端羟基聚乙二醇化的人胰岛素及其类似物的偶联物的制作方法
【专利摘要】本发明属于胰岛素技术(C07K14/62)领域，涉及用端羟基聚乙二醇修饰人胰岛素或其类似物而形成的偶联物，其显著降低了免疫原性，具有更高的用药安全性。另外，本发明还涉及该偶联物的制备方法和涉及预防或治疗的应用等。
【专利说明】端超基聚乙二醇化的人膜岛轰及其类似物的偶联物
【技术领域】
[0001] 本发明属于膜岛素技术（C07K14/62)领域，更具体地，本发明涉及用端轻基聚己 二醇修饰人膜岛素或其类似物而形成的偶联物，其具有更高的用药安全性。另外，本发明还 涉及该偶联物的制备方法和应用等。
【背景技术】
[0002] 糖尿病值i油etes Melli化S，DM)是一种膜腺功能病变的代谢疾病，由遗传因素、 免疫功能奈乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等各种致病因子作用于机体， 导致膜岛功能减退、膜岛素抵抗，进而引发糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢奈 吉L临床上W高血糖为主要特点。其中，1型糖尿病属于膜岛素依赖型糖尿病，其病人必须 依赖外源性膜岛素进行替代治疗；2型糖尿病属非膜岛素依赖型糖尿病，病人由于产生膜 岛素抵抗或体内膜岛目细胞受损，引起膜岛素量的相对不足，随着病情的发展，通常最终 也需用膜岛素治疗。
[0003] 人膜岛素（Human insulin, Ins),其由A、B两条肤链组成，其中，A链含21个氨基 酸，其氨基酸序列为；Gly lie Val Glu Gin 切S 切S T虹 Ser lie 切S Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr切s Asn;B链含30个氨基酸，其氨基酸序列为；Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr化r Pro Lys化r。人膜岛素中共有H对二硫键，其中A链第6位半脫氨酸（A6(切s)) 与A链第11位半脫氨酸（A11 (切S))形成一对二硫键;A链第7位半脫氨酸（A7 (切S))与 B链第7位半脫氨酸炬7 (切S))形成一对二硫键；A链第20位半脫氨酸（A20 (切S))与B链 第19位半脫氨酸炬19 (切S))形成一对二硫键，后二者使A、B两链连接起来。
[0004] 目前已开发出了许多人膜岛素类似物，其中已批准临床使用或临床研究的主要包 括DesB30 (其氨基酸序列是在人膜岛素氨基酸序列的基础之上缺失了人膜岛素B链第30 位苏氨酸订虹)）、甘精膜岛素（Lantus，其氨基酸序列是在人膜岛素氨基序列的基础上将A 链第21位天冬醜胺（Asn)突变成甘氨酸佑ly)，同时在人膜岛素的B链氨基酸序列后添加 了两个精氨酸（Arg))、口冬膜岛素（Aspart，其氨基酸序列是在人膜岛素氨基酸序列的基 础之上将人膜岛素B链的第28位脯氨酸突变成天冬氨酸（Asp))、谷赖膜岛素佑lulisine， 其氨基酸序列是在人膜岛素氨基酸序列的基础之上将人膜岛素B链的第3位谷氨酸佑lu) 突变成赖氨酸（Lys)，同时把B链的第29位赖氨酸（Lys)突变谷氨酸佑lu))、赖脯膜岛素 (Lispro,其氨基酸序列是在人膜岛素氨基酸序列的基础之上将人膜岛素B链的第28位脯 氨酸（Pro)突变成赖氨酸（Lys),同时把B链的第29位赖氨酸突变成脯氨酸）W及地特膜 岛素（Levemir)、德谷膜岛素值egludec)等。
[0005] 聚己二醇（阳G)修饰可W延长蛋白在体内的半衰期，通常还被认为可W明显降 低免疫原性，从而提高用药安全性。聚己二醇化的膜岛素及其类似物的偶联物也有报 道，例如中国专利（申请）第 02815261、200410089050、200610118923、200710085552、 200780036662、200810011478、200810232828、200980122164、201110063821 号等所记载的。 由于单甲氧基聚己二醇（mPEG)的端部是甲氧基该样的非反应性基团，只能定向地依靠另 一端的偶联反应官能团（如含醋（基）、酵（基）氨基、駿基、甚至可W含轻基，等）与要修 饰的蛋白质偶联，提高了反应的专一性，所W目前聚己二醇修饰蛋白质（尤其是是膜岛素 及其类似物）的技术中基本上都选择使用mPEG。
