制备一种人造生物移植体的方法

专利名称：制备一种人造生物移植体的方法
技术领域：
本发明涉及由一种用于移植的生物组织和加置其上的受体耐受细胞制备人造生物移植体的方法。
本发明一般性地涉及一种控制培养生物组织的方法。
在移植医学对于适宜的、尽可能低程度地引发对移植体受体有害反应的移植体存在着大量的需求。只在特别案例中可能的是，移植体从受体自己身体中取出并移植。从免疫学的角度，这种移植手术是最不需要顾虑的了，而对于特定的管腔或器官以及较大面积待替换的皮肤却不存在这种可能性。对于特定的器官，如今实际上考虑的只是异体捐献者的同种异体的移植体，或在矫形外科学领域更多的是用合成材料、金属、陶瓷等等以及不同的复合材料制备的植入体。在使用同种异体的材料时，例如捐献器官，持久的对受体生物体有负担的免疫抑制是不可缺少的。尽管如此排斥反应仍经常成为第一并发症。人造材料也可以导致排斥反应和炎症过程，致使手术结果失败。
出于不同的理由，如今经常尝试使用异种材料(动物性来源)。在此其优点主要是所述材料相对于同种异体(捐献)材料较易于获得。而且这样的一种“生物材料”比人造材料运用灵活并更合适于受体身体的某些部位。然而异种移植材料却是强抗原而因此成为问题。
因此人们长期试图将异种移植材料(特殊的不同的考虑用于移植的组织)处理成受体耐受性的。对此通常情况下尝试，灭绝或去除异种移植体的提供结构的结缔组织基质内或上面的天然细胞以及洗尽异体蛋白质和其它异体物质。由间质结缔组织组成的提供结构的基质可以看作是一种免疫更为中性的基质。
化学处理过的动物性来源的移植体，例如被用作人类心脏瓣膜的替换品。所述动物性的材料通常用戊二醛处理，为了稳固其结构蛋白和避免抗原反应。然而所述用戊二醛处理过的组织在移植后却经受持续的硬化和渐进的钙化。这种移植体因此必须每隔数年被替换。
作为替代的方式也已经尝试移植一种无细胞化的并以此“中性化了的”暴露的胶原基质，然而，如其所表现的，同样带有问题。无细胞化的胶原基质经无细胞化过程变得很疏松并且机械性能变得不稳定。不稳定化的重要缺点是在体内植入后有经破裂而开始失效的危险。动物模型的20％案例出现的是这种情况(无细胞化的猪心脏瓣膜，在低压循环下重繁殖自体细胞，肺的位置)。
另外，暴露的胶原基质在机体内很容易受到胶原蛋白酶的攻击，以至在体内重繁殖发生之前就可能已经被损坏了。
因此也尝试了将用于移植的无细胞化生物组织在其移植之前就已经再又繁殖了自体或同种异体细胞。例如在DE 19828726 A1中描述了一种制备人造生物移植体的方法，该方法首先灭绝然后去除移植体的间质结缔组织的天然细胞。所述基质随后重新繁殖对于受体耐受的，优选自体细胞，以便获得受体特异的生物移植体。
就此已经是很有利的了，抗原成分已很大程度地被去除或被包覆。以这种方法获得的人造生物移植体却还没有具备所必需的“自然”特性。在因无细胞化而松弛的基质上的生长细胞变得困难了。即使通过自身改变微小的基质结构也不能获得完全自然的重新的细胞构建。该方法也还存在着很大的问题，比如控制在各自必需的位置上所必需的不同分化细胞的生长。
US PS 5192312(Orton)已经公开了一种繁殖方法，其中用成胶原细胞生长因子处理可植入的人体心脏瓣膜，并随后繁殖设想使得植入体变成非免疫原的这样量的成胶原细胞。生长因子的准备措施妨碍了此目的，因为使用异种生长因子的初级掩蔽可能导致加入的细胞的功能性改变并且一种异种诱导转移可能使细胞成为增殖表现型。生长因子的异种加入引起信号交换的内部竞争机制，其最终虽然导致生成许多细胞，但通过生长因子却不能导入所必要的改造过程。鉴于其支撑结构，在体外由此已经妨碍了自体化的植入体的快速制备。在活体内有后作用是极可能的，因为可能产生转基因(变形)细胞。其在活体植入后具有更为重大的后果，因为同种异体和异种基质具有免疫原的残余作用，其导致炎症反应和形成钙化焦点并因此导致长期移植体的失效。
本发明因此以上述问题为基础，应该将，为移植受体挑选的用于移植的异体生物组织，特别是同种异体和异体的材料，转变成为受体耐受的免疫可接受的人造生物移植体。
