗上主要采取对症治疗和抗生素类药物预防并发症的发生，其治疗效果不 理想。因此，在生产中急需一种针对水貂病毒性肠炎具有特异性、治疗效果好且疗效迅速的 治疗制剂。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种抗水貂病毒性肠炎精制蛋黄抗体。
[0007] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述抗水貂病毒性肠炎精制蛋黄抗体 的制备方法。
[000引为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0009] -种水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体，所述抗体是由下述方法得到的：
[0010] (1)分离高免鸡蛋蛋黄；将水貂病毒性肠炎病毒灭活苗免疫过的高免鸡蛋进行消 毒后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离；
[0011] (2)制备精制蛋黄抗体；向步骤（1)所分离的蛋黄中加入醋酸缓冲液进行稀释，其 中，蛋黄与醋酸缓冲液的体积比为1 ;2,用酸调PH至4.8 ;按每毫升稀释蛋黄液加11 uL辛 酸的比例在室温揽拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，低温下静置化，然后W l〇〇(K)r/min 的转速离也30min，弃沉淀；上清液经125 y m尼龙筛过滤后，加入1/10体积的0. Olmol/L的 PBS，用碱调PH至7. 2 ;将40 %甲酵溶液与该上清液混合，使甲酵的终浓度达到0. 1 % (V/ V)，充分揽拌均匀即得。
[0012] 优选的，上述水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体，所述抗体的抗体效价为HI:2^。
[0013] 上述水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体的制备方法，具体步骤如下：
[0014] (1)分离高免鸡蛋蛋黄：将水貂病毒性肠炎病毒灭活苗免疫过的高免鸡蛋进行消 毒后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离；
[0015] (2)制备精制蛋黄抗体；向步骤（1)所分离的蛋黄中加入醋酸缓冲液进行稀释，其 中，蛋黄与醋酸缓冲液的体积比为1 ;2,用酸调PH至4. 8 ;按每毫升稀释蛋黄液加11 y L辛 酸的比例在室温揽拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，低温下静置化，然后W l〇〇(K)r/min 的转速离也30min，弃沉淀；上清液经125 y m尼龙筛过滤后，加入1/10体积的0. Olmol/L的 PBS，用碱调PH至7. 2 ;将40%甲酵溶液与该上清液混合，使甲酵的终浓度达到0. 1 % (V/ V)，充分揽拌均匀；
[0016] (3)抗体效价的测定。
[0017] 优选的，上述抗水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体的制备方法，所述步骤（1)中 高免鸡蛋采用水貂病毒性肠炎病毒灭活苗免疫具体是指用猫肾传代细胞培养水貂病毒性 肠炎病毒，浓缩后作抗原，进行甲酵灭活，加入免疫增强剂及白油佐剂，制备油包水型水貂 病毒性肠炎病毒灭活苗，做为免疫用疫苗。
[0018] 优选的，上述抗水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体的制备方法，所述步骤（1)中 的消毒方法是对高免鸡蛋用清水冲洗干净，再用0. 05%的百毒杀浸泡3-5min，然后用纱布 擦干，再用75%己醇擦洗一遍，瞭干。
[0019] 优选的，上述水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体的制备方法，所述步骤（1)中的 高免鸡蛋是由下述方法得到的：
[0020] ( i )免疫；水貂病毒性肠炎病毒灭活苗免疫健康的高产蛋鸡；
[0021] ( ii )利用免疫高产蛋鸡得到高免鸡蛋。
[0022] 优选的，上述抗水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体的制备方法，所述步骤（i )中 用疫苗免疫高产蛋鸡的免疫次数> 2。
[0023] 优选的，上述抗水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体的制备方法，所述步骤（3)抗 体效价的测定是指将步骤（2)最终所得滤液进行水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体效价 测定，在96孔微量反应板上进行，每孔加25ul生理盐水；左侧第1孔加25ul蛋黄液，混合 均匀后从第1孔吸25ul至第2孔，依次倍比稀释至第11孔（第11孔吸弃25ul);每孔加 入25111四个血凝单位的病毒液，振荡3〇3，然后371：静置3〇111111;每孔加入2511110%猪红 细胞息液，震荡15s，4°C静置20min后观察结果。