[0006] 然而，越来越多的证据表明，聚己二醇本身也会引入新的免疫原性，也能诱发 机体的免疫反应，产生抗PEG的抗体，该样一方面会中和掉聚己二醇修饰的药物，降低 其疗效，更严重的是，还会带来潜在的用药安全性问题，诱发免疫变态反应，甚至导致病 人死亡。例如，大量报道表明，在病人使用化gl〇ticase(聚己二醇化的重组猪尿酸氧 化酶，商品名为拉Tstexxa?)后，有70?90%的病人体内检测到抗PEG的抗体，尤其是 其二H期临床试验过程中发生的死亡病例被认为与其免疫变态反应有关（Cortes, J.et al. , Control of plasma uric acid in adults at risk for tumor Lysis syndrome ： efficacy and safety of rasburicase alone and rasburicase followed by allopurinol compared with allopurinol alone-results of a multicenter phase III study. J Clin 0ncol，2010. 28(27) ;p. 4207-13 ;Sundy, J.S.et al. Reduction of plasma urate levels following treatment with multiple doses of Pegloticase(polyethylene glycol-conjugated uricase)in patients with treatment-failure gout ：results of a phase II randomized study. Arthritis Rheum,2008. 58(9) :p.2882-91 ;Krystexxa Prescribing Information ：http://www. krystexxa. com/pdfs/KRYSTEXXA Prescribing- Information)。
[0007] 本发明人研究也发现，现有技术选用的聚己二醇修饰人膜岛素及其类似物而获得 的偶联物也会产生抗PEG的抗体，由于膜岛素需要长期使用，在药品管理部口和公众对药 品安全性日益关注的趋势下，其用药安全性问题不容低估。经过本发明人长期而艰苦的研 究，在几乎要放弃聚己二醇修饰体系而改用其他免疫原性可能对人更低的修饰体系（如人 IgG或HSA等）的情况下，十分令人意外地发现了，尽管端轻基聚己二醇由于包含具有反应 性的轻基，干扰反应，增加副产物，使得现有技术中几乎都不选择使用，但是端轻基聚己二 醇化的人膜岛素及其类似物的偶联物能够显著降低免疫原性，大幅增加了用药安全性。另 夕F，该偶联物可W基本沿用原聚己二醇修饰药品的审批流程和规范，降低了开发药品的成 本。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是提供新的聚己二醇化的人膜岛素或其类似物的偶联 物。另外，本发明还提供了该偶联物的制备方法和应用等。
[0009] 具体而言，在第一方面，本发明提供了如式I所示的膜岛素或其类似物的偶联物 或其药学上可接受的盐，
[0010] {:出0-(邸2邸2〇) n] p-L} t-Y (式 u
[0011] 其中，
[0012] Y为膜岛素或其类似物；
[001引 L为连接基团；
[0014] n为50?1850的整数，优选为220?1370的整数，更优选为450?910的整数；
