专利名称：用β-半乳糖苷酶制备蔗糖生物传感器核微孔酶膜的方法
技术领域：
本发明涉及生物传感器领域，更具体的说，是涉及"种蔗糖生物传感器 核微孔酶膜的制备方法。
背景技术：
蔗糖是一种非还原双糖，不能用常规测定还原糖的方法进行测定。目前， 为了满足快速、灵敏的检测需要，采用蔗糖生物传感器的检测方法。国外已
有蔗糖生物传感器研制成功的报道，但是需要3种以上的酶才能检测，误差
大，工艺复杂。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种只需要固定化两种 酶即可获得蔗糖生物传感器核微孔酶膜的方法。 本发明通过下述技术方案实现
一种用々-半乳糖苷酶制备蔗糖生物传感器核微孔酶膜的方法，其特征 在于，包括下述步骤
(1)称取--环糊精溶于由低浓度NaOH与戊二醛组成的混合溶液中， 之后，60。C加热处理直至晶体分散，并发生交联反应形成带有活性醛基的多 聚/ -环糊精；然后用蒸馏水洗涤上迷成带有活性醛基的多聚"-环糊精，直 至彻底除去多聚"-环糊精表面的NaOH,室温晾干后碾磨成基本上大小均匀 的颗粒；其中，低浓度氢氧化钠溶液中含有体积百分比为2.5-5°/。的戊二醛； 环糊精、低浓度NaOH与戊二醛组成的混合溶液的质量体积比为7:100;
(2 )将上述带有活性醛基的多聚々-环糊精颗粒作为固定材料与混合酶 溶液充分混合后，25匸下反应80分钟使酶固定化；将上述固定化的酶均匀涂 满两张核微孔膜表面，制成三明治结构的蔗糖生物传感器核微孔酶膜；其中， 所述混合酶溶液为由0. 003-0. 007g葡萄糖氧化酶、lmL活力单位为3000 unit/mL的(3-半乳糖香酶、0. Olg牛血清白蛋白混合而成，上述带有活性醛基的多聚/ -环糊精颗粒作为固定材料与混合酶溶液的质量体积比为10: 1。 带有活性醛基的多聚"-环糊精晾干后碾磨的颗粒直径为0. 8-1. 2mm。 本发明具有下述技术效果
本发明利用半乳糖苷酶通过戊二醛处理，控制反应时间即可以使得 "-半乳糖苷酶转化为特异性水解蔗糖酶的活性，同时利用戊二醛作为交联 剂，用多聚^-环糊精作为载体对其进行固定化，即可制成蔗糖生物传感器 核微孔酶膜，简化了生产工艺。用本发明的方法制备的蔗糖生物传感器核微 孔酶膜只需要固定化两种酶即可即可获得特异性、灵敏度和稳定性优于目'前 国际上需要固定化3种酶所制成的生物传感器酶膜。
具体实施例方式
以下结合具体实施例对本发明详细说明。
本发明中使用的^-半乳糖苷酶来自于酸克鲁维斯酵母(i7wj^e/Y 迈yc" 实施例1
制备混合酶溶液将0. 005g葡萄糖氧化酶、lmL活力单位为3000 unit/mL 的|3 -半乳糖苷酶、.0. Olg牛血清白蛋白充分混合，制成混合酶溶液。
称取0. 7g々-环糊精溶于10ml由浓度为0. 2Mol/L的NaOH与占低浓度 氢氧化钠溶液中的体积百分比为5%的戊二醛组成的混合溶液中，之后，60°C 加热处理直至晶体分散，并发生交联反应形成带有活性醛基的多聚々-环糊 精。然后用蒸馏水洗涤成带有活性醛基的多聚々-环糊精，直至彻底除去多聚 / -环糊精表面的NaOH，晾干后碾磨成直径为0. 8-1. 2mm的颗粒。
将上述0. lg带有活性醛基的多聚/ -环糊精颗粒作为固定材料与10pl 上述制备的混合酶溶液充分混合后，25。C下反应80分钟使酶固定化。将适量 上述固定化的酶均匀涂抹于两张核微孔膜表面，尽量涂满，制成三明治结构 的蔗糖生物传感器核微孔酶膜。
实施例2
制备混合酶溶液将0. Q07g葡萄糖氧化酶、lmL活力单位为3000 unit/mL 的P-半乳糖苷酶、0. Olg牛血清白蛋白充分混合，制成混合酶溶液。
称取0. 7g 〃 -环糊精溶于10ml由浓度为0. 2Mol/L的NaOH与占低浓度氢 氧化钠溶液中的体积百分比为2. 5°/。的戊二醛组成的混合溶液中，之后，60°C