续之应该创造一种方法制造机械性能稳定的自然的移植体。其重建过程应该在对自然重建的刺激和加速的同时尽可能地控制下进行。
为了解决此问题，根据本发明拟定在由一种用于移植的生物组织和加置其上的受体耐受细胞制备人造生物移植体的方法中，向在调节性培养基中的用于移植的自体、同种异体或异种的，以天然形式存在并且未用异种生长因子预处理过的组织加入受体耐受的细胞，其至少包括挑选出的有能力改造载体结构的细胞，移植体被继续处理，直至达到原来的天然组织进一步重建成为基本上表现为加入的受体特异的细胞的组织。
对于“有能力改造载体结构的细胞”是这样理解的，它们的贡献是，分泌新的组织基质并优选还去除死亡的细胞。属于此类分别根据组织类型而不同的细胞有，例如成胶原细胞或结缔组织细胞以及它们的来自于优选的自体干细胞的前体细胞。
在心血管方面属于有改造能力的细胞有例如平滑肌细胞。通常也算上例如巨噬细胞。
所述细胞促进和加速组织的重建，原则上它们首先由此使重建成为了可能，因为在其它情况下的其它进程(钙化、排斥)时间性地“超越”(“überholen”)并以这种方式妨碍组织再生或组织重建。
组织重建的激活也可以通过有目的的炎症刺激来达到，其刺激了组织治疗的进程。有改造能力的细胞因此也可以涉及或部分涉及能释放炎症介质的细胞。组织治疗伴随着加速的组织重建。而且炎症介质还可以在使用其它有改造能力的细胞时被附加地加入。这尤其是在有时间限制的情况下使用，以便引入一个可控制的刺激治疗的炎症过程。
算入干细胞的是骨髓细胞、来源于脂肪组织的(间充质的)细胞、组织特异的干细胞、来自外周血液的干细胞、器官特异的干细胞以及转移自体细胞核的细胞，例如机体自身的肌肉细胞核在成胶原细胞中(通过成功地转核分化(Transdifferenzierung))。
本发明以一种在体外控制组织再生的根本上新的构思为基础。与至今为止使用的方法不同的是，既不象现有技术那样通常去除也不必然人为地灭绝用于移植的组织的天然细胞。所述组织会更多地在一种适宜的装置中，可以是一个通常的繁殖反应器，经受一个人为的“损伤治疗”的过程，其间已经初步通过组织自身的介质，刺激作用在新生长的细胞上。
对于在天然状态下组织的理解是，组织的预备，即理解为从异种或同种异体的捐献体中摘离。存在于组织中的细胞，自预备或摘离后就处于一种濒死的状态，其按照本发明的原则并不在进一步的处理前通过特别的实施步骤予以去除。
通过加入受体耐受的、对于组织类型适宜的细胞，使最初的外源性移植体在处理过程中渐渐重建成为受体完全免疫耐受的人工生物移植体。
本发明的认识基础是，去除或还有积极地灭绝外源性同种异体或异种组织最初的天然细胞会加重再繁殖的难度，并且特别还因此，会失去在每个机体内由这些细胞产生的自然地促使自身不断细胞更新的刺激。尤其是会因此失去对最终所必需的基质重建以及有效的基质新合成重要的关键因素。
另外无细胞化产生极大的不稳定效果，而鉴于用于植入目的临床所必需的良好的初始稳定性能却是急切必需的。本发明解决了这些问题。
只要让外源性用于移植的繁殖有天然细胞的异种或同种异体的组织保持在它的天然状态下，在一种例如由营养物构成的调节性环境下的组织培养或组织保存，通过重建组织的细胞释放出有利于自然重建(内源性刺激)的细胞介质。所述介质以特定的方式分布在组织内部，只有极少的部分游离到调节性培养基中。在用于移植的仍由它的天然细胞构造的组织的培养期间，如果向调节性培养基分批或连续地加入新的受体耐受的细胞，这些细胞在重建过程中相继迁入并随着时间替换天然细胞，天然细胞在更换调节性培养基时逐渐被带离。其中根本的是，所述受体耐受细胞至少包括挑选出的有能力用于改造载体结构的细胞，例如，结缔组织细胞或成胶原细胞。此外可以存在其它的受体耐受的细胞。技术人员可以根据如上陈述和说明挑选出分别与重建的组织类型相应合适的使用细胞。