[00巧]p为1?5的整数，优选为1?3的整数，更优选为1?2的整数，最优选为1 ; [001引 t为1?12的整数，优选为1?5的整数，更优选为1?3的整数，最优选为1 ;
[0017] -为共价键。
[0018] 在本文中，结构式具有生物大分子领域技术人员所理解的意义，该不完全相同于 严格的化学式。其中，小括号（即"0")具有化学式意义上的含义，指的是小括号中的结构 线性顺序共价连接，重复n次。
[0019] 中括号（即"[]")指的是中括号中的结构平行共价连接于L(或L')上的不同位 点，连接于L(或L')上的该结构共有P个。当P > 1时，即为分支型的聚己二醇；当P = 1 时，即为直链型的聚己二醇。本发明优选后者。
[0020] 大括号（即"W")值的是大括号中的结构平行共价连接于Y上的不同位点，连接 于Y上的该结构共有t个。当t > 1时，即为多PEG修饰的膜岛素或其类似物；当t = 1时， 即为单PEG修饰的膜岛素或其类似物。本发明优选后者。
[0021] 在本发明的【具体实施方式】中，P为1且t为1，即单直链PEG修饰，相应地，本发明 的膜岛素或其类似物的结构为册-(邸2邸2〇)。斗-￥。另外，在本发明的【具体实施方式】中，式I 中的册-(邸2邸2〇)。-1部分的分子量为20邸或40邸。
[0022] 在本文中，"药学上可接受的盐"指适于与人或动物的组织接触而且无过多的毒 性、刺激或变态反应等的盐。药学上可接受的盐是本领域熟知的。该种盐可W在本发明偶 联物的最终分离和纯化的过程中制备，也可W将偶联物与适当的有机或无机酸或碱反应单 独制备。代表性酸加成盐包括但不限于己酸盐、二己酸盐、藻酸盐、巧樣酸盐、天冬氨酸盐、 苯甲酸盐、苯賴酸盐、硫酸氨盐、下酸盐、棒脑酸盐、棒脑賴酸盐、甘油磯酸盐、半硫酸盐、庚 酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氨漠酸盐、氨楓酸盐、2-轻基己賴酸盐、乳酸盐、马来酸盐、 甲賴酸盐、烟酸盐、2-蔡賴酸盐、草酸盐、3-苯基丙酸盐、丙酸盐、玻巧酸盐、酒石酸盐、磯酸 盐、谷氨酸盐、碳酸氨盐、对甲苯賴酸盐和十一焼酸盐。能用于形成药学上可接受盐的优选 的酸是盐酸、氨漠酸、硫酸、磯酸、草酸、马来酸、玻巧酸和巧樣酸。药学上可接受的碱加成盐 中的阳离子包括但不限于碱金属或碱±金属离子如裡、轴、钟、巧、镇和铅等，W及非毒性季 馈阳离子如馈、四甲基馈、四己基馈、甲基胺、二甲基胺、H甲基胺、H己基胺、二己基胺、己 基胺、二己胺、己醇胺、二己醇胺、脈巧、脈嗦等。优选的碱加成盐包括磯酸盐、化is和己酸 盐。本发明的偶联物可W单独使用，也可W W药学上可接受的盐形式使用。
[0023] 优选在本发明第一方面的偶联物或其药学上可接受的盐中，膜岛素是人膜岛素。 人膜岛素的氨基酸序列是本领域熟知的，其可W提取获得，也可W人工化学合成或者DNA 重组技术表达获得。人膜岛素在I960年代就能人工合成。
[0024] 也优选在本发明第一方面的偶联物或其药学上可接受的盐中，膜岛素类似物是 DesB30、甘精膜岛素（LanUis)、n冬膜岛素（Aspart)、地特膜岛素（Levemir)、谷赖膜岛素 佑lulisine)、德谷膜岛素值egludec)或赖脯膜岛素（Lispro)。该些膜岛素类似物已经被 批准临床使用或临床研究，都具备膜岛素的活性和功能，甚至优于人膜岛素本身的活性和 功能。
[00巧]在本文中，连接基团是偶联反应官能团经偶联反应的残基（即，残余部分）。（偶联 反应前的）偶联反应官能团和（偶联反应后的）连接基团均是在PEG修饰蛋白质的领域所 熟知的。通常，连接基团和/或偶联反应官能团较小，分子量小于300Da，优选小于200Da。 例如，在本发明的【具体实施方式】中，偶联反应官能团是玻巧醜亚胺基丙醋基团，相应地，连 接基团是玻巧醜亚胺基丙醋基团与氨基偶联后的残基。