4加热处理直至晶体分散，并发生交联反应形成带有活性醛基的多聚--环糊 精。然后用蒸馏水洗涤成带有活性醛基的多聚/ -环糊精，直至彻底除去多聚
/ -环糊精表面的NaOH，晾干后碾磨成直径为0. 8-1. 2mm左右的颗粒。
将上述0. lg带有活性醛基的多聚々-环糊精颗粒作为固定材料与10^1 上述制备的混合酶溶液充分混合后，25。C下反应80分钟使酶固定化。将上 述固定化的酶适量均匀涂抹于两张核微孔膜表面，尽量涂满，制成三明治结 构的蔗糖生物传感器核微孔酶膜。 实施例3
制备混合酶溶液将0. 003g葡萄糖氧化酶、lmL活力单位为3000 unit/mL 的P -半乳糖苷酶、0. Olg牛血清白蛋白充分混合，制成混合酶溶液。
称取O. 7g〃^不糊精溶于10ml由浓度为0. 2Mol/L的NaOH与占低浓度氲 氧化钠溶液中的体积百分比为3°/。的戊二醛组成的混合溶液中，之后，6(TC加 热处理直至晶体M,并发生交联反应形成带有活性醛基的多聚"-环糊精。 然后用蒸馏水洗涤成带有活性酪基的多聚/ -环糊精，直至彻底除去多聚"-环糊精表面的Na0H，晾干后碾磨成直径为0. 8-1. 2mm的颗粒。
将上述0. lg带有活性醛基的多聚々-环糊精颗粒作为固定材料与lOpl 上述制备的混合酶溶液充分混合后，25。C下反应80分钟使酶固定化。将上 述固定化的酶适量均匀涂抹于两张核微孔膜表面，尽量涂满，制成三明治结 构的蔗糖生物传感器核微孔酶膜。
通过本发明实施例1的方法所制成的酶膜用来测定蔗糖表明蔗糖浓度 在0%-3°/。 (g/100ml)范围内具有非常好的线性关系；测定的响应时间《30 秒钟；可以进行连续7天的测定，其测定结果保持稳定。
权利要求
1、一种用β-半乳糖苷酶制备蔗糖生物传感器核微孔酶膜的方法，其特征在于，包括下述步骤(1)称取β-环糊精溶于由低浓度NaOH与戊二醛组成的混合溶液中，之后，60℃加热处理直至晶体分散，并发生交联反应形成带有活性醛基的多聚β-环糊精；然后用蒸馏水洗涤上述成带有活性醛基的多聚β-环糊精，直至彻底除去多聚β-环糊精表面的NaOH，室温晾干后碾磨成基本上大小均匀的颗粒；其中，低浓度氢氧化钠溶液中含有体积百分比为2.5-5％的戊二醛；β-环糊精、低浓度NaOH与戊二醛组成的混合溶液的质量体积比为7∶100；(2)将上述带有活性醛基的多聚β-环糊精颗粒作为固定材料与混合酶溶液充分混合后，25℃下反应80分钟使酶固定化；将上述固定化的酶均匀涂满两张核微孔膜表面，制成三明治结构的蔗糖生物传感器核微孔酶膜；其中，所述混合酶溶液为由0.003-0.007g葡萄糖氧化酶、1mL活力单位为3000unit/mL的β-半乳糖苷酶、0.01g牛血清白蛋白混合而成，上述带有活性醛基的多聚β-环糊精颗粒作为固定材料与混合酶溶液的质量体积比为10∶1。
2、 根据权利要求1所述的用半乳糖苦酶制备蔗糖生物传感器核微 孔酶膜的方法，其特征在于，带有活性醛基的多聚y5-环糊精晾干后碾磨的 颗粒直径为0. 8-1. 2mm。
全文摘要
本发明公开了一种用β-半乳糖苷酶制备蔗糖生物传感器核微孔酶膜的方法，旨在提供一种只需要固定化两种酶即可获得蔗糖生物传感器核微孔酶膜的方法。包括下述步骤称取β-环糊精溶于由低浓度NaOH与戊二醛组成的混合溶液中，之后，60℃加热处理直至晶体分散，并发生交联反应形成带有活性醛基的多聚β-环糊精；然后用蒸馏水洗涤上述成带有活性醛基的多聚β-环糊精，直至彻底除去多聚β-环糊精表面的NaOH，室温晾干后碾磨成基本上大小均匀的颗粒；将带有活性醛基的多聚β-环糊精颗粒作为固定材料与混合酶溶液充分混合后，25℃下反应80分钟使酶固定化；将上述固定化的酶均匀涂满两张核微孔膜表面制成三明治结构的蔗糖生物传感器核微孔酶膜。
文档编号C12N11/12GK101463349SQ20091006762
公开日2009年6月24日 申请日期2009年1月6日 优先权日2009年1月6日
发明者吕瑜峰, 庞广昌, 李加鹏, 胡志和, 陈庆森 申请人:天津商业大学