基本上同样已知的是，在天然的，还有没有无细胞化的，例如没有变性的同种异体的移植体表面可以繁殖内皮细胞。该过程也在移植手术后活体内自发进行，当体内内皮细胞在同种异体或异种移植体上落户时。这样的内皮细胞化并不会导致真正的移植组织重建以及“改造”。通过免疫程序相当快地在异体的(和保持异体的)组织上发生从个别的焦点(钙化焦点)扩展开来的钙化进程。所述移植的组织或器官就此随着时间渐渐地被损坏并最终功能衰竭。
动物试验表明，例如心脏瓣膜在24至48小时之间已经自发地内皮细胞化。组织并非因此重建了而是加厚了。内皮细胞生理学意义上停留在表面。如同L.Maxwell，J.B.Gavin，B.G.Barratt-Boyes，在《心瓣膜同种异体移植和异种移植在营养不良性钙化的影响范围及起始上的区别》(Differences between heart valve allografts and xenograftsin the incidence and initiation of dystrophic calcification)，病理学(1989，21，5-10)中的研究结果，存在的剩余捐献体细胞发展成为钙化巢，其最终使得瓣膜失效。
经移植的组织和器官的排斥和钙化可以通过根据本发明的方法得以避免，因为已经在移植之前就进行了体外改造，就此用于移植的组织被很大程度地重建了。
对此，在本方法中所使用的受体特异细胞包括有改造能力的细胞是必须的。属于此类的特别包括成胶原细胞，其通过环境刺激可以引发，分泌新基质和促进去除旧细胞。其它细胞类型可以附加地与成胶原细胞混合，在组织的不同层次或不同区域上应用。
优选将受体耐受细胞在培养起始时一次，即对移植体的处理，并多次间隔性地或连续性地加入到在培养基中。
在此受体耐受细胞可以滴加或涂抹在重建的天然组织上，或连续或分批地伴随调节性培养基加入。
加入给要重建的移植体的受体耐受或受体特异的细胞可以用特定的实施方案与一种特别是能包括血纤维蛋白，肌肉中的胶原粘蛋白或人工合成的粘蛋白的生物耐受的粘合剂混合，或者可以加入到培养基的悬浮物中。
移植体的处理可以在多次交换或连续流动的培养基的情形下进行，培养基可以是一种通常使用的。
重建过程优选借助机械性支持，其转移浸洗组织的培养基并且具有传送新的受体耐受细胞的液体流，其洗去在重建过程中的排斥/被替换细胞。使所述组织可以在这期间一次性地或间隔性地冲洗，借此产生一种机械刺激，有利于要被取代的细胞的脱除。
因此对于本发明重要的是，用受体耐受细胞在多次交换或连续流动的调节性培养基中持续处理移植体，直至很大程度上完成了在这样的组织上的对原本是天然组织的重建，使其基本上只具有用于繁殖使用的受体特异的细胞。
在调节性培养基中用受体耐受细胞处理天然组织，其中调节性培养基或是连续循环的或者是多次交换的，这是相应于在基质上本身已知的细胞繁殖方式，例如在现有技术中已知的并可以用不同的方式实施的。
作为调节性培养基可以使用惯用的细胞培养营养物，如需要可以在其中配以不同的附加物。在此适宜的营养物是技术人员所知道的。将受体特异的细胞以连续或多次分批加入到调节性培养基中。
对于受体特异细胞的理解是受体自体的或免疫相容及耐受的细胞。也可以在不同的繁殖以及处理时间阶段加入不同种类的细胞，以便可以在组织上生长由不同种类的细胞组成的不同的细胞层。另外可以向组织提供不同细胞的混合物。进而可以加置不同部位的细胞，例如在皮肤移植体的上侧和下侧，或者在管型脉管的外侧和内侧加置不同的细胞。
作为受体耐受的细胞，基本上所有的体细胞可以考虑在内，例如，根据所使用的底物，如下描述的也考虑在内结缔组织细胞(成胶原细胞、纤维细胞)、肌肉细胞(肌细胞)、内皮细胞、皮肤细胞(特别是角化细胞)，分化为器官细胞的细胞(心脏细胞、肾脏细胞等等)，优选的是带有胶原构架的有结构的器官，其一般所有可以合理用于重建特定的用于植入的组织的细胞。适宜的还有前体细胞，优选来源于受体的自体干细胞。属于干细胞的包括上面已经提到的。