[0026] 由于本发明的偶联物是用带有端轻基的PEG获得的，因此为了防止该轻基干扰偶 联反应，偶联反应官能团不含轻基。偶联反应官能团应当能同膜岛素或类似物上的活性基 团（如，氨基、駿基、琉基等）偶连，优选本发明的偶联反应官能团包含缩酵基、酵基、玻巧 醜亚胺基、马来醜亚胺基、己帰讽基、楓己醜胺基、醋基、碳酸醋基、駿基、氨基、氨氧基、硫醇 基、帰丙基、己帰基、己快基或畳氮基。
[0027] 由于经过偶联反应，本发明的连接基团不包含缩酵基、酵基、玻巧醜亚胺基、马来 醜亚胺基、己帰讽基、楓己醜胺基、醋基、碳酸醋基、駿基、氨基、氨氧基、硫醇基、帰丙基、己 帰基、己快基或叠氮基。
[0028] 优选在本发明第一方面的偶联物或其药学上可接受的盐中，偶联是定点偶联，该 样可W提高偶联物的均一性（或纯度）。例如，Y的偶联位点是e氨基和/或a氨基，优 选是B链的e氨基和/或a氨基。其中，e氨基是指赖氨酸侧链上的氨基，a氨基是指 膜岛素链N端的氨基酸的游离氨基。通过本发明第二方面的方法可W实现定点偶联。
[0029] 在第二方面，本发明提供了本发明第一方面的偶联物或其药学上可接受的盐的制 备方法，其包括用出〇-(邸2邸2〇)。]。-1/与Y偶联的过程，其中，
[0030] Y为膜岛素或其类似物；
[0031] L'为偶联反应官能团；
[0032] n为50?1850的整数，优选为220?1370的整数，更优选为450?910的整数；
[0033] P为1?5的整数，优选为1?3的整数，更优选为1?2的整数，最优选为1 ;
[0034] -为共价键。
[00对本发明第二方面的制备方法可W获得t个邮-畑2細20)。]。-1/与1个Y偶联的产 物，其中t为1?12的整数，优选为1?5的整数，更优选为1?3的整数，最优选为1。
[0036] 如无相反或矛盾的指示，本发明一部分提及的术语可W参照本发明其他部分的术 语定义或解释。例如，Y，即膜岛素或其类似物，可W参照本发明第一方面的Y及其优选的技 术特征。又如，L'，即偶联反应官能团，是在PEG修饰蛋白质的领域所熟知的，可W参考大量 涉及聚己二醇化的蛋白质的偶联物的文献，例如，【背景技术】部分列举的大量涉及聚己二醇 化的膜岛素及其类似物的偶联物的文献。
[0037] 优选本发明第二方面的制备方法包括
[00測 （1)在适合与￡氨基和/或a氨基偶联的条件下，用邮-畑2邸20)。]。-1/(优选 是册-畑2邸2〇)片'）与Y偶联；
[0039] (2)纯化（优选通过层析纯化，如通过凝胶过滤层析和/或离子交换层析纯化）获 得如式I所示的膜岛素或其类似物的偶联物或其药学上可接受的盐。
[0040] 优选其中，在适合与a氨基偶联的条件下用出〇-(邸2邸2〇)。]。-1/ (优选是 册-畑2邸2〇)n-L')与Y偶联是在抑5. 0?8. 0的溶液中邮-畑2邸2〇) Jp-L'(优选是 册-(邸2邸2〇)。-1/ )与Y W 1?4 : 1?4的摩尔比在4?37°C下混合反应。
[0041] 也优选其中，在适合与e氨基偶联的条件下用出〇-(邸2邸2〇)。]。-1/ (优选是 册-畑2邸2〇)片'）与Y偶联是在抑8. 0?11. 5的溶液中邮-畑2邸2〇) Jp-L'（优选是 册-(邸2邸2〇)。-1/ )与Y W 1?4 : 1?4的摩尔比在4?37°C下混合反应。
[0042] 反应可W通过加入酸酸化（优选酸化至抑2. 5?3. 5)终止反应，然后可W直接进 行纯化。在本发明的【具体实施方式】中，纯化是依次通过阳离子层析和阴离子交换层析进行 纯化。
[0043] 在第H方面，本发明提供了药物组合物，其包括本发明第一方面的偶联物或其药 学上可接受的盐，W及药学上可接受的载体。
[0044] 在本文中，"药学上可接受的载体"指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、佐 齐U、包裹材料或其他制剂辅料。根据本领域的公知技术，可W根据治疗目的、给药途径的需 要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位剂量形式，如片剂、膜剂、丸剂、胶囊 (包括持续释放或延迟释释设形式）、粉剂、颗粒剂、町剂、糖浆剂和乳液剂、注射剂或息浮 液、气雾剂或液体喷剂、滴剂、针剂或粉针剂、自动注射装置或栓剂。在本发明的具体实施方 式中，W注射剂形式注射给药，所W本发明第一方面的偶联物或其药学上可接受的盐可W 与注射用的无毒的药物学上可接受的惰性载体组合在一起，如等渗葡萄糖溶液、甘油、生理 盐水或其组合。该药物组合物中还可W添加蛋白质保护剂等辅料，如人血清白蛋白化SA)、 低分子量肤、氨基酸和/或金属阳离子等。