[0024] 本发明的有益效果是：
[0025] 上述抗水貂病毒性肠炎精制蛋黄抗体，是一种针对水貂病毒性肠炎具有特异性、 治疗效果好且疗效迅速的治疗制剂，能针对水貂病毒性肠炎进行有效的防治；其制备方法 采用辛酸沉淀法提取抗水貂病毒性肠炎，该法安全、价格低廉，适于大规模生产，且制备的 蛋黄抗体纯度高、效价高、性质稳定、易于保存。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
[0027] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试 验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0028] 实施例1
[0029] -种水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体，是由下述方法制备得到的：
[0030] I制备水貂病毒性肠炎的高免鸡蛋
[0031] (1)选择健康高产未免疫产蛋鸡隔离饲养，加强饲料营养，同时加喂头抱喔巧轴W 预防细菌感染；
[0032] (2)免疫用疫苗的制备；用猫肾传代细胞（F81细胞）培养水貂病毒性肠炎病毒， 浓缩后作抗原（HA > 26)，加入终浓度0. 2%甲酵灭活36小时，与白油佐剂按体积比1:3比 例乳化，制备油包水型水貂病毒性肠炎病毒灭活苗，做为免疫用疫苗；
[0033] (3)免疫产蛋鸡，制备高免鸡蛋（用步骤I -(2)中的疫苗免疫步骤I -(1)处理 过的高产蛋鸡，进行H次免疫，首免皮下或肌肉注射l-2ml，2周后二免，注射免疫用疫苗 l-2ml，再隔2周H免，注射免疫用疫苗l-2ml，进行免疫程序后收集鸡蛋，即为水貂病毒性 肠炎的高免鸡蛋，二免后1周开始每隔7天抽样测定高免鸡蛋蛋黄中抗水貂病毒性肠炎病 毒特异抗体效价，抗体效价均达到HI > 2^ W上收集蛋黄，用于制备水貂病毒性肠炎病毒精 制蛋黄抗体）；
[0034] II利用步骤I制备的水貂病毒性肠炎的高免鸡蛋制备精制蛋黄抗体
[0035] (1)分离高免鸡蛋蛋黄
[0036] 将步骤I制备的高免鸡蛋用清水洗净，再用0. 05 %的百毒杀浸泡3-5min，然后用 纱布擦干，用75%己醇擦一遍瞭干，送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离；
[0037] 似巧[J备精制蛋黄抗体
[0038] 将步骤II -(1)所分离的蛋黄加2份醋酸缓冲液，用酸调PH至4. 8 ;按每毫升稀释 蛋黄液加11 y L辛酸的比例在室温揽拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，低温下静置化， 然后W 1000化/min的转速离也30min，弃沉淀；上清液经125]im尼龙筛过滤后，加入1/10 体积的0. Olmol/1的PBS，用碱调PH至7. 2 ;将40%甲酵溶液与该上清液混合，使甲酵的终 浓度达到0. 1 % (V/V)，充分揽拌均匀；
[0039] (3)抗体效价的测定
[0040] 将步骤II -(2)所得滤液最终所得滤液进行水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体效 价测定，在96孔微量反应板上进行，每孔加25ul生理盐水；左侧第1孔加25ul蛋黄液，混 合均匀后从第1孔吸25ul至第2孔，依次倍比稀释至第11孔（第11孔吸弃25ul);每孔 加入25111四个血凝单位的病毒液，振荡3〇3，然后371：静置3〇111111;每孔加入2511110%猪 红细胞息液，震荡15s，4°C静置20min后观察结果。
[00川应用实例
[0042] 本发明所述抗水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体对水貂病毒性肠炎疾病的临床 疗效试验
[004引 1、材料与方法
[0044] (1)试验材料
[0045] 利用实施例2中方法制备得到的水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体，抗体效价为 HI;2…。
[0046] 毒株水貂病毒性肠炎强毒分离株。
[0047] 实验动物健康仔貂30只。
[004引 似试验方法
[0049] 选择经血凝和血凝抑制试验检测为水貂病毒性肠炎病毒及抗体均为阴性的健康 仔貂30只，隔离饲养观察一周后，供试验用。
[0050] 将试验貂随机分成H组，第一组为空白对照组（10只），第二组为攻毒对照组（10 只），第H组为攻毒治疗组（10只）。第一组为空白对照组，不注射任何药品，隔离饲养；第 二组和第H组每只肌肉注射水貂病毒性肠炎强毒（HA:2 7)2ml。于攻毒后24小时给第H组 每只皮下注射2ml实施例1所述水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体（HI效价；2W)，第二组 皮下注射生理盐水2ml。观察貂的发病和死亡情况至第21天。