重建的组织及移植体，其首先处于天然状态，如摘取的，并之后在本方法的过程中重建，可以基本上涉及每一种可移植的组织。特别计入其中的是一般的脉管、动脉、静脉、动脉瓣、心瓣膜、部分器官及整个器官、皮肤、肌腱、角膜、软骨、骨骼、喉、心脏、呼吸管、神经、半月板(Miniskus)、椎间盘、输尿管、尿道、膀胱、内耳小节骨、耳和鼻的软骨、关节软骨、结缔组织、脂肪组织、分泌组织、神经和肌肉以及其它等等。
对于在受体耐受细胞的帮助下组织的重建，分别挑选符合各自的组织类型的细胞或混合细胞。这些受体耐受的，优选自体或经基因修饰并因此成为受体特异的同种异体或异种细胞包括了除对本发明重要的成胶原细胞或结缔组织细胞外还有这样的细胞，其适于所希望的组织的建造，和可选择地还有那些可以刺激和/或控制组织重建的细胞，例如，产生细胞因子和/或具有趋化性影响的细胞，其中主要是来源于白细胞家族(淋巴细胞、血小板、巨噬细胞、柱状细胞、粒性白细胞)的细胞，例如所有形式的白血球、粒性白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、单细胞、骨髓细胞、脾细胞、记忆细胞、胸腺细胞、以及外周血或骨髓干细胞(来自血液和骨髓)或脂肪组织的干细胞，优选多能性的干细胞。
对于心脏瓣膜优选使用成胶原细胞或成肌纤维细胞、肌肉细胞和/或内皮细胞。对于皮肤移植体使用角化细胞，来源于中胚层的细胞(中胚层细胞)和如需要皮肤附属构造物。
本发明的一个重要方面在于，理想化的自体成胶原细胞通过在起始阶段尚存的在体外趋于坏死的供体细胞的信号作用可以由静止向活性表型突变。这对于受体特异或受体耐受细胞(其同样是从健康组织中获取的静止表型的细胞)的基因表达具有重要的结果。在体外诱导一个“疾病状态”和随后的“治疗状态”。在此可以加强并允许与理想化的受体自身或受体特异的辅助细胞的合作作用。所述用于组织重建的受体耐受细胞因此优选的还包括巨噬细胞，但也有血小板以及有免疫职能的细胞如淋巴细胞。
本发明的中心是，将处理继续，直至很大程度上，如果实际上还达不到完全重建，或者直至为在活体内的持续重建的继续进行开始铺平了道路。
本发明的一个重要的优点在于，可以较快地完成植入过程。在传统的方法中，异体细胞被首先去除，就此显著地削弱了基质的机械性能，随后再繁殖，其所需的时间至少要24至96小时。基质的稳定性能在再繁殖期间逐渐增加，却最后只能达到初始数值的70-80％(例如测量牵引负荷)。根据本发明的方法使组织的重建在约4天(3至6天)内成为可能，其机械稳定性在整个过程中几乎保持没有变化。因为组织已经相应于起始的生理稳定性和可负荷性，显著减少了在植入后第一时间内破裂的危险。重建在体内(在植入手术后)继续活体进行。
在用受体耐受细胞处理之前应该将用于移植的自体的、同种异体的或异种的，以天然形式提供的组织进行无菌化。这特别是在使用异种组织时要采用的，因为应该确保排除异种病毒和细菌伴随进入新制备的人工生物移植体中。即使对于同种异体的初始组织也应该确保排除其传播疾病的可能。只有重建用于其它使用目的自体组织有可能允许有例外。即便如此无菌化处理也是有意义的，只是不必那么繁琐。
对于在天然形式下的组织的理解是这样的组织，基本上使其处于被摘取时的状态。“天然”在这里意味着自然的、没有变化的、没有变性的。所述组织应该在进入用受体耐受细胞的处理阶段时，还带有其天然细胞，以便可以利用用于组织重建的内源性刺激。如上已经提及的这些细胞，因为预备过程和如需要运输所消耗的时间而一般已经处于开始坏死的状态。
无菌化处理应该尽可能温和地完成。出于达到无菌化的目的可以例如用灭菌溶液冲洗或用气体无菌化处理(气熏)。
目前通过等离子离子化的无菌化被看作是特别适宜的，其中气体排除是在H2O2的伴随下完成的。对此将一种过氧化氢水溶液注射到无菌室中并使之蒸发。在降低的环境压力下在一种射线能量的帮助下应用一种低温等离子。经此产生一个电场，其产生一种等离子。过氧化氢在等离子状态下被分裂产生自由基。自由基是用于灭菌的活性物种。这种方式不会遗留毒性残存物，因为在反应结束后自由基生成水、氧气和其它无毒性的产物。过氧化氢的应用也符合在许多细胞中存在的自然过程(例如巨噬细胞)。