[0045] 本发明第H方面的药物组合物可用于治疗和/或预防膜岛素能治疗和/或预防的 疾病，优选用于长期治疗和/或预防膜岛素能治疗和/或预防的疾病，如，糖尿病，特别是1 型糖尿病和/或2型糖尿病。
[0046] 在第四方面，本发明提供了本发明第一方面的偶联物或其药学上可接受的盐在制 备低免疫原性的药物中的应用。
[0047] 本发明的药物或药物组合物可通过所属领域技术人员所熟知的给药方式来进行 给药，例如胃肠道外、口服、直肠、舌下、肺部、透皮、离子透入、阴道及鼻内给药，优选胃肠道 外给药，如皮下、肌内或静脉内注射。给药剂量根据制剂形式和期望的作用时间W及治疗对 象的情况而有所变化，实际治疗所需的量可W由医师根据实际情况（如，病人的病情、体重 等）而方便地确定。由于本发明的偶联物的优异的药代学和药效学性质，因此相对于膜岛 素或其类似物，其给药量大幅降低，给药频次也大幅降低。
[0048] 在本发明第四方面的应用中，所述药物用于治疗和/或预防膜岛素能治疗和/或 预防的疾病，优选用于长期治疗和/或预防膜岛素能治疗和/或预防的疾病，如，糖尿病，特 别是1型糖尿病和/或2型糖尿病。
[0049] 在第五方面，本发明提供了端轻基聚己二醇或出〇-(邸2邸2〇)。]。-1/ (优选是 册-(C&C&O)。-!/)在制备低免疫原性的膜岛素或其类似物的偶联物中的应用。其中，L'为 偶联反应官能团；n为50?1850的整数，优选为220?1370的整数，更优选为450?910 的整数；P为1?5的整数，优选为1?3的整数，更优选为1?2的整数，最优选为1 为 共价键。优选其中，膜岛素或其类似物的偶联物是本发明第一方面的偶联物或其药学上可 接受的盐。
[0050] 本发明的偶联物免疫原性低，该体现在两个方面，首先是该偶联物显著降低了聚 己二醇本身带来的免疫原性，甚至降低至长期（40天左右）使用无法检测出的水平；其次是 该偶联物也进一步降低到了膜岛素或其类似物本身的免疫原性。该样的低免疫原性对于药 用安全性（尤其是长期药用的安全性）是特别有益的。
[0051] 在本文中，为了清楚起见，低免疫原性可W被定义为相对于本发明第一方面的偶 联物中端轻基被替换为甲氧基后形成的偶联物的免疫原性降低，即，低免疫原性是相对于 式II所示的膜岛素或其类似物的偶联物或其药学上可接受的盐的免疫原性降低：
[0052] {[邸30-(邸2邸20) Jp-U t-Y (式 II)
[005引 其中，
[0054] Y为膜岛素或其类似物；
[005引 L为连接基团；
[0056] n为50?1850的整数，优选为220?1370的整数，更优选为450?910的整数；
[0057] P为1?5的整数，优选为1?3的整数，更优选为1?2的整数，最优选为1 ;
[0058] t为1?12的整数，优选为1?5的整数，更优选为1?3的整数，最优选为1 ; [00则-为共价键。
[0060] 本发明取得的有益甚至是预料不到的效果在于，采用端轻基聚己二醇修饰人膜岛 素或其类似物而获得端轻基聚己二醇化人膜岛素或其类似物的偶联物，在保持了药代学和 药效学的优异性质的基础上，该偶联物显著降低了聚己二醇本身带来的免疫原性，甚至降 低至长期（40天左右）使用无法检测出的水平，也进一步降低到了膜岛素或其类似物本身 的免疫原性，提高了药物长期使用的安全性。