[0051] 2、试验结果与分析
[0052] 抗水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体对水貂病毒性肠炎疾病的临床疗效试验结 果，详见表1。
[0053] 表 1
[0054]
【权利要求】
1. 一种水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体，其特征在于：所述抗体是由下述方法得到 的： (1) 分离高免鸡蛋蛋黄：将水貂病毒性肠炎病毒灭活苗免疫过的高免鸡蛋进行消毒后 送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离； (2) 制备精制蛋黄抗体：向步骤（1)所分离的蛋黄中加入醋酸缓冲液进行稀释，其中， 蛋黄与醋酸缓冲液的体积比为1 :2,用酸调PH至4. 8 ;按每毫升稀释蛋黄液加11 y L辛酸的 比例在室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，低温下静置2h，然后以10000r/min的转 速离心30min，弃沉淀；上清液经125 y m尼龙筛过滤后，加入1/10体积的0. Olmol/L的PBS， 用碱调PH至7. 2 ;将40 %甲醛溶液与该上清液混合，使甲醛的终浓度达到0. 1 % (V/V)，充 分搅拌均匀即得。
2. 根据权利要求1所述的水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体，其特征在于：所述抗体 的抗体效价为HI:21(I。
3. 权利要求1所述的水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体的制备方法，其特征在于：具 体步骤如下： (1) 分离高免鸡蛋蛋黄：将水貂病毒性肠炎病毒灭活苗免疫过的高免鸡蛋进行消毒后 送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离； (2) 制备精制蛋黄抗体：向步骤（1)所分离的蛋黄中加入醋酸缓冲液进行稀释，其中， 蛋黄与醋酸缓冲液的体积比为1 :2,用酸调PH至4. 8 ;按每毫升稀释蛋黄液加11 y L辛酸的 比例在室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，低温下静置2h，然后以10000r/min的转 速离心30min，弃沉淀；上清液经125 y m尼龙筛过滤后，加入1/10体积的0. 01mol/L的PBS， 用碱调PH至7. 2 ;将40%甲醛溶液与该上清液混合，使甲醛的终浓度达到0. 1 % (V/V)，充 分搅拌均匀； (3) 抗体效价的测定。
4. 根据权利要求3所述的抗水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体的制备方法，其特征在 于：所述步骤（1)中高免鸡蛋采用水貂病毒性肠炎病毒灭活苗免疫具体是指用猫肾传代细 胞培养水貂病毒性肠炎病毒，浓缩后作抗原，进行甲醛灭活，加入免疫增强剂及白油佐剂， 制备油包水型水貂病毒性肠炎病毒灭活苗，做为免疫用疫苗。
5. 根据权利要求3所述的抗水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体的制备方法，其特征在 于：所述步骤（1)中的消毒方法是对高免鸡蛋用清水冲洗干净，再用0.05%的百毒杀浸泡 3-5min，然后用纱布擦干，再用75%乙醇擦洗一遍，晾干。
6. 根据权利要求3所述的抗水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体的制备方法，其特征在 于：所述步骤（1)中的高免鸡蛋是由下述方法得到的： (i )免疫；水貂病毒性肠炎病毒灭活苗免疫健康的高产蛋鸡； (ii )利用免疫高产蛋鸡得到高免鸡蛋。
7. 根据权利要求3所述的抗水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体的制备方法，其特征在 于：所述步骤（i )中用疫苗免疫高产蛋鸡的免疫次数> 2。
8. 根据权利要求3所述的抗水貂病毒性肠炎病毒精制蛋黄抗体的制备方法，其特征在 于：所述步骤（3)抗体效价的测定是指将步骤（2)最终所得滤液进行水貂病毒性肠炎病毒 精制蛋黄抗体效价测定，在96孔微量反应板上进行，每孔加25ul生理盐水；左侧第1孔加 25ul蛋黄液，混合均匀后从第1孔吸25ul至第2孔，依次倍比稀释至第11孔；每孔加入 25ul四个血凝单位的病毒液，振荡30s，然后37°C静置30min ;每孔加入25ul 10%猪红细 胞悬液，震荡15s，4°C静置20min后观察结果。
【文档编号】C07K16/08GK104447985SQ201410817715
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月24日 优先权日:2014年12月24日
【发明者】李丽琴, 王建, 张彦龙, 季昆, 王宇鹏, 殷立伟, 王嵩, 于昌贵, 程雪娇, 余贵菊, 焦晓军, 甄盼盼, 王猛, 王勇 申请人:天津市中升挑战生物科技有限公司