如需要可以特别检验无菌化的效果，例如无菌化处理后测试特定的应该是严格禁止的病毒或细菌的存在。
用于移植的组织可以在预备后在可能需要的无菌化处理之前再经受一个不会导致变性的操作步骤，如冲洗。小心地冷冻天然移植体组织也是可以的，只要在此避免深程度的组织变化。
在本发明进一步构建的实施方案中，在使用受体耐受细胞期间或之后再向调节性培养基中加入细胞介质和/或因子或化学介质。特定因子的作用已经经过了研究，以便技术人员可以有目的地选择和使用细胞生长因子、细胞分化因子、化学趋化因子等。特别可以使用的有，神经肽其可以具有激活间叶细胞的能力。成胶原细胞可以影响繁殖和化学趋化性。在适宜的神经肽中特别值得一提的是神经激肽(神经激肽A(NKA))、物质P(SP)、血管活性的肠肽(Vasoactive Intestinal-peptide(VIP))、降血钙素基因相关的肽(calcitonin-gene-related peptide(CGRP))；作为其它主要的化学趋化和/或控制繁殖作用的介质/因子可以各自根据细胞和组织的类型使用纤连蛋白(Fn)，细胞因子，如白细胞介素-1β(IL-1 beta)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)，干扰素，如干扰素-γ(IFN-gamma)，粒性白细胞-巨噬细胞群体-刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulation factor(GM-CSF))，转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta 1(TGF-beta 1))，成骨蛋白-1(osteogenic protein-1(OP-1))，重组人类成骨蛋白-1(rhOP-1)，尿激酶类的纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogenactivator(u-PA))，PDGF(platelet-derived growth factor)，特别是PDGF AA、PDGF AB、PDGF BB、HGF(肝实质细胞生长因子(hepatocytegrowth factor))、VEGF(血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor))、FGF(成纤维细胞生长因子(fibroblast growthfactor))、ECGF(内皮细胞生长因子(endothelial cell growthfactor))，糖蛋白类，如α-2-巨球蛋白(alpha-2M)、克拉拉细胞蛋白(CC-16)、血小板因子4、β-血小板球蛋白、嗜中性白细胞活化肽-1，另外还有合成的介质，例如6-磷酸甘露糖、衔接蛋白(Adaptil)等。
所述每个介质、因子、辅助因子的具体作用对于分离细胞领域的技术人员是熟知的，从而在这里所描述的发明范围内可以挑选按照各自目的适宜的介质/因子。
在本发明进一步构建的实施方案中，将本方法如此进行下去，在调节性培养基和/或组织中加入有免疫职能的细胞，特别是巨噬细胞，其将细胞介质和/或因子释放至调节性培养基中。特别是，在此的调节性培养基可以由自体，即，受体自身的血液组成，其时间性地进行补充或时间性地通过血液替换。就此来自血液的巨噬细胞可以选择性地粘附在组织上。所述巨噬细胞从还没有或尚未完全重建的组织获得免疫刺激并由此释放出细胞特异的介质，其加快重建。血小板溶解并释放例如生长因子。组织重建被激活、被控制、被加速。
在本发明进一步构建的实施方案中，将本方法如此进行下去，从有免疫职能细胞的培养物，特别是巨噬细胞的培养物，将细胞介质和/或因子释放至调节性培养基上或转移至其中。这种培养物也可以含有淋巴细胞或血小板。进一步这里也可以加入干细胞。
适宜用于增强释放因子或介质的培养物的，例如有免疫职能细胞的培养物或巨噬细胞的培养物可以在一个生物反应器中制备，该生物反应器和预备及处理人工生物移植体的反应器以适宜的方式相连。从生物反应器中摄取的因子可以以适宜的量加入到通过连续或分批的方式加入的调节性培养基中。