[0061] 为了便于理解，W下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指 出的是，该些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论 述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用 了公开文献，该些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考， 就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
【具体实施方式】
[0062] 下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。如未特别指明之处，可参考 本领域技术人员所熟悉的《有机合成》、《分子克隆实验指南》、《细胞实验指南》、《免疫检测 技术》等书籍和SFDA的动物实验规范和指引W及所用的试剂和设备的使用说明。其中，女口 未特别指明，所用的试剂和设备均可通过商业渠道购买。
[006引实施例1定点偶联在e氨基上的册-PEG化的膜岛素及其类似物的偶联物的制备
[0064] 本实施例主要示例性地描述了用分子量为20KD的端轻基聚己二醇玻巧醜亚胺基 丙醋（册-PEG-SPA-20K)修饰去人膜岛素B链30位苏氨酸人膜岛素类似物值esB30)的B链 赖氨酸的e氨基的制备过程，用W获得相应偶联物（册-PEG-20K-DesB30)，其中册-PEG定 点偶联在B链赖氨酸的e氨基上。具体而言，取Ig DesB30,用20mM的测酸缓冲液（pHlO. 5) 配制成500ml溶液，加入6g册-PEG-SPA-20K，在300巧m的条件下室温（25°C )反应60min。 然后，加入2M盐酸至达到抑3. 0 W终止反应。反应终止后，将反应液直接上样于用平衡缓 冲液巧OmM己酸轴缓冲液，抑3. 5)平衡好的SP Se地arose FF柱。上样完毕后，先用6个 柱体积的该平衡缓冲液流过该柱，然后用50mM Tris-HCl缓冲液（P服.0)洗脱，收集洗脱 下来的经SDS-PAGE鉴定分子量为单阳G修饰的峰。向该洗脱峰加入己醇至己醇终浓度为 60% (V/V)，然后上样于用平衡缓冲液（60% (V/V)己醇，20mM Tris-HCl，p服.0)平衡好的 SOURCE 15Q柱，上样完毕后，先用该平衡缓冲液流过至流过液的紫外吸收基线稳定，然后用 洗脱液（60% (V/V)己醇，20mM Tris-肥1，0?0. 3M化Cl，p服.0) W化C1梯度浓度进行线 性洗脱，收集洗脱下来的最大的峰，即为册-PEG-20K-DesB30。经RP-HPLC检测，其纯度大于 95%;经肤图分析，其偶联位点在B链赖氨酸的e氨基上。
[0065] 基本参照W上制备过程，所不同的只是DesB30分别被替换为W下人膜岛素或其 类似物；Ins、Aspart、Lispro和Glulisine，分别获得册-PEG偶联在相应人膜岛素或其 类似物的B链赖氨酸e氨基的产物册-PEG-20K-Ins、册-PEG-20K-AP、册-PEG-20K-LP和 册-PEG-20K-GL。
[0066] 另外，用mPEG替代上述的册-PEG进行修饰，分别获得mPEG偶联在相应人膜岛素 或其类似物的B链赖氨酸e氨基的产物mPEG-20K-DesB30、mPEG-20K-Ins、mPEG-20K-AP、 mPEG-20K-LP 和 mPEG-20K-GL。
[0067] 实施例2定点偶联在a氨基上的册-PEG化的膜岛素及其类似物的偶联物的制备
[0068] 本实施例主要示例性地描述了用分子量为20KD的端轻基聚己二醇玻巧醜亚胺基 丙醋（册-PEG-SPA-20K)修饰去人膜岛素B链30位苏氨酸人膜岛素类似物值esB30)的B链 N末端a氨基的制备过程，用W获得相应偶联物（册-PEG-20K-DesB30-Bl)，其中册-PEG定 点偶联在B链N末端a氨基上。具体而言，取Ig DesB30,用20mM的磯酸缓冲液（pH7. 5) 配制成500ml溶液，加入6g册-PEG-SPA-20K，在300巧m的条件下室温（25°C )60min。然 后，加入2M盐酸至达到抑3. 0 W终止反应。反应终止后，将反应液直接上样于用平衡缓冲 液巧OmM己酸轴缓冲液，P册.5)平衡好的SP Se地arose FF柱。上样完毕后，先用6个柱体 积的该平衡缓冲液流过该柱，然后用50mM Tris-HCl缓冲液（P服.0)洗脱，收集洗脱下来的 经SDS-PAGE鉴定分子量为单PEG修饰的峰。向该洗脱峰加入己醇至己醇终浓度为60% (V/ V)，然后上样于用平衡缓冲液（60% (V/V)己醇，20mM Tris-HCl，P服.0)平衡好的SOURCE 15Q柱，上样完毕后，先用该平衡缓冲液流过至流过液的紫外吸收基线稳定，然后用洗脱液 (60% (V/V)己醇，20mM Tris-肥1，0?0. 3M NaCl，抑8. 0) W化C1梯度浓度进行线性洗 脱，收集洗脱下来的最大的峰，即为册-PEG-20K-DesB30-Bl。经RP-HPLC检测，其纯度大于 95% ;经肤图分析，其偶联位点在B链N末端a氨基上。
[0069] 基本参照W上制备过程，所不同的只是DesB30分别被替换为W下人膜岛素或其 类似物；Ins、Aspart、Lispro和Glul iSine，分别获得册-PEG偶联在相应人膜岛素或其类似 物的B链赖氨酸 e 氨基的产物册-PEG-20K-Ins-Bl、册-PEG-20K-AP-B1、册-PEG-20K-LP-B1 和册-PEG-20K-化-B1。
[0070] 实施例340邸的册-PEG化的膜岛素及其类似物的偶联物的制备
[0071] 本实施例主要示例性地描述了用分子量为40KD的端轻基聚己二醇玻巧醜亚胺基 丙醋（册-PEG-SPA-40K)修饰去人膜岛素B链30位苏氨酸人膜岛素类似物值esB30)的B链 赖氨酸的e氨基的制备过程，用W获得相应偶联物（册-PEG-40K-DesB30)，其中册-PEG定 点偶联在B链赖氨酸的e氨基上。具体而言，取Ig DesB30,用20mM的测酸缓冲液（pHlO. 5) 配制成500ml溶液，加入12g册-PEG-SPA-40K，在300巧m的条件下室温（25°C)反应60min。 然后，加入2M盐酸至达到抑3.0 W终止反应。反应终止后，将反应液直接上样于用平衡缓 冲液巧OmM己酸轴缓冲液，抑3. 5)平衡好的SP Se地arose FF柱。上样完毕后，先用6个 柱体积的该平衡缓冲液流过该柱，然后用50mM Tris-HCl缓冲液（P服.0)洗脱，收集洗脱 下来的经SDS-PAGE鉴定分子量为单阳G修饰的峰。向该洗脱峰加入己醇至己醇终浓度为 60% (V/V)，然后上样于用平衡缓冲液（60% (V/V)己醇，20mM Tris-HCl，p服.0)平衡好的 SOURCE 15Q柱，上样完毕后，先用该平衡缓冲液流过至流过液的紫外吸收基线稳定，然后用 洗脱液化0% (V/V)己醇，20mM Tris-肥1，0?0. 3M化Cl，p服.0) W化C1梯度浓度进行线 性洗脱，收集洗脱下来的最大的峰，即为册-PEG-40K-DesB30。经RP-HPLC检测，其纯度大于 95%;经肤图分析，其偶联位点在B链赖氨酸的e氨基上。
[0072] 基本参照W上制备过程，所不同的只是DesB30分别被替换为W下人膜岛素或其 类似物；Ins、Aspart、Lispro和Glulisine，分别获得册-PEG偶联在相应人膜岛素或其 类似物的B链赖氨酸e氨基的产物册-PEG-40K-Ins、册-PEG-40K-AP、册-PEG-40K-LP和 册-PEG-40K-GL。
[0073] 实施例4膜岛素及其类似物在册-PEG修饰前后的药代动力学研究