通过适宜的生物反应器可以在此实施一种依靠压力和负载的改造，例如通过脉动灌注运转，例如用于脉管和心瓣膜，其对于重建组织的自然性有着很积极的作用。这改善了体外培养的人工生物组织符合于正常生理学的明显性。
一种可替换方式是，所述巨噬细胞培养物以及其它有免疫职能的细胞的培养物可以在用受体耐受细胞的处理过程中用对细胞介质和/或因子有透过性的薄膜、膜或隔离壁与调节性培养基保持隔离并且生成的介质和/或因子可以连续地释放到调节性培养基中。
对于用于移植的组织的处理通常在一个生物反应器中进行，其中在一特定空间中预先储放培养基并如需要循环培养基。在所述空间中可以用一种可通透的隔离壁构成一个用于有免疫职能的细胞或巨噬细胞的培养物的培养物空间，以便使所生成的细胞介质和/或因子可以持续地进入调节性培养基。一种可替换方式是，有免疫职能的细胞也可以分开地培养，细胞培养产物可以加入用于组织培养物的生物反应器中。另外所述产品(即，器官或通常指组织)还可以出于调节的目的并同或在添入受体特异的全血或个别血成分(蛋白、纤连蛋白、凝血酶、纤维蛋白原、血浆、血清、细胞组分)下泵流培养(perfundiert)以及协同培养。作为有免疫职能的细胞可以特别使用的是所有形式的白血球、粒性细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、单细胞、骨髓细胞、脾细胞、记忆细胞和胸腺细胞。
前述的两种可替换方式也可以组合应用，其中不仅有免疫职能的，以及免疫调节的细胞为了制备特定的介质/因子而在组织生物反应器内或外进行协同培养，还同时加入天然获取或人工合成的介质/因子至组织培养基中。
生产介质、因子、辅助因子并释放到调节性培养基中的有免疫职能的细胞的协同培养物，是特别有益的，因为用于各自目的特别适宜的介质/因子可以在必需的培养步骤中直接伴随生成，以便可以放弃额外的昂贵和稍弱特异性的因子的使用。
下面就一些实施例来描述本发明实施例1一种同种异体的低温冷藏的静脉分化转变成为自体的动脉低温冷藏的同种异体静脉在未经进一步处理的情形下无菌地置入一个生物反应器中，并且理想的是用无血清的或自体血清/血浆浓集的培养基泵流培养(perfundiert)。将预扩张了的自体的源于动脉的成胶原细胞和平滑肌细胞加置于先前低温冷藏的静脉外侧。在此这是通过在培养前滴加或涂抹和粘合剂混合的细胞，或者通过滴加或涂抹培养基中的细胞悬浮液，而加置到一种(自体的)血纤维蛋白胶、胶原质胶、合成的来自贝类粘蛋白来实现的。上皮细胞(用肌成胶原细胞预先繁殖所特许的)被加置到在脉管腔中。这是在缓慢旋转在生物反应器中的脉管得以实现的，其中生物反应器可以是各种适宜的装置。成胶原细胞被消亡细胞的细胞碎片激活合成新的基质、建造新的组织结构并增强其在组织/基质中的一体化。一个多层的肌细胞外套在几天内形成了。
所述动脉化了的(重建的)脉管就此没有稳定性的损失(如通常在无细胞化后达至＜20％的原有强度)，是很快就作好了移植准备的。
实施例2一种异种的低温冷藏的动脉的分化转变成为自体的人类动脉异种动脉在未经任何无细胞化处理的情况下用自体细胞脉管细胞按类似第一个实施例的方法，但是还没有内皮细胞下繁殖。使这种嫁接杂合的构造(重建的组织)用自体血液冲洗。在这个阶段巨噬细胞选择性地附着在暴露的基质上。淋巴细胞通过异种基质获取了免疫刺激。血小板溶解并释放如PDGF的生长因子。在大约4小时的作用时间后(足够用于巨噬细胞的附着)，自体血液再次用血浆浓集的培养基替换并随后培养几天(约3-10天)。在这个阶段通过用于繁殖而加入的(自体的)肌成胶原细胞促进了基质的转变。通过脉动负荷完成一种定向压力控制的新基质分子和纤维的沉积。同样使新合成的细胞带的定向一体化成为可能。
可替换的方式是，血小板(获取大约3000g)和白血球(1800g)的制备可以分开地在生物反应器中不同的部位或同步在一个分开的装置中协同培养。在后面的那种情况下，使如此获取的培养产物加入到本来的组织生物反应器中的组织培养物中。