[0074] 72只健康比格炬eagle)犬，随机分成12组，每组6只，雌雄各半，共12组。每 组比格犬颈部或背皮下按0. 5IU/kg的剂量分别单次给药上述实施例制备或作为原料的 Aspart、H0-PEG-20K-AP、册-PEG-40K-AP ;Lispro、册-PEG-20K-LP、H0-PEG-40K-LP ;Ins、 册-PEG-20K-Ins、册-PEG-40K-Ins ;DesB30、册-PEG-20K-DesB30 和册-PEG-40K-DesB30。给 药前及给药后不同时段，分别对Beagle犬肘静脉采血，离也，取血清检测血液浓度。采用放 免法巧IA)测定不同时间的血液中膜岛素或其类似物的浓度，试验数据采用DAS 3. 2. 4药 动程序拟合分析并计算药代参数，结果如表1所示。
[00巧]表1膜岛素及其类似物在册-PEG修饰前后的药代动力学参数
[0076]
【权利要求】
1. 如式I所示的胰岛素或其类似物的偶联物或其药学上可接受的盐， {[H0-(CH2CH20)n]p-L} t-Y (式 I) 其中， Y为胰岛素或其类似物； L为连接基团； n为50?1850的整数，优选为220?1370的整数，更优选为450?910的整数； p为1?5的整数，优选为1?3的整数，更优选为1?2的整数，最优选为1 ; t为1?12的整数，优选为1?5的整数，更优选为1?3的整数，最优选为1 ; -为共价键。
2. 权利要求1所述的偶联物或其药学上可接受的盐，其中，胰岛素是人胰岛素；和 /或，胰岛素类似物是DesB30、甘精胰岛素（Lantus)、门冬胰岛素（Aspart)、地特胰岛素 (Levemir)、谷赖胰岛素（Glulisine)、德谷胰岛素（Degludec)或赖脯胰岛素（Lispro)。
3. 权利要求1所述的偶联物或其药学上可接受的盐，其中，连接基团是偶联反应官能 团经偶联反应的残基，其分子量小于300Da，优选小于200Da。
4. 权利要求3所述的偶联物或其药学上可接受的盐，其中，偶联反应官能团包含缩醛 基、醛基、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基、乙烯砜基、碘乙酰胺基、酯基、碳酸酯基、羧基、氨 基、氣氧基、硫醇基、稀丙基、乙稀基、乙块基或置氣基。
5. 权利要求1所述的偶联物或其药学上可接受的盐，其中，Y的偶联位点是e氨基和 /或a氨基，优选是B链的e氨基和/或a氨基。
6. 权利要求1?5之任一所述的偶联物或其药学上可接受的盐的制备方法，其包括用 [H0-(CH2CH20)n]p-L'与Y偶联的过程，其中， Y为胰岛素或其类似物； L'为偶联反应官能团； n为50?1850的整数，优选为220?1370的整数，更优选为450?910的整数； p为1?5的整数，优选为1?3的整数，更优选为1?2的整数，最优选为1 ; -为共价键。
7. 药物组合物，其包括权利要求1?5之任一所述的偶联物或其药学上可接受的盐，以 及药学上可接受的载体。
8. 权利要求1?5之任一所述的偶联物或其药学上可接受的盐在制备低免疫原性的药 物中的应用，所述药物用于治疗和/或预防（尤其是长期治疗和/或预防）胰岛素能治疗 和/或预防的疾病（如，糖尿病，特别是1型糖尿病和/或2型糖尿病）。
9. [H0-(CH2CH20)n] p-L'在制备低免疫原性的胰岛素或其类似物的偶联物中的应用。
10. 权利要求8或9所述的应用，其中低免疫原性是相对于式II所示的胰岛素或其类 似物的偶联物或其药学上可接受的盐的免疫原性降低： {[CH30-(CH2CH20)n]p-L} t-Y (式 11) 其中， Y为胰岛素或其类似物； L为连接基团； n为50?1850的整数，优选为220?1370的整数，更优选为450?910的整数； p为1?5的整数，优选为1?3的整数，更优选为1?2的整数，最优选为1 ; t为1?12的整数，优选为1?5的整数，更优选为1?3的整数，最优选为1 ; -为共价键。
【文档编号】C07K1/10GK104447981SQ201410817586
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月25日 优先权日:2014年12月25日
【发明者】陈勇, 罗华, 李红亮, 李祥, 蒋利敏 申请人:重庆浦诺维生物科技有限公司