权利要求
1.由一种用于移植的生物组织和加置其上的受体耐受细胞制备人工生物移植体的方法，其特征在于，-向用于移植的自体、同种异体或异种的，以天然形式存在的并且未用异种生长因子预处理的组织在调节性培养基中加入受体耐受的细胞，其至少包括挑选出的有改造载体结构能力的细胞，-继续移植体的处理直至达到天然组织进一步被重建成为基本上表现为加入的受体耐受细胞的组织。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，有改造载体结构能力的细胞是结缔组织细胞或其前体，特别是成胶原细胞或结缔组织的前体细胞，优选自体的干细胞。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，重建的组织是心脏组织并且有改造能力的细胞是平滑肌细胞。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于，有改造能力的细胞是巨噬细胞。
5.根据权利要求1至4任一项的方法，其特征在于，受体耐受细胞在培养起始时一次地，多次间断地或连续地加入到培养基中。
6.根据权利要求1至5任一项的方法，其特征在于，受体耐受细胞滴加或涂抹在用于重建的天然组织上，或连续或分批式地加入到调节性培养基中。
7.根据权利要求1至6任一项的方法，其特征在于，加入的受体耐受的细胞与生物耐受的粘合剂混合，其特别是可以包括血纤维蛋白、胶原蛋白或粘蛋白，或置入到培养基的悬浮液中。
8.根据权利要求1至7任一项的方法，其特征在于，移植体在培养物中的处理在多次交换的或连续流动的培养基下进行。
9.根据权利要求1至8任一项的方法，其特征在于，在用受体耐受细胞的处理期间向调节性培养基中加入细胞介质和/或因子或化学介质。
10.根据权利要求1至9任一项的方法，其特征在于，所述方法是这样实施的，在调节性培养基和/或组织中附加地加入特别有能力释放细胞介质和/或因子并可激活的细胞，特别是巨噬细胞。
11.根据权利要求10的方法，其特征在于，特别有能力释放细胞介质和/或因子并可激活的细胞，特别是巨噬细胞，预先保持在培养物中，优选在生物反应器中，特别优选在还处理移植体的同一生物反应器中。
12.根据权利要求11的方法，其特征在于，巨噬细胞或相应的细胞培养物在用受体耐受细胞繁殖或处理期间经对细胞介质和/或因子有通透性的膜、薄膜或隔离壁与调节性培养基分隔开并且所产生的介质和/或因子连续地释放到调节性培养基中。
13.根据权利要求1至12任一项的方法，其特征在于，使用于移植的自体、同种异体和异种的以天然形式存在的组织先进行无菌化处理，优选通过用灭菌溶液冲洗或通过气体熏。
14.根据权利要求13的方法，其特征在于，无菌化过程通过H2O2等离子离子化完成。
15.根据权利要求1至14任一项的方法，其特征在于，使用于移植的组织在其预备后，优选在无菌化之前或之后，再经历一个不会导致变性的操作步骤。
16.根据权利要求1至15任一项的方法，其特征在于，使用于移植的组织在其预备后，优选在无菌化之前或之后，附加冲洗一次或多次。
17.根据权利要求1至16任一项的方法，其特征在于，受体耐受细胞是移植受体的自体细胞。
18.根据权利要求1至16任一项的方法，其特征在于，使用于受体的受体耐受细胞是作为耐受挑选出来的同种异体或经过基因修饰的同种异体细胞。
全文摘要
由一种用于移植的生物组织和加置其上的受体耐受细胞制备人工生物移植体的方法，该方法是在体外进行受控的组织再生过程，其中挑选出的有能力用于改造载体结构的细胞加入到置于培养物中的天然组织，并且继续培养直至产生基本上重建了的、表现为加入的受体耐受细胞的新组织。
文档编号C12N5/08GK1440299SQ01812301
公开日2003年9月3日 申请日期2001年5月28日 优先权日2000年5月29日
发明者奥古斯蒂努斯·巴德 申请人:奥古斯蒂努斯·